Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

Pradeep K. Singh; Hanna E. Berk-Rauch; Nadine Soplop; Kunihiro Uryu; Sidney Strickland; Hyung Jin Ahn

doi:10.3791/58475

Articolo metodologico

Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

DOI:

10.3791/58475

⸱

30 novembre 2018

Pradeep K. Singh^*¹ , Hanna E. Berk-Rauch^*¹ , Nadine Soplop² , Kunihiro Uryu² , Sidney Strickland¹ , Hyung Jin Ahn¹

¹Patricia and John Rosenwald Laboratory of Neurobiology and Genetics, Rockefeller University, ²Electron Microscopy Resource Center, Rockefeller University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l'effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.

Abstract

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Questo articolo presenta metodi per la generazione in vitro coaguli di fibrina e analizzando l'effetto di proteina beta-amiloide (Aβ) sulla struttura e la formazione del coagulo mediante spettrometria e microscopia elettronica (SEM). Aβ, che forma aggregati amiloidi neurotossici nel morbo di Alzheimer (annuncio), ha dimostrato di interagire con il fibrinogeno. Questa interazione di Aβ-fibrinogeno rende il coagulo di fibrina strutturalmente anormale e resistente alla fibrinolisi. Indotta da Aβ anomalie nella coagulazione di fibrina possono anche contribuire a cerebrovascolari aspetti della patologia AD come microinfarti, infiammazione, come pure, Angiopatia amiloide cerebrale (CAA). Dato il ruolo potenzialmente critico dei deficit neurovascolari in patologia di annuncio, lo sviluppo di composti che possono inibire o ridurre l'interazione di Aβ-fibrinogeno ha valore terapeutico promettente. Metodi in vitro dai quali fibrina formazione del coagulo può essere facilmente e sistematicamente valutata sono strumenti potenzialmente utili per lo sviluppo di composti terapeutici. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la generazione in vitro di coagulo di fibrina, nonché l'analisi dell'effetto di inibitori di interazione di Aβ e Aβ-fibrinogeno. Il dosaggio di torbidità di coagulo è rapida, altamente riproducibile e può essere utilizzato per verificare più condizioni contemporaneamente, consentendo per lo screening di un gran numero di inibitori di Aβ-fibrinogeno. Hit composti da questo screening possono essere ulteriormente valutati per la loro capacità di migliorare le anomalie strutturali Aβ-indotta dell'architettura del coagulo di fibrina utilizzando SEM L'efficacia di questi protocolli ottimizzati è dimostrata qui utilizzando TDI-2760, un inibitore di interazione di Aβ-fibrinogeno recentemente identificato.

Introduzione

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Morbo di Alzheimer (annuncio), una malattia neurodegenerativa che porta al declino cognitivo nei pazienti anziani, prevalentemente nasce dall'espressione anormale di beta-amiloide (Aβ), aggregazione e alterata clearance conseguente neurotossicità¹^, ². nonostante l'associazione ben caratterizzato tra Aβ aggregati e AD³, i precisi meccanismi che sono alla base della patologia di malattia non sono ben compreso⁴. La prova aumentante suggerisce che i deficit neurovascolari svolgono un ruolo nella progressione e nella severità di annuncio⁵, come....

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Protocollo

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1. preparazione di Aβ42 e fibrinogeno per analisi

Preparare monomerico Aβ42 da polvere liofilizzata
1. Caldo Aβ42 polvere a temperatura ambiente e spin giù a 1.500 x g per 30 s.
2. Aggiungere 100 µ l di hexafluoroisopropanol ghiacciata (HFIP) per 0,5 mg di polvere di Aβ42 ed incubare per 30 min in ghiaccio.
  Attenzione: Prestare attenzione quando si maneggia HFIP ed eseguire tutti i passaggi in una cappa chimica.
3. Preparare 20 µ l aliquote e lasciare che l'aria di film secco in una cappa chimica per 2-3 h. film possa essere conservato a-20 ° C.
4. Ricostituire film monomerico Aβ42 in 10 µ l di fresco dimetilsolfossido (DMSO) ....

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Risultati

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In vitro test (torbidità) di coagulazione, la trombina enzima fende il fibrinogeno, causando la formazione della fibrina rete²⁴. Questa formazione del coagulo di fibrina provoca dispersione della luce che passa attraverso la soluzione, con conseguente maggiore torbidità (Figura 1), plateauing prima della fine del periodo di lettura (Figura 2, verde). Quando il fibrinogeno è stato incubato in prese.......

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Discussione

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I metodi descritti qui consentono di valutare la fibrina coagulo formazione in vitroin modo rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità del sistema rende l'interpretazione di come Aβ influenza la formazione del coagulo di fibrina e la struttura relativamente semplice. Nella pubblicazione precedente di questo laboratorio, è stato dimostrato che queste analisi possono essere utilizzate per testare composti per la loro capacità di inibire le Aβ-fibrinogeno interazione¹³^,

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Autori ringraziano Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso e Michael Foley da Tri-istituzionale Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York per la sintesi di inibitori di interazione di Aβ-fibrinogeno e loro preziosi suggerimenti. Autori ringraziano anche membri del lab Strickland per utile discussione. Questo lavoro è stato supportato da NIH grant NS104386, Drug Discovery Foundation il morbo di Alzheimer e fondo di sviluppo terapeutico Robertson per H.A., NIH concedere NS50537, il Tri-istituzionale Therapeutics Discovery Institute, Fondazione di Alzheimer Drug Discovery, Rudin Family Foundation e John A. Herrmann per S.S.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fibriogeno, impoverito di plasminogeno, EMD al plasma		341578	mantenere il parafilm del coperchio avvolto per evitare l'esposizione all'umidità
Beta-amiloide (1-42),	Anaspec	AS-20276
Trombina dal plasma umano	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo, maggiore o uguale al 99%	Sigma-Aldrich	105228
DIMETILSOLFOSSIDO (DMSO), Kit	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA con	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl₂	Fischer Scientific	C70
, 0,2µ M, 25mm	Pall	4612
Millex filtri sterili per siringa, 0,1 um, PVDF, 33 mm	Millipore	SLVV033RS
Piastre solide a 96 pozzetti a fondo piatto certificato ad alto legame	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
Centrifuga, 5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200 Pulitore ad ultrasuoni	Fischer Scientific	15-337-22
Rotatore da laboratorio	Thermo Scientific	2314-1CEQ
Rondelle di ricambio per supporto vetrino coprioggetto	Tousimis	8766-01
Pipette a stelo stretto - Sedi-Pet	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	70967-13
Supporto per campioni per CPD (supporto del vetrino coprioggetti)	Tousimis	8766
Scatola porta montatura, tipo pin	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	76610
Vetrini rotondi con coperchio in vetro (12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldeide	Microscopia Elettronica Scienze (EMS)	16120
Etanolo	Decon Labs	11652
Piastra a 24 pozzetti	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
Stub SEM, estremità conica spilla.	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	75192
Linguette PELCO, linguette conduttive in carbonio, diametro esterno 12 mm	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 Essiccatore per punti critici	Tousimis
Denton Desk IV Coater con bersaglio in oro/palladio	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM Software	Carl Zeiss

umano per il dosaggio delle proteine filtro sterile Siringa filtrante

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid cleara....

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Interazione tra beta amiloide e fibrinogeno saggio di torbidit analisi della formazione del coagulo proteina A beta 42 saggio fibrinogeno trombina protocollo di imaging SEM essiccamento al punto critico deposizione di oro palladio tramite sputtering

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