Articolo metodologico

Visualizzazione in tempo reale e analisi di condrociti lesioni dovute a carichi meccanici in espianti di cartilagine murina completamente intatta

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DOI:

10.3791/58487

⸱

7 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni murini intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come osteoartrite, fattori genetici e/o i regimi differenti di carico influenzano la vulnerabilità dei condrociti in situ .

Abstract

Omeostasi della cartilagine articolare dipende la vitalità delle cellule residenti (condrociti). Purtroppo, il trauma meccanico può indurre morte del chondrocyte diffusa, che portano potenzialmente al guasto irreversibile del giunto e l'insorgenza dell'osteoartrite. Inoltre, mantenimento della vitalità dei condrociti è importante nelle procedure di innesto osteocondrali per ottimale risultati chirurgici. Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato in studi comparativi per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche, nonché diversi stadi di degenerazione della cartilagine sul breve - e/o a lungo termine vulnerabilità dei chondrocytes articolari in situ. L'obiettivo del protocollo introdotto nel manoscritto è quello di valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine. Soprattutto, questo metodo consente test su cartilagine completamente intatta, senza compromettere le condizioni al contorno native. Inoltre, consente la visualizzazione in tempo reale dei chondrocytes articolari vitale macchiato e singola analisi basata su immagini di lesione delle cellule indotta dall'applicazione di statica controllata e i regimi di carichi d'urto. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che in espianti di cartilagine sana, l'estensione spaziale della lesione delle cellule dipende sensibilmente intensità di carico di ampiezza e impatto. Il nostro metodo può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche diverse vulnerabilità della meccanica di in situ chondrocytes articolari.

Introduzione

Cartilagine articolare (AC) è un tessuto che copre e protegge le ossa nelle articolazioni sinoviali, fornire liscia articolazioni portanti. Omeostasi del tessuto sono dipendente la vitalità dei condrociti, il tipo di suola delle cellule che risiedono in AC. Tuttavia, l'esposizione della cartilagine a forze estreme dovuto il trauma (ad esempio, cadute, lesioni incidente o sport veicolo) o a causa di instabilità articolare post-traumatica può indurre la morte del chondrocyte, che conduce alla rottura irreversibile dell'articolazione (artrosi) 1. Inoltre, in osteochondral procedure che mirano a riparare difetti localizzati in cartilagine danneggiata di innesto, trauma meccanico inserimento-collegata di innesto riduce la vitalità dei condrociti e ha effetti nocivi sui risultati chirurgici2.

Cartilagine explant modelli sono comunemente usati per studiare la suscettibilità dei chondrocytes articolari alla morte delle cellule indotta meccanicamente. Questi modelli utilizzano in genere espianti di grandi animali per studiare gli effetti di caricamento delle condizioni, condizioni ambientali e altri fattori sulla cella vulnerabilità3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Tuttavia, a causa delle grandi dimensioni delle articolazioni native, questi modelli generalmente richiedono la rimozione di una spina dalla superficie articolare di un giunto intatto, quindi compromettere native condizioni al contorno. Inoltre, che in genere richiedono l'applicazione di grandi carichi meccanici per indurre la lesione delle cellule. In alternativa, cartilagine murina explant modelli offrono diversi vantaggi rispetto ai modelli più grandi animali nello studiare la vulnerabilità meccanica dei condrociti in situ . In particolare, per le loro dimensioni più piccole, questi modelli facilitano l'ispezione della cartilagine articolare completamente intatta senza alterare l'integrità del tessuto nativo. Inoltre, caricamento della cartilagine murina si verifica sopra piccole aree di contatto che condrociti morte/lesione può essere indotta con piccoli carichi (< 1 N). Infine, il genoma di topo è facilmente gestibili, prove di impatto come specifico geni la suscettibilità dei condrociti in situ al danno meccanico.

L'obiettivo generale del metodo introdotto in questo manoscritto è quello di quantificare e visualizzare in real-time-il limite spaziale di in situ delle cellule morte/lesioni a causa di carichi meccanici applicati su cartilagine-su--osso del mouse completamente intatto in vitrodi espianti. Questo metodo richiede la dissezione attenta delle articolazioni sinoviali del mouse senza compromettere la vitalità dei condrociti, seguita da prove meccaniche di espianti vitale macchiati utilizzando un microscopio-montato dispositivo simile a una piattaforma di prova che abbiamo recentemente sviluppato per quantificare la cartilagine murina proprietà meccaniche16. Durante le prove meccaniche, una grande porzione della superficie articolare (intatta) dell'osso sezionato è visibile su una microfotografia di fluorescenza singolo, l'attivazione rapida analisi di attuabilità delle cellule dopo è applicato un carico. Una simile analisi di attuabilità delle cellule superficiali in espianti di cartilagine murino è stata eseguita in precedenza, ma senza applicazione simultanea di carico17. Possibili applicazioni del nostro metodo comprendono studi comparativi per studiare la vulnerabilità dei chondrocytes articolari a diverse condizioni ambientali e meccaniche controllate, così come la selezione di trattamenti volti a ridurre la sensibilità dei condrociti a carico meccanico.

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Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di Università di Rochester sulle risorse animali.

1. soluzioni

  1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (1 X HBSS) contenenti calcio, magnesio e nessun rosso di fenolo. Aggiustare il pH a 7.4 con l'aggiunta di piccole quantità di HCl o NaOH.
  2. Regolare l'osmolarità a 303 mOsm aggiungendo NaCl o acqua deionizzata. Utilizzare il buffer durante le dissezioni, preparazione dei campioni e le prove meccaniche.

2. le dissezioni del femore distale e prossimale dell'omero con cartilagine articolare completamente intatta

  1. Eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali utilizzando una camera di inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale. Seguire asettiche.
    Nota: Possono essere utilizzati topi tra 8 e 81 settimane vecchie di qualsiasi ceppo e sesso.
  2. Utilizzare i seguenti strumenti chirurgici per dissezioni: micro-forbici (usate per la fabbricazione di incisioni), forbici per dissezione standard (utilizzate per il taglio dell'osso), bisturi con #11 lama per bisturi (usata per i tessuti molli di taglio), forcipe del gioielliere (utilizzato per la rimozione di soft tessuto) e pinze standard (utilizzate per il peeling la pelle e i tessuti molli).
  3. Per le dissezioni del femore distale è necessario seguire le istruzioni qui sotto.
    1. Posizionare il mouse in posizione supina.
    2. Fare una piccolo (~ 5 mm) incisione della pelle sulla parte anteriore del ginocchio.
    3. Estendere l'incisione tutto il senso intorno al ginocchio e tirare indietro la pelle per esporre i muscoli della gamba e del giunto di ginocchio.
    4. A partire dall'estremità prossimale del femore, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità muscolo-tendine del quadricipite e il lato anteriore del pozzo femorale. Estendere il taglio verso e passato la rotula e finitura di taglio attraverso il centro del tendine patellar, eliminando così l'unità muscolo-tendine del quadricipite.
    5. A partire dall'estremità prossimale del femore, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità del tendine del ginocchio muscolo-tendinee e la parte posteriore del pozzo femorale. Una volta che il taglio si avvicina l'articolazione del ginocchio, iniziare a tagliare attraverso i tessuti molli, evitando il contatto tra il bisturi e la superficie articolare sui condili distali del femore. Finire il taglio passato l'articolazione del ginocchio.
    6. Tirare indietro il quadricipite e muscoli adduttori per esporre il femore. Tagliare qualsiasi muscolo in eccesso sui lati mediali e laterali del femore.
    7. Tagliare il muscolo del polpaccio sul lato posteriore della tibia prossimale e capovolgere la gamba per visualizzare la parte posteriore del femore.
    8. Esporre i condili distali del femore e la superficie posteriore della tibia prossimale rimuovendo il tessuto in eccesso intorno al giunto di ginocchio.
    9. Tagliare i legamenti crociati anteriori e posteriori usando un bisturi, taglio lontano i condili femorali. Tirare la tibia dal femore e tagliare i legamenti per separare la parte inferiore della gamba dal femore.
    10. Utilizzando le forbici per dissezione standard, tagliare attraverso il femore all'estremità prossimale dell'osso (8 mm sopra l'articolazione tibio-femorale) dal lato laterale . Dopo aver tagliato l'osso, spazzare via qualsiasi midollo visibile sulla parte esterna dell'osso per evitare possibili contaminazioni da cellule del midollo osseo.
      Nota: Il taglio dal lato laterale riduce il rischio di propagazione di crepa lungo l'osso.
    11. Rimuovere circondare i tessuti molli (cioè, legamenti e muscoli in eccesso) dal femore usando il forcipe del gioielliere ed esporre la cartilagine su entrambi condili all'estremità distale del femore. Evitare il contatto tra la cartilagine e il forcipe.
  4. Per le dissezioni dell'omero è necessario seguire le istruzioni qui sotto.
    1. Posizionare il mouse in posizione supina.
    2. Fare un'incisione (~ 5 mm) in pelle sul lato posteriore del gomito utilizzando micro-forbici, estendere l'incisione intorno al gomito e tirare indietro la pelle per esporre i muscoli del braccio e della spalla.
    3. A partire dall'estremità prossimale dell'omero, utilizzare un bisturi (#11) per tagliare lungo la direzione distale. Posizionare la lama tra l'unità muscolo-tendine del triceps e del lato posteriore dell'omero. Estendere il taglio verso l'estremità distale dell'omero e finitura di taglio attraverso il tendine del tricipite.
    4. Quindi tirare indietro il tricipite verso l'estremità prossimale dell'omero fino a quando la testa omerale è esposta.
    5. Tagliare il tessuto connettivo intorno alla testa omerale usando un bisturi (#11) senza toccare la superficie articolare e togliere l'arto (braccio e spalla) dal corpo. Periodicamente idratare la superficie articolare della testa humeral con HBSS.
    6. Staccare il braccio Omero rompendo prima l'estremità prossimale dell'ulna sul lato posteriore del braccio usando il forcipe e poi tagliare il tessuto connettivo intorno all'estremità distale dell'omero. Rimuovere tutto il tessuto in eccesso su Omero.
    7. Tagliare la tuberosità deltoidea sul lato posteriore dell'omero con le forbici per dissezione standard.
  5. Inserire i campioni sezionati in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente tampone HBSS.

3. dal vivo (calceina) / Dead (ioduro di propidio) protocollo di colorazione

  1. Macchia con calceina come segue.
    1. Fai una soluzione stock di calceina aggiungendo 12,5 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) in un flaconcino di 50 µ g di calceina, con una concentrazione stock di 4 mg/mL (4,02 mM).
    2. Diluire la soluzione di calceina stock 1: 400 in HBSS per raggiungere una concentrazione di 10 µ g/mL (10.05 µM) di calcio AM (ad esempio, aggiungere 1.25 µ l di soluzione madre a 500 µ l di HBSS).
    3. Centrifugare la soluzione colorante diluita per 5 s a 2.000 x g per garantire che tutti della tintura, che occasionalmente può attaccare alle pareti del tubo, si mescola con il buffer. Non rimuovere il surnatante. La soluzione per garantire la corretta miscelazione di vortice.
    4. Mettere il campione dissecato in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 µ l di soluzione colorante diluita. Incubare il campione a 37 ° C per 30 min in un thermomixer mentre agitando a 800 giri/min. Assicurarsi che i tubi sono rivestiti in carta stagnola per proteggere dall'esposizione alla luce.
    5. Trasferire il campione nel buffer di calceina HBSS AM-libero. A questo punto, il campione è pronto per le prove meccaniche.
  2. Preparate propidio ioduro (PI) macchiando soluzione come segue.
    1. Preparare la soluzione di colorazione diluendo la soluzione di riserva acquistati (1 mg/mL, 1,5 mM) 01:25 in HBSS raggiungere 40 µ g/mL (60 µM) di PI PI. Ad esempio, aggiungere 40 µ l di soluzione madre a 1000 µ l di HBSS.
    2. Tenere il PI macchiatura soluzione rivestito in lamina di alluminio per proteggerlo dall'esposizione alla luce. Utilizzare la soluzione colorante immediata dopo il test meccanico per rilevare cellule lese (Vedi sezione 4).
      Nota: Si può eseguire la colorazione PI prima del carico nonché per valutare più rigorosamente la qualità delle dissezioni.

4. meccanica protocollo di prova

  1. Disporre del campione (femore o Omero) su vetrino un dispositivo test meccanico montato microscopio personalizzati in modo tale che la superficie articolare sul posteriore dei condili femorali o testa humeral è seduto sul vetro (Figura 1).
    Nota: Fissare un applicatore di legno lunghezza mm 10 (diametro = 2 mm) per lato distale dell' Omero usando la colla del cianoacrilato prima di posizionarlo sul dispositivo al fine di stabilizzare il campione su una superficie piatta. Per una descrizione dettagliata della piattaforma di test meccanica vedere complementare File 1: sezione 1.
  2. Idratare il provino con HBSS e posizionare il dispositivo con il campione su un microscopio a fluorescenza.
  3. Immagine i chondrocytes articolari macchiato con calceina (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 495/515 nm) prima applicazione (baseline) del carico sotto un microscopio a fluorescenza con un 4 X asciugare la lente (NA = 0.13). Regolare le impostazioni di acquisizione per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  4. Applicare il carico meccanico in cima l'esemplare tale che la cartilagine articolare è compresso contro il vetro di copertura.
    1. Per il carico statico, applicare un carico statico prescritto (ad esempio, 0,5 N) in cima l'esemplare (femore o Omero). Tenere il carico per 5 min e poi rimuoverlo.
    2. Per impatto, applicare un'energia di impatto prescritto (ad es., 1 mJ) sul campione facendo cadere un dispositivo d'urto cilindrica di peso noto (ad es., 0,1 N) da un'altezza prescritta (ad es., 1 cm). Rilasciare il carico 5 s dopo l'impatto.
      Nota: Il peso del dispositivo d'urto (mg) e l'altezza prescritta (h) può essere convertito in energia di impatto (E) usando la seguente equazione: E = mgh.
  5. Incubare il campione in PI macchiatura soluzione per 5 min a temperatura ambiente.
  6. Immagine i chondrocytes articolari macchiato con calceina e PI (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 535/617 nm) con un microscopio a fluorescenza (Figura 2).

5. analisi dei dati

  1. Quantificare l'area di celle feriti/morti a causa del regime di carico meccanico applicato.
    1. Aprire le micrografie della superficie articolare acquisite prima e dopo l'applicazione del carico meccanico in ImageJ18.
    2. Combinare le immagini in uno stack.
    3. Impostare la scala delle immagini basato sulla risoluzione dell'immagine.
    4. Utilizzare lo strumento poligono per definire l'area dove le cellule sono diventato calceina-negativo (perdita di fluorescenza verde) e PI-positivo (guadagno di fluorescenza rossa). Queste cellule sono considerate essere ferito o morto.
    5. Determinare l'area di celle feriti/morti utilizzando lo strumento di misura .

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Risultati

Sei diversi applicati protocolli di carico (carico statico: 0,1 N, 0,5 N e 1 N per 5 min; e carico di impatto: 1 mJ, mJ 2 e 4 mJ) riproducibile indotto quantificabili aree localizzate di lesione delle cellule nella cartilagine femorale e humeral ottenuta da 8-10-settimana-vecchio (di topi BALB/c Figura 2). D'importanza, l'estensione spaziale della ferita di condrociti su superficie articolare è stato misurato rapidamente e facilmente in ImageJ. Risultati rapp...

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Discussione

I metodi sopra descritti sono stati impiegati con successo visualizzare praticabile e feriti/morti in situ chondrocytes articolari dalle articolazioni del mouse dopo prescritto impatti o carichi meccanici. In particolare, siamo stati in grado di analizzare la vulnerabilità meccanica dei condrociti all'interno della cartilagine articolare completamente intatto da due diverse articolazioni sinoviali: l'articolazione del ginocchio (femore distale) e spalla (Omero). I nostri risultati rappresentativi indicano che l'...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Richard Waugh e Luis Delgadillo per l'uso generoso di loro pH-metro e Osmometro. Inoltre, gli autori vorrei ringraziare Andrea Lee per contribuire allo sviluppo iniziale del sistema collaudo meccanico. Questo studio è stato finanziato dal NIH P30 AR069655.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Calceina, AM Invitrogen di Thermo Fisher Scientific C3100MP20x50mg , Eugene, OR, USA
Ioduro di propidioInvitrogen di Thermo Fisher ScientificP35661 mg/mL soluzione in acqua, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, anidro, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (calcio, magnesio, senza rosso fenolo) Gibco di Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Lama chirurgica in piuma (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, USA
Osmometro a pressione di vapore, VAPROELITechGroupModello 5520Puteaux, Francia
Misuratore di pH BeckmanModello Phi 32 Brea, CA, Stati Uniti
Thermomixer Eppendorf Eppendorf AGModello 5350Amburgo, Germania
Microscopio da ricerca invertito motorizzatoOlypmusModello IX-81Center Valley, PA, USA
Applicatore in legnoPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Vetrini coprioggetti in vetroWarner Instruments, LLC64-1696#1.5, spessore 0,17 mm, diametro 40 mm, Hamden, CT, USA

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