Articolo metodologico

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 ottobre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Mettiamo a disposizione un nuovo metodo per migliorare il contrasto di assorbimento di raggi x del mais tessuto adatto per l'esame di tomografia microtomografia ordinaria. Basato sulle immagini di CT, introduciamo una serie di flussi di lavoro di elaborazione delle immagini per diversi materiali mais per estrarre efficacemente microscopici fenotipi dei fasci vascolari del mais.

Abstract

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È necessario quantificare con precisione le strutture anatomiche di mais materiali basati su tecniche di analisi di immagine ad alta velocità. Qui, forniamo un 'protocollo di preparazione del campione' per materiali mais (cioè, stelo, foglia e radice) adatti per tomografia microtomografia ordinaria (micro-CT). Basato su immagini ad alta risoluzione di CT del mais del tronco, foglia e radice, descriviamo due protocolli per l'analisi fenotipica dei fasci vascolari: (1) basato sull'immagine di CT del foglio e del gambo di mais, abbiamo sviluppato una pipeline di analisi di immagine specifica per estrarre automaticamente 31 e 33 tratti fenotipici di fasci vascolari; (2) basato sulla serie di immagine di CT di radice di mais, abbiamo istituito un regime di trattamento di immagine per la segmentazione tridimensionale (3D) dei vasi metaxylem ed estratte bidimensionali (2D) e 3-d tratti fenotipici, come il volume, superficie dei vasi metaxylem, ecc. Rispetto al tradizionale misurazione manuale di fasci vascolari di mais materiali, i protocolli proposti migliorano significativamente l'efficienza e la precisione di quantificazione fenotipica micron-scala.

Introduzione

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Il sistema vascolare mais attraversa l'intera pianta, dalla radice e fusto alle foglie, che forma i percorsi di trasporto chiave per la distribuzione di acqua, sostanze nutrienti minerali e sostanze organiche1. Un'altra importante funzione del sistema vascolare è di fornire supporto meccanico per la pianta di mais. Ad esempio, la morfologia, il numero e la distribuzione dei fasci vascolari nelle radici e steli sono strettamente correlati alla resistenza sistemazioni di piante di mais2,3. Attualmente, gli studi sulla struttura anatomica dei fasci vascolari principalmente utilizzano tecniche microscopiche e ultramicroscopiche per visualizzare le strutture anatomiche di una certa parte del fusto, foglia o radice e quindi misurano e contano queste strutture di interesse di indagine manuale. Indubbiamente, misurazione manuale di varie strutture microscopiche in microimages su larga scala è un lavoro molto noioso e inefficiente e limita gravemente la precisione dei tratti di microphenotypic, grazie alla sua soggettività ed incoerenza4, 5.

Mais non ha nessuna crescita secondaria, e il contenuto della cella consiste essenzialmente di acqua nel meristema primario. Senza alcun pretrattamento, freschi campioni di mais tessuti possono essere analizzati direttamente utilizzando un dispositivo di micro-CT; Tuttavia, i risultati della scansione sono probabilmente povero e grezzo. I motivi principali sono riassunti come segue: densità (1) bassa attenuazione dei tessuti vegetali, risultante in un contrasto basso di numero atomico e alto rumore nelle immagini; (2) materiali vegetali freschi sono inclini a disidratarsi e si restringono durante il normale ambiente di scansione, come riportato da Du6. I problemi di cui sopra sono diventati i principali vincoli per lo sviluppo e l'applicazione della tecnologia microphenotyping per mais, frumento, riso e altre monocotiledoni. Qui, presentiamo il 'protocollo di preparazione del campione' per pretrattare i campioni di mais staminali, foglia e radice. Questo protocollo consente di evitare la disidratazione e la deformazione di materiali vegetali durante la TAC; Pertanto, è utile aumentare il tempo di conservazione di campioni di piante con nondeformation. Inoltre, il passo di tintura basato solido iodio migliora anche il contrasto di materiali vegetali; così, rende i miglioramenti significativi nella qualità imaging di micro-CT. Inoltre, abbiamo sviluppato software di elaborazione immagine, denominato VesselParser, per elaborare le immagini di CT di mais steli e foglie. Questo software integra un set di pipeline di elaborazione dell'immagine per eseguire analisi phenotyping di alto-rendimento e automatica per le immagini di CT 2-D di tessuti vegetali diversi. Fasci vascolari nell'intera sezione trasversale del gambo di mais e foglia vengono rilevati, estratti e identificati utilizzando un metodo di elaborazione delle immagini automatico. Di conseguenza, otteniamo 31 fenotipi microscopici del fusto mais e 33 fenotipi microscopici di foglia di mais. Per la serie di immagini di CT della radice mais, abbiamo sviluppato uno schema di elaborazione dell'immagine per acquisire tratti fenotipici 3D dei vasi metaxylem. Questo schema è superiore in termini di efficienza di acquisizione di immagini e di ricostruzione rispetto ai metodi tradizionali.

Questi risultati indicano che l'immagine elaborazione pipeline considerando che le caratteristiche di formazione immagine dei raggi x normali micro-CT forniscono un metodo efficace per la fenotipizzazione microscopica di fasci vascolari; Questo estremamente allarga le applicazioni delle tecniche di CT in scienze vegetali e migliora la fenotipizzazione automatica di materiali vegetali a risoluzione cellulare6,7.

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Protocollo

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1. protocollo di preparazione del campione

  1. Per il campionamento, raccogliere il fusto, foglia, radice da piante di mais fresche e li dividono in tre tipi di gruppi di campioni (ogni gruppo con quattro repliche). Quindi, tagliarle in piccoli segmenti usando una lama chirurgica nel modo seguente: (1) tagliare un segmento di mezzo gambo internodo 1-1,5 cm di lunghezza; (2) tagliare un segmento della larghezza massima dell'anta 0,5 - 3 cm di lunghezza lungo la direzione verticale con la vena principale; (3) tagliare un segmento della radice Corona 0,5 cm di lunghezza.
  2. Per il fissaggio di FAA, immergere i segmenti di campione in una soluzione di FAA (70% etanolo: 100% formaldeide: 100% acido acetico, 90:5:5 v/v/v) per almeno 3 d.
  3. Eseguire la procedura di disidratazione in sei sfumature di etanolo sequenziale (vale a dire, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100%) e impostare il tempo di elaborazione di ogni sfumatura di etanolo come 30 min.
  4. Posizionare i materiali vegetali nei cestelli corrispondente campione realizzati con una stampante 3D; quindi, trasferire rapidamente i cestini di campione alla cella campione di un sistema di essiccamento di CO2 punto critico. Impostare i parametri di essiccazione come segue:
    (1) CO2 in: velocità veloce. Riempitivi di titolare: 100%.
    (2) carica: CO2 carica ritardo 120 s nel ciclo. Cambio di velocità: 5. numero di ciclo: 12.
    (3) gas fuori: calore, veloce. Velocità: lento, 50%.
    1. Secondo le differenze morfologiche di mais radice, gambo e foglia, design e cesti di campione di stampa con una stampante 3D (ad esempio, Figura 1).
  5. Posizionare i materiali di pianta essiccata (mais radice, gambo o foglia) in una provetta da centrifuga da 50 mL con 2 g di iodio solido per tingere i materiali vegetali con vapori di iodio volatili e, quindi, posizionare i tubi in una tenuta di luce camera per 4-5 h.

2. micro-CT scansione protocollo

  1. Per eseguire la scansione nei dati grezzi di CT, impostare il CT come segue i parametri di scansione: 40 kV/250 µA (per stelo e foglie) o 34 kV/210 µA (per radice). Impostare il corrispondente tasteggio per le diverse dimensioni e volumi dei materiali vegetali utilizzati e regolare le dimensioni dei pixel imaging come segue: 2,0 µm (per la radice di mais), 6.77 µm (per il gambo di mais) e 10.0 µm (per la foglia di mais).
  2. Per ricostruire le immagini di fetta, convertire i dati grezzi di CT in CT fetta immagini con una risoluzione di 2K (2.000 x 2.000 pixel) utilizzando un software di ricostruzione di immagine. Maggiori dettagli sono forniti nel manuale dell'utente di NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. immagine analisi protocollo per un'immagine di CT singolo di un gambo di mais o di foglia

Nota: Utilizzare automatico software di imaging per fasci vascolari per condurre l'analisi phenotyping fasci vascolari all'interno delle immagini di fetta CT del mais del tronco e foglia (Figura 2). I punti di utilizzo del software sono descritti come segue.

  1. Nominare il tipo di organo per inizializzare la pipeline di algoritmo diverso. Fare clic sul pulsante parametri di metodo e selezionare mais staminali o foglia di mais nella prima casella a discesa.
  2. Per importare le immagini, fare clic sul pulsante di gestione dei dati , impostare la directory di lavoro e importare automaticamente tutte le immagini di fetta in questa directory. Selezionare le immagini singole o multi-slice nelle pipeline di immagine.
  3. Determinare la dimensione in pixel reali dell'immagine. Fare clic sul pulsante parametri di metodo e immettere la dimensione in pixel effettivi dell'immagine nella voce modifica della dimensione del pixel.
  4. Per il calcolo di fenotipizzazione, fare clic sul pulsante calcolo Phenotyping per estrarre automaticamente tratti fenotipici di fasci vascolari per tutte le immagini di sezione selezionata.
  5. Fare clic sul pulsante analisi statistica per restituire i risultati come un formato di file TXT o CSV.

4. immagine protocollo di analisi per serie di immagini di CT di una radice di mais

Nota: La serie di immagini di CT delle radici del mais sono utilizzate per estrarre le strutture 3-d dei vasi di metaxylem utilizzando il software di elaborazione delle immagini. I passi principali sono come segue.

  1. Importare le immagini ricostruite delle radici di mais (nel formato di file BMP) e determinare i parametri accurati spaziatura (la dimensione di un voxel [cioè, x, y, z]). Utilizzare lo strumento di gaussiana ricorsiva per lisciare queste immagini per migliorare la qualità dell'immagine.
  2. Condurre la segmentazione 3D dei vasi metaxylem regolando i parametri di soglia; Questo genera un'etichetta di colore uniforme per ogni nave collegato metaxylem.
  3. Migliorare e identificare le navi di metaxylem in modo interattivo utilizzando morfologia, bit per bit e le operazioni di riempimento flood.
  4. Condurre la ricostruzione di visualizzazione e superficie di volume dei vasi. Utilizzare lo strumento di statistiche di maschera per contare e misurare le caratteristiche fenotipiche di un vaso nel livello 2-D e 3-d.

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Risultati

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Il protocollo di preparazione del campione adatto per esame ordinario di micro-CT non solo previene la deformazione dei tessuti vegetali, ma anche migliora il contrasto di assorbimento di raggi x. Materiali vegetali pretrattati vengono scansionati usando un sistema di micro-CT in immagini di alta qualità fetta, e la risoluzione massima può raggiungere 2 µm/pixel. La figura 4 Mostra le immagini scansionate di micro-CT di fusto, foglia e radice, e il contrasto ...

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Discussione

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Con la riuscita applicazione di tecnologia di CT nei campi della biomedicina e scienze dei materiali, questa tecnologia è stata introdotta gradualmente nei campi della botanica e dell'agricoltura, promuovendo ricerche nelle scienze della vita di pianta come un promettente strumento tecnico . Nel tardo 1990, tecnologia CT in primo luogo è stata utilizzata per studiare le strutture morfologiche e sviluppo di sistemi di radice di pianta. Nell'ultimo decennio, Sincrotrone HRCT è diventato un potente strumento non distruttivo...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta dal National natura Science Foundation of China (No.31671577), la scienza e tecnologia innovazione speciale costruzione finanziato programma di Pechino Accademia di agricoltura e silvicoltura Sciences(KJCX20180423), la ricerca Programma di sviluppo della Cina (2016YFD0300605-01), la Fondazione di scienze naturali di Beijing (5174033), il Beijing Postdoctoral Research Foundation (2016 ZZ-66) e il Beijing Academy of agricoli e forestali Scienze Grant (KJCX20170404) ( JNKYT201604).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema di tomografia computerizzata a raggi X Skyscan 1172Bruker Corporation, BelgioNAPer la scansione TC Sistema
essiccazione dei punti critici CO2 (Leica CPD300)Leica Corporation, GermanyNAPer l'essiccazione dei campioni
EtanoloQualsiasiNAPer la fissazione FAA
FormaldeideQualsiasiNAPer la fissazione FAA
Acetico acidoQualsiasiNAPer la fissazione FAA
Lama chirurgicaQualsiasiNAPer il taglio dei campioni stampante
3DMakerbot replicator 2, MakerBot Industries, USANAPer la stampa dei cestelli dei campioni di radice, gambo e foglia di mais
Tubo da centrifugaCorning, USANAPosizionare i materiali della radice, del gambo o della foglia
Iodio solidoQualsiasiNAPer la tintura dei campioni
SkyScan Nrecon softwareSkyScan NRecon, Versione: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgioNAPer la ricostruzione delle immagini
VesselParser SoftwareVesselParser, Versione: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Pechino, CinaNAProtocollo di analisi delle immagini per una singola immagine TC del gambo o della foglia di mais
ScanIPScanIP, versione: 7.0; Simpleware, Exeter, Regno UnitoNASoftware di elaborazione di immagini 3D
Guanti in latticeQualsiasiNA
PinzetteQualsiasiNA
di

Riferimenti

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