Articolo metodologico

Analisi temporale della traslocazione nucleare--citoplasmico di Herpes Simplex Virus 1 proteina mediante microscopia confocale immunofluorescente

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 novembre 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

In questo articolo

Sommario

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ICP0 subisce la traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Non è noto il meccanismo molecolare di questo evento. Qui descriviamo l'uso del microscopio confocale come uno strumento per quantificare ICP0 movimento nell'infezione di HSV-1, che getta le basi per analizzare quantitativamente ICP0 traslocazione in futuri studi meccanicistici.

Abstract

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Cellula infettata proteine 0 (ICP0) del virus herpes simplex 1 (HSV-1) sono una proteina di inizio immediata contenente un'anello-tipo E3 ubiquitina ligasi. È responsabile della degradazione proteasomica di fattori restrittivi ospite e l'attivazione successiva gene virale. ICP0 contiene una sequenza canonica localizzazione nucleare (NLS). Entra nel nucleo immediatamente dopo la sintesi de novo ed esegue le sue funzioni di difesa anti-ospite principalmente nel nucleo. Tuttavia, più tardi nell'infezione, ICP0 si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare--citoplasmico durante l'infezione HSV-1. Presumibilmente ICP0 traslocazione consente ICP0 di modulare le sue funzioni secondo sue sedi subcellulari alle fasi di infezione diversa. Al fine di delineare la funzione biologica e il meccanismo di regolazione della traslocazione nucleare--citoplasmico ICP0, abbiamo modificato un metodo di microscopia immunofluorescente per monitorare il traffico di ICP0 durante l'infezione HSV-1. Questo protocollo coinvolge macchiatura immunofluorescente, microscopio confocale imaging e nucleare vs citoplasmico analisi di distribuzione. L'obiettivo del presente protocollo è quello di adattare le immagini confocal di stato stazionario prese a un corso di tempo in una documentazione quantitativa del movimento ICP0 in tutta l'infezione litica. Proponiamo che questo metodo può essere generalizzato per analizzare quantitativamente nucleare vs localizzazione citoplasmatica di altre proteine virali o cellulare senza coinvolgere la tecnologia di imaging dal vivo.

Introduzione

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Herpes simplex virus 1 (HSV-1) provoca una vasta gamma di lievi a gravi malattie erpetiche compreso herpes labiale, herpes genitale, cheratite stromal ed encefalite. Una volta infettato, il virus stabilisce un'infezione latente permanente in neuroni dei gangli. In alcuni casi, il virus può essere riattivato da vari motivi quali febbre, stress e soppressione immune1, conducente all'infezione di herpes ricorrente. Proteina della cellula infettata 0 (ICP0) è un regolatore chiave di virale cruciale per l'infezione HSV-1 sia litica e latente. Esso transattiva a valle virus geni tramite contrastando l'host difese antivirale intrinseca/innate2,3. ICP0 è un'attività della ligasi di ubiquitin E3, che si rivolge ai diversi fattori di cella per degradazione proteasoma-dipendente3. Esso interagisce anche con varie vie di cella per regolare le loro attività e successivamente per compensare host antivirale restrizioni3. ICP0 è noto per individuare in diversi compartimenti subcellulari come procede l'infezione3,4,5. La proteina ha un segnale di arginina/lisina-ricco di localizzazione nucleare (NLS) situato a residui 500 a 5066. Al momento di sintesi de novo a inizio infezione da HSV-1, ICP0 viene immediatamente importato nel nucleo. In primo luogo viene rilevato in una dinamica nucleare struttura definito dominio nucleare 10 (ND10)7. L'attività di ligasi di ubiquitin E3 di ICP0 innesca la degradazione delle proteine organizzatore ND10, proteina promyelocytic di leucemia (PML) e proteina maculato 100 kDa (Sp100)8,9,10. Dopo la perdita di proteine organizzatore, ND10 corpi nucleari sono dispersi e ICP0 è diffusa per riempire l'intero nucleo4,11.

È interessante notare che, dopo l'inizio della replicazione del DNA virale, ICP0 scompare dal nucleo. Si trova esclusivamente nel citoplasma, suggerendo la presenza di una traslocazione nucleare--citoplasmico tardi in HSV-1 infezione4,12. Il requisito della replica del DNA implica la partecipazione potenziale di una proteina virale tardivo nel facilitare la traslocazione citoplasmica di HSV-1 ICP04,12. Apparentemente ICP0 traffico tra diversi comparti durante infezione autorizza ICP0 per modulare le interazioni di varie vie cellulari in modo spaziale e temporale, e quindi coordinare le sue multiple funzioni alla fine tune l'equilibrio tra litiche e latente HSV-1 infezione13. Per capire meglio ICP0 multifunzionalità e il coordinamento di ICP0 domini funzionali durante l'infezione litica, abbiamo dissecato accuratamente la base molecolare della dinamica ICP0 traslocazione12. Per condurre gli studi meccanicistici precedentemente segnalati12, abbiamo applicato un metodo di macchiatura immunofluorescente per visualizzare la localizzazione sottocellulare ICP0 presso lo stato di infezione diversa sotto il microscopio confocale. Abbiamo anche sviluppato un protocollo quantitativo per analizzare il nucleare vs citoplasmico distribuzione di ICP0 utilizzando il software confocale. La popolazione delle cellule di infezione da HSV-1 è stata tabulata in tutte le fasi di infezione e sono state analizzate le tendenze del movimento ICP0, sotto diversi trattamenti biochimici12. Qui descriviamo il protocollo dettagliato quello spostamento di documenti ICP0 nell'infezione di HSV-1. Proponiamo che questo metodo può essere adottato come metodo generale per studiare la traslocazione nucleare vs citoplasmatica per altre proteine virali o cellulare, che può servire come alternativa al live imaging quando la tecnica di imaging dal vivo è inapplicabile a causa problemi quali etichettatura metodo, intensità del segnale o abbondanza di proteine.

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Protocollo

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1. cellula semina e infezione da Virus

  1. A 20 – 24 h prima dell'infezione del virus, seme 5 x 104 di fibroblasti di polmone embrionale umano (HEL) o altre cellule per essere esaminato in una diapositiva di 4 pozzetti 11 mm sfalsati in crescita medio (di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% fetale bovino siero (FBS)). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2).
    Nota: Ogni bene dovrebbe avere confluency di 70-80% delle cellule al momento dell'infezione.
  2. Il giorno successivo, è necessario rimuovere il mezzo di crescita e infettare le cellule con virus in Medium-199 in una gamma di 4 – 10 pfu/cella. Incubare le cellule infettate da virus per 1h a 37 ° C. Tenere scuotendo la diapositiva durante il periodo di incubazione.
  3. Dopo l'incubazione di 1h, rimuovere Medium-199 e integrare con il mezzo di crescita.
    Nota: Farmaci che interferiscono con le fasi di infezione diversa possono aggiungersi a questo punto o prima dell'assorbimento virale.
  4. Incubare le cellule infettate da virus a 37 ° C con 5% CO2 per varie lunghezze di periodo di infezione.

2. fissazione e permeabilizzazione

  1. In fase di infezione corretto rapidamente lavare le cellule infettate con tampone fosfato salino (PBS) 3 volte e aggiungere 200 μL di paraformaldeide 4% appena preparato in PBS. Incubare le cellule con paraformaldeide per 8 – 10 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule in ciascun pozzetto.
  2. Paraformaldeide di aspirare e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte. Aspirare completamente PBS dopo il lavaggio 3rd .
  3. Aggiungere 100 μL di tensioattivo non ionico 0,2% in ogni pozzetto per permeabilize le cellule per 5 – 10 min.
  4. Il tensioattivo non ionico di aspirare e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte.

3. immunofluorescenza colorazione

  1. Completamente aspirare PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% albumina di siero bovino (BSA) e 5% di siero equino in PBS) in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 h o a 4 ° C durante la notte.
  2. Aggiungere determinato sperimentalmente concentrazione di anticorpo primario (anticorpo policlonale di coniglio anti-ICP012) in tampone bloccante e incubare anticorpo primario a temperatura ambiente per 2 h o a 4 ° C durante la notte.
  3. Lavare con tampone bloccante 3 volte con un'incubazione di 10 min. Aggiungere anticorpo secondario coniugato 594 Alexa Capra anti-coniglio (1: 400 diluito in tampone bloccante) e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h. Quindi lavare i vetrini 3 volte con tampone bloccante a intervalli di 10 min.
  4. Infine lavare il vetrino una volta con PBS per rimuovere residuo BSA e siero equino.
  5. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio antifade con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per montare il vetrino e sigillarlo con il vetrino coprioggetti utilizzando smalto trasparente.

4. confocale Imaging

  1. Con un microscopio confocale, impostare la lunghezza d'onda a 590 – 650 nm per Alexa 594 e 410 – 520 nm per DAPI. Selezionare il formato di immagine a 1024 x 1024 e linea media di 8 di acquisire immagini ad alta risoluzione.
  2. Analizzare ogni pozzetto sulla diapositiva 4 pozzetti sotto il microscopio confocale. Acquisire immagini rappresentative delle cellule sotto l'obiettivo 100x, come mostrato in Figura 1 e Figura 2.
  3. Contando il numero elevato di celle, scattare fotografie di campi consecutivi sotto l'obiettivo 40x.
    Nota: Richiede 5-10 immagini ad accumulare oltre 200 cellule infettate da ogni punto di tempo di ogni infezione.
  4. In ogni esperimento, scattare foto con parametri costanti confocale per tutti i campioni devono essere confrontati.

5. analisi nucleare vs distribuzione citoplasmica

  1. Progetto aperto con il software applicativo confocale. Selezionare un'immagine da cui le cellule hanno bisogno per essere tabulati per nucleare vs distribuzione citoplasmica di ICP0.
  2. Fare clic sulla scheda "Quantità" dal menu in alto e selezionare "Ordina ROIs" dal menu strumenti.
  3. Disegnare una linea longitudinale attraverso la cella per essere analizzati selezionando "Disegnare la linea" dal menu in alto.
    Nota: Istogramma apparirà mostrando l'intensità di fluorescenza lungo la linea per ICP0 e DAPI. Nell'istogramma, la linea blu rappresenta i pixel che DAPI e segna il confine del nucleo, mentre la linea rossa rappresenta ICP0 pixel.
  4. Basato su una colorazione di fondo, impostare una soglia costante per intensità di ICP0 analizzare ICP0 distribuzione subcellulare in ogni esperimento.
    1. Come esemplificato nella Figura 2, se il rosso segnale in media è sotto la soglia della regione nucleare ma è sopra la soglia oltre il contorno blu, classificare il segnale rosso principalmente si trova nel citoplasma.
    2. Se il segnale rosso è sopra la soglia in tutto il nucleo e oltre il limite del segnale blu, gruppo il segnale rosso come nucleo più localizzazione citoplasmatica.
    3. Se il segnale rosso è di sopra della soglia nel nucleo, ma in media è di sotto di essa all'esterno del contorno del segnale blu, gruppo il segnale rosso come localizzazione nucleare.
  5. Catalogare più di 200 cellule infettate da ciascun campione in fase di infezione diversa e trama di un grafico a barre per illustrare ICP0 movimento secondo tempo (Figura 3).

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Risultati

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Per comprendere le basi molecolari e le funzioni biologiche della ICP0 tratta durante l'infezione HSV-1, utilizziamo un metodo di microscopia immunofluorescente per analizzare la distribuzione subcellulare ICP0 alle fasi di infezione diversa. La figura 1 Mostra le cellule rappresentante con distintivo ICP0 localizzazione come il progredire dell'infezione. Per quantificare la traslocazione nucleare--citoplasmico di ICP0, analizziamo ICP0 distribuzione rispetto...

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Discussione

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Questo protocollo è stato usato per studiare la traslocazione nucleare--citoplasmico di HSV-1 ICP0. ICP0 subisce subcellulare traffico durante l'infezione di HSV-1 (Figura 1). Probabilmente, ICP0 interagisce con varie vie di cellule per svolgere funzioni diverse in luoghi diversi. In questo modo ICP0 a mettere a punto le sue multiple funzioni nel braccio di ferro con ospite umano13. Tuttavia, come ICP0 coordina le funzioni multiple in modo spaziale e temporale non è s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il sostegno finanziario da una sovvenzione di NIH (RO1AI118992) assegnata a Haidong Gu. Ringraziamo la struttura microscopia, Imaging & Core Cytometry risorse (MICR) presso la Wayne State University per il supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule e virus
Fibroblasti polmonari embrionali umani (cellule HEL)Dr. Thomas E. Shenk (Università di Princeton)Le cellule HEL sono state coltivate in DMEM integrate con il 10% di FBS
HSV-1 virale Stock (Ceppo F)Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (DMEM)Invitrogen  11965-092
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015
Reagents
4- well 11 mm sfalsato vetrinoCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
Soluzione di paraformaldeide al 16% (c/v) Senza metanoloThermo Scientific28908
Triton X-100Reagenti FisherBP151-1C0
Siero bovino Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Siero di cavalloSigmaH1270
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)Dr. Haidong Gu lab
NaCl           Fisher BioreagenteBP358-212
KH2PO4                       Fisher BioreagenteBP362-500
KCl                         Fisher Scientific BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagenteBP332-500
Tampone bloccante (PBS con 1% BSA e 5% di siero di cavallo)Dr. Haidong Gu lab
Anticorpo Rabiit Anti-ICP0Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-IgG monoclonale di toposanta Cruz BiotechnologySC-966
Alexa Fluor 594-capra anti-coniglio IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-capra anti-topo IgGinvitrogenA11001
Vectashield Mezzo di montaggio con DAPIVector laboratoriesH-1200
Pasteur pipettaFisher Brand13-678-20D
Smalto per unghieSally Hansen
Equipment
Microscopio confocaleSoftware confocale Leica SP8
Leica LAS X Suite
Software ExcelMicrosoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubatoreThermo ScientificCodice d'ordine 51026282
di applicazioni

Riferimenti

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Traslocazione nucleo citoplasmaticaproteina ICP0 di HSV 1analisi del traffico proteicolocalizzazione subcellulareprotocollo di imaging confocalemisurazione dell intensit di fluorescenzacolorazione nucleare con DAPIcinetica dell infezioneattivazione dei geni virali

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