Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Summary

Descriviamo i metodi per l'etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l'imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .

Abstract

Time-lapse imaging è un potente metodo per analizzare il comportamento di migrazione delle cellule. Dopo d'etichettatura delle cellule fluorescenti, il movimento delle cellule con etichettate nella cultura può essere registrato sotto video microscopia. Per l'analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è comunemente usato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare radiale. Tuttavia, limitati informazioni possono essere ottenute dal metodo di cultura slice per analizzare la migrazione cellulare perpendicolare alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare tangenziale. Qui, presentiamo i protocolli per time-lapse di imaging per visualizzare la migrazione cellulare tangenziale nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Una combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovo e una successiva cultura di piatto-Monte sull'inserto di cultura cellulare consente il rilevamento di movimento di migrazione cellulare nel piano orizzontale. Inoltre, il nostro metodo facilita il rilevamento del comportamento delle singole celle e l'azione collettiva di un gruppo di cellule a lungo termine. Questo metodo può essere applicato potenzialmente per rilevare la modifica sequenza della fluorescente-etichetta micro-struttura, compreso l'allungamento assonale nello spostamento dei tessuti o cellule neurale nel tessuto non neurali.

Introduction

Lo studio della migrazione cellulare è proseguito con la tecnica avanzata di imaging dal vivo. Dopo d'etichettatura delle cellule fluorescenti, l'andamento temporale delle cellule con etichettate in una piastra di coltura o in vivo può essere registrato sotto video microscopia. Nello studio dello sviluppo neurale, i cambiamenti morfologici della migrazione di cellule o allungando gli assoni sono stati analizzati usando la formazione immagine di time-lapse. Per l'imaging efficace, è indispensabile applicare un metodo adatto per la preparazione di etichettatura ed il tessuto delle cellule fluorescenti, basata allo scopo dell'esperimento e analisi. Per l'analisi....

Protocol

1. Elettroporazione In Ovo

1. Preparare il DNA del plasmide di espressione per l'etichettatura fluorescente in alta concentrazione. Isolare il DNA da 200 mL di coltura batterica con il metodo di lisi alcalina utilizza colonne di scambio anionico secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc ad una concentrazione finale di 4 µ g / µ l ciascuna.
   Nota: Privo di endotossina di purificazione del DNA del plasmide può essere preferito per elettroporazione.
2. Incubare uova di gallina fertile orizzontalmente a 38 ° C a 70% di umidità relativa.
3. Dopo 2,5 giorni, eliminare 5 mL d....

Results

La figura 2 Mostra la migrazione tangenziale superficiale visualizzata in una cultura di piatto-Monte a un periodo di tempo (0, 9, 18, 27 h) dopo l'inizio della registrazione. Film 1 è un filmato time-lapse di 10 min-intervalli per un periodo di 28 h e 50 min. La cornice è selezionata per mettere a fuoco sulle cellule migrazione dall'angolo inferiore sinistro con etichetta del telaio allo spazio senza etichetta (

Discussion

Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per il rilevamento di migrazione cellulare in strati superficiali^6,8. È applicabile per la rilevazione di strato intermedio migrazione flussi (film 5)^6,7, solo da spostando la tempistica dell'elettroporazione (5,5 a E4.5) e l'inizio della cultura e imaging (E7.0 a E6.0).

La procedura presentata è com.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiali
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	kit di purificazione del DNA plasmidico privo di endotossine
siringa da 20 ml	TERUMO	SS-20ESZ
ago calibro 18	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillina e streptomicina	Gibco	15140-122
tubo capillare in vetro	Narishige	G-1
inserto per colture cellulari	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	rivestimento dell'inserto di coltura
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	rivestimento dell'inserto di coltura
piatto inferiore in vetro	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	terreno di coltura
F12	Gibco	11765-054	terreno di coltura
fetale bovino	Gibco	12483	terreno di coltura Gib
	16110082		co
	Gibco	14065-056
coltello microchirurgico	Specialità chirurgiche cooperazione	72-1501
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
scissors	AS ONE	No.11
processore di micropipette	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
elettrodo a pinza	BEX	LF646P3x3
generatore di impulsi	BEX	CUY21EX	elettroporatore
microscopio stereoscopico a fluorescenza		MZ16F
	Olympus
	Regolatore di temperatura Tokken	MIGM/OL-2
	Unità confocale laser Tokai Hit	MI-IBC
	Olympus	FV300