Con la presentennotità di un protocollo per misurare al capezzale l'attività di endotossina dei campioni di sangue intero umano. Il saggio Endotoxin Activity è un semplice test da eseguire e può essere un biomarcatore utile nei pazienti critici con sepsi.
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Articolo metodologico
Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il lipopolisasseride, noto anche come endotossina, è una componente fondamentale dei batteri gram-negativi e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della sepsi e dello shock settico. L'identificazione precoce di un processo infettivo che si sta rapidamente evolvendo verso una malattia critica potrebbe indurre un trattamento più rapido e più intensivo, portando così potenzialmente a migliori esiti per i pazienti. L'attività endotossina (EA) può essere utilizzato al capezzale come biomarcatore affidabile dell'endotossia sistemica. È stato ripetutamente dimostrato che la rilevazione di livelli elevati di attività endotossina sia associata ad un aumento della gravità della malattia nei pazienti con sepsi e shock settico. Il saggio è veloce e facile da eseguire. In breve, dopo il campionamento, un di sangue intero viene mescolato con un anticorpo anti-endotossina e con LPS aggiunto. L'attività dell'endotossina è misurata come la relativa raffica ossidativa di neutrofili innescati rilevati dalla chemioluminescenza. L'output del saggio è espresso su una scala da 0 (assente) a 1 (massimo) e classificato come "basso" (<0,4 unità), "intermedio" (0,4–0,59 unità) o "alto" (unità 0,6 USD). La metodologia dettagliata e la logica per l'attuazione del saggio EA sono riportate in questo manoscritto.
Introduzione
Il Lipopolysaccharide (LPS), noto anche come endotossina, è un componente chiave della struttura della membrana dei batteri Gram-negativi (GN). Esso costituisce circa il 10% della parete cellulare, essendo vitale per l'integrità della membrana esterna e l'omeostasi. Inoltre, è un potente attivatore del sistema immunitario innato dell'ospite1,2.
L'esposizione in vitro delle cellule del sistema immunitario innato a LPS porta a cambiamenti nell'espressione di più geni3. La somministrazione di piccole quantità di LPS in volontari umani sani innesca la cascata di infiammazione sistemica acuta, mentre la sepsi e lo shock settico possono insorgere con concentrazioni di endotossina più elevate4,5.
La sepsi è una condizione pericolosa per la vita che, se non prontamente riconosciuta, può portare all'insufficienza multiorgano e alla morte. I pazienti settici devono essere trattati in modo tempestivo, con rianimazione aggressiva, terapia antibiotica adeguata, controllo ottimale del codice sorgente e strategie di supporto all'organo tempestivo. La diagnosi dell'eziologia della sepsi si basa principalmente sul riconoscimento clinico e sul rilevamento di patogeni basati sulla cultura6. Tuttavia, i risultati delle colture microbiche possono richiedere fino a 48 h e sono inconcludenti fino al 30% dei casi7. L'identificazione precoce e l'intervento possono portare a migliori esiti per i pazienti. Nei pazienti in cui si sospetta la sepsi, le decisioni sono spesso prese sulla base di parametri fisiologici e biochimici, senza un chiaro segno di endotossia.
La misurazione dell'attività endotossina (EA) può essere ottenuta mediante un saggio commerciale (vedi Tabella deimateriali) nel sangue intero. Può essere utilizzato come biomarcatore dell'endotossia sistemica per la stratificazione precoce della gravità della malattia, in particolare nei pazienti a rischio di sviluppare shock settico8. Il test è stato utilizzato per guidare la terapia dell'emoperfusione Polymyxin B in uno studio clinico in doppio cieco controllato da randomizzati in pazienti con shock settico9. Nei pazienti in stato di crisi, lo studio MEDIC ha mostrato un aumento dei livelli di EA da associare alla disfunzione di organi multipli, alla durata del soggiorno dell'unità di terapia intensiva (ICU) e alla mortalità10.
Sono stati sviluppati diversi saggi per rilevare l'endotossina. L'assaggio di Limulus Amoebocyte (LAL), sia come gel-clot, turbidimetrico, o test cromogenico, è stato finora il più frequentemente adottato per la stima dell'endotossina del siero. Si basa sulla capacità di endotossina per indurre la coagulazione dell'emolina del granchio a ferro di cavallo, Limulo polyphemus. Tuttavia, questo saggio ha alcune limitazioni in termini di specificità. In particolare, può anche essere attivato da prodotti microbici diversi dall'endotossina, come i componenti della parete cellulare fungina, e può essere inibito da varie proteine plasmatiche umane11.
Durante l'ultimo decennio la misurazione di EA è stata sviluppata e convalidata come biomarcatore dell'endotossia circolante. Rispetto al test LAL, EA è più veloce e più facile da implementare in ambito clinico. Inoltre, è stato dimostrato di essere più preciso di LAL nel sangue intero, con una maggiore sensibilità e specificità, sia in vitro che in vivo12.
Nonostante la sua implementazione iniziale come uno strumento diagnostico precoce per la rapida identificazione dei batteri GN come agenti causali di sepsi, il livello di EA è stato studiato anche come biomarcatore della gravità della malattia. In questo contesto, è stato dimostrato di essere particolarmente utile valutare lo stato di ipoperfusione a causa di malattie critiche in corso, come lo shock settico o la sindrome da arresto post-cardiaco13. Più recentemente, dopo lo sviluppo di sistemi di emopurazione, è stato proposto anche un risultato positivo di EA come strumento di screening per identificare con precisione i potenziali candidati per tale terapia14. Recentemente abbiamo condotto uno studio retrospettivo osservazionale sulla prevalenza e l'importanza clinica dei primi livelli di EA in 107 pazienti con shock settico. In linea con altri risultati recenti, abbiamo scoperto che EA è un promettente marcatore della gravità della malattia nei pazienti con shock settico15.
Lo scopo del presente manoscritto è descrivere il metodo per eseguire il saggio EA, sia al capezzale che in laboratorio, e descriverne l'uso potenziale in uno scenario rappresentativo di shock settico. Questa tecnica è in grado di rilevare l'attività di LPS misurando l'esplosione ossidativa avanzata nei neutrofili in seguito al loro innesco da complessi di un anticorpo anti-endotossina e LPS. L'aumento dell'esplosione respiratoria viene rilevato da un chemiluminometro e la quantità di luce emessa è considerata proporzionale alla quantità di endotossina nel campione di sangue. Il saggio richiede pochi reagenti, richiede circa 30 min per eseguire eutilizza appena 40 .
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Protocollo
Il protocollo è condotto secondo le linee guida istituzionali relative alla gestione delle biocampioni umane e seguendo le attuali procedure operative standard del nostro laboratorio clinico. L'uso dei dati EA e delle informazioni cliniche dei pazienti testati segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.
1. Attrezzature di laboratorio e contenuti del kit di anamante
- Conservare il kit EA a 2-8 gradi centigradi quando non è in uso.
-
Ogni test EA è costituito da 5 diversi tipi di tubi; utilizzare ciascuno di essi per una parte diversa del test (vedere la sezione 2).
- Utilizzare tubo #1 (il tubo "Control") per misurare l'attività basale della raffica ossidativa non specifica dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.
- Utilizzare il tubo #2 (il tubo "Campione") per misurare la raffica ossidativa in risposta al complesso dell'anticorpo LPS.
- Usa il tubo #3 (il tubo "Max") per misurare la picchiata ossidativa massima dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina.
- Utilizzare il tubo #4 (il tubo "LPS") come fonte di endotossina endogena endogena.
- Utilizzare tubo #5 ("tubo "Aliquota") per l'immagazzinamento del sangue.
NOT: Duplicati di tubi #1, #2 e #3 sono previsti per un totale di 8 tubi da utilizzare per ogni campione di sangue sottoposto a test (la bottiglia di reagente EA e il test di controllo di qualità possono essere utilizzati per tutte le prove contenute in una sacca).
- Raccogliere campioni di sangue del paziente in tubi sterili contenenti anticoagulante EDTA. Conservare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima di eseguire il test EA.
- Prima di iniziare il test, accendere il chemiluminometro e lo shaker dell'incubatrice. Riscaldare l'incubatrice alla temperatura di 37 gradi centigradi.
- Idealmente, iniziare l'elaborazione del campione entro 30 min dalla raccolta del sangue.
2. Saggio di attività dell'endotossina
- Preparare le provette EA per il campione di sangue di ogni paziente che è necessario testare. Mettere i tubi in rastrelliere a tubo. Quindi rimuovere i tappi.
- Utilizzando una combipipetta, pipette un volume di 1 mL del reagente EA dalla bottiglia in tubi #1 (tubo di controllo), #2 (tubo di campionamento) e #3 (tubo massimo), ciascuno in duplicato.
NOT: Pipetta lungo il lato del tubo per evitare soluzione spruzzi indietro. - Mescolare il campione di sangue del paziente invertendo delicatamente il tubo di raccolta del sangue per 20 volte. Quindi, pipetta 0,5 mL di sangue del paziente nel tubo #4 (tubo massimo LPS) e tubo #5 aliquota (tubo). Tubo vortice #4 per 10 s.
- Mettere i rack a tubo con tutte le provette EA nello shaker dell'incubatore. Chiudere il coperchio e incubare per 10 min alla temperatura di 37 gradi centigradi.
- Aprire il coperchio e rimuovere i rack tubo dallo shaker incubatrice. #5 tubo Vortex (tubo Aliquota). Utilizzando una punta sterile, pipetta 40 -L di sangue in tubi #1 e #2, in duplicato.
- #4 tubo Vortex (tubo LPS). Utilizzando la stessa punta di pipetta, pipetta 40 -L di sangue dal tubo #4 in #3 tubo (tubo Max), in duplicato.
- Vortex le sei provette finali (#1, #2, #3 e rispettivi duplicati), quindi riposizionarle nei loro rack.
NOT: Assicurarsi che tutti i tubi siano vortice per la stessa quantità di tempo. - Rimettere i rack del tubo nello shaker per incubazione e chiudere il coperchio. Impostare lo shaker di incubazione a 100 giri/m, quindi avviare il movimento per 14 min.
- Inserire la scheda chipcard etichettata EA nel chemiluminometro e premere start. Dopo l'incubazione di 14 min, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro per leggere i tubi EA nell'ordine corretto.
- Vorticare delicatamente ogni tubo per 10 s prima di posizionarlo sul supporto del campione del chemiluminometro. Aprire il cassetto campione e posizionare il tubo #1 nel supporto del campione. Quindi, chiudere il cassetto di esempio e attendere la lettura dell'unità luminosa relativa (RLU).
- Ripetere il passaggio 2.10 per il tubo 2 e il tubo 3.
- Ripetere i passaggi 2.10 per i tubi duplicati 1, 2 e 3.
NOT: Provate a vorticare tutti i tubi per la stessa quantità di tempo durante i passaggi 2.10–2.12. - Dopo che tutti i tubi sono stati elaborati, si noti che i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. I livelli sono espressi come unità EA e rappresentano la media di determinazioni duplicate dagli stessi campioni.
- Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.13 per ogni campione di sangue che deve essere testato.
- Una volta completato il test, conservare le provette e i reagenti EA rimanenti a 2-8 gradi centigradi per un massimo di 30 giorni.
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Risultati
Un uomo di 72 anni è stato ricoverato al Pronto Soccorso (ED) di un ospedale urbano accademico. Pochi giorni prima si era presentato al suo medico di base lamentandosi di bruciare la minzione. È stata raccomandata una terapia a breve corso con fosforomicina orale. La sua storia medica includeva l'ipertensione, il diabete non complicato di tipo 2 e l'iperplasia prostatica benigna. I suoi farmaci includevano enalapril, atorvastatina, tamsulosin e metformina.
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Discussione
Lo shock settico è ancora oggi associato a una mortalità fino al 40%, anche se questo tasso varia a seconda dei rapporti considerati16. La necessità di biomarcatori nuovi e migliori è sostenuta dalla maggior parte degli esperti del campo al fine di aiutare i medici nella diagnosi precoce, una migliore gestione e la prognosticazione dei pazienti con shock settico6.
L'esecuzione di un test EA non richiede conoscenze tecniche precedenti o sofisticat...
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Dichiarazioni
Estor SpA ha coperto il costo della pubblicazione della rivista e della tassa di produzione video. Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Paolo Braganò e Lisa Mathiasen, Ph.D. per la loro revisione della metodologia del protocollo di analisi. Dario Winterton, MD fornì un sostanziale aiuto alla revisione del manoscritto per la conoscenza della lingua inglese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit EAA | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Pacchetto con 20 test + 1 controllo qualità |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometro |
| Agitatore per incubatrice | GRANT | ES-20 | Agitatore per mini-incubatrice |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Strumento a vortice |
Riferimenti
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