Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.
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Articolo metodologico
Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le trappole extracellulari Neutrophil (NET) sono strutture antimicrobiche simili a reti formiche di proteine antimicrobiche derivate dal DNA e dal granulo. La microscopia dell'immunofluorescenza e i metodi di quantificazione basati sull'immagine rimangono strumenti importanti per quantificare la formazione di trape extracellulari di neutrofili. Tuttavia, esistono limitazioni chiave ai metodi basati sull'immunofluorescenza che sono attualmente disponibili per quantificare i NET. I metodi manuali di quantificazione NET basata su immagini sono spesso soggettivi, soggetti a errori e noiosi per gli utenti, in particolare gli utenti non esperti. Inoltre, le opzioni software attualmente disponibili per la quantificazione sono semi-automatiche o richiedono una formazione prima del funzionamento. Qui, dimostriamo l'implementazione di un metodo automatizzato di quantificazione delle immagini basato sull'immunofluorescenza per valutare la formazione della rete chiamata NETQUANT. Il software è facile da usare e ha un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva. Considera parametri biologicamente rilevanti come un aumento della superficie e il rapporto di proteina del marcatore DNA:NET e la deformazione nucleare per definire la formazione della rete. Inoltre, questo strumento è costruito come un'applicazione liberamente disponibile, e consente la quantificazione e l'analisi di risoluzione singola.
Introduzione
Neutrophils sono mediatori cruciali delle risposte innate alla difesa dell'ospite contro un'ampia varietà di patogeni microbici1. Essi eseguono le loro funzioni antimicrobiche rilasciando i loro granuli contenenti una vasta gamma di proteine antimicrobiche2, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ipocloriterite1, e attraverso la fagocitosi3. Inoltre, Brinkmann et al. 4 ha descritto le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) come un nuovo meccanismo con il quale i neutrofili intrappolano ed eliminano gli agenti patogeni invasor....
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Protocollo
Il comitato etico dell'Università di Lund ha approvato la raccolta di sangue venoso da volontari sani in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013/728). Tutti i volontari hanno fornito il loro consenso informato scritto.
1. Isolamento dei neutrofili del sangue periferico usando la centrifugazione densità-gradiente
- Raccogliere il sangue venoso umano in tubi contenenti eparina e consentire ai tubi di raggiungere la temperatura ambiente.
Nota: È necessario un minimo di 16 mL di sangue da un donatore sano per produrre un pellet cellulare sufficientemente grande. - Mescolare il sangue con un volume del 2% dextran in ....
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Risultati
5 x 105 neutrofili/mL sono stati seminati su copricapi posizionati in una piastra di 12 pozze e stimolati con 20 nM di PMA o lasciati non stimolati per 150 min. I campioni sono stati poi macchiati utilizzando anticorpi contro il controcatena di controilofilo contro l'uomo del coniglio primario, anticorpi coniugati per i dettagli della tavola dei materiali anti-coniglio anti-coniglio e DAPI - un colorante fluorescente etichettato con DNA (vedi la tabella dei mat.......
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Discussione
La formazione della rete è un'aggiunta relativamente recente all'armamentario neutrofilo variegato4 e c'è stato un notevole aumento di interesse per studiare l'implicazione di NET in una vasta gamma di aree di ricerca5,7,14,15. L'acquisizione di immagini mediante la microscopia immunofluorescenza e la successiva quantificazione basata sulle immagini è un metodo ampiament.......
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Dichiarazioni
TM e PN hanno un brevetto in sospeso relativo agli algoritmi utilizzati in NETQUANT.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato finanziato dalla Crafoord Foundation (TM e PN), dalla borsa svedese per la ricerca del governo (PN, TM), dal consiglio svedese per la ricerca (PN) e dalla Fondazione Groschinsky (TM, PN).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer Tubi di plastica eparinizzati | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 con L-Glutammina | Gibco | 11835-030 | |
| Flaconi conici da 50 ml | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Flaconi conici da 15 ml | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Tessuto a 12 pozzetti piastre di coltura | Falcon | 10626491 | |
| #1 Vetrini coprioggetti 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Vetrini | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Elastasi primaria anti-umana | DAKO DAKO | coniglio 1373, immunizzazione | |
| Secondario fluoroforo coniugato capra anti-coniglio | Tecnologie di vita | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Reagente antisbiadimento con tecnologie DAPI | Life | P36930 | Terreno di montaggio |
| Siero di capra | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Microscopio a epifluorescenza | Fotocamera CCD Nikon | ||
| Andor Zyla | |||
| Plan Obiettivi Apocromatico 20x, 40x | Nikon | ||
| Windows 10 | operativo | Microsoft | |
| macOS Sierra 10.12 | Sistema | operativo | |
| MATLAB | Mathworks |
Riferimenti
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H.
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Ristampe e permessi
