Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Isabella Finco; Gary D. Hammer

doi:10.3791/58530

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Articolo metodologico

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

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DOI:

10.3791/58530

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2 ottobre 2018

Isabella Finco¹ , Gary D. Hammer¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Department of Internal Medicine (Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes), University of Michigan Health System, ²Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Health System, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan Health System, ⁴Endocrine Oncology Program, University of Michigan Health System, ⁵Comprehensive Cancer Center, University of Michigan Health System

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo per isolare ghiandole surrenali da topi, difficoltà i tessuti, sezione loro ed eseguire la colorazione di immunofluorescenza.

Abstract

L'immunofluorescenza è una tecnica affermata per il rilevamento degli antigeni nei tessuti con l'impiego di anticorpi coniugati fluorocromo e ha un ampio spettro di applicazioni. Rilevamento degli antigeni permette per la caratterizzazione ed identificazione di più tipi di cellule. Situato sopra i reni e incapsulati da uno strato di cellule mesenchimali, il surrene è un organo endocrino, composto da due tessuti differenti con differenti origini embriologiche, mesonephric intermedia derivati mesoderma corteccia esterna e neurali derivati dalla cresta midollo interno. La corteccia surrenale secerne steroidi (cioè, i mineralcorticoidi, glucocorticoidi, ormoni sessuali), mentre il midollo surrenale produce catecolamine (cioè, adrenalina, noradrenalina). Durante lo svolgimento di ricerca adrenale, è importante essere in grado di distinguere le uniche cellule con funzioni diverse. Qui forniamo un protocollo sviluppato nel nostro laboratorio che descrive una serie di passi sequenziali necessarie per ottenere la colorazione di immunofluorescenza per caratterizzare i tipi di cellule della ghiandola surrenale. Prima ci concentriamo sulla dissezione delle ghiandole surrenali del mouse, la rimozione microscopica del grasso di periadrenal seguita dalla fissazione, elaborazione e inclusione in paraffina del tessuto. Descriviamo quindi la divisione dei blocchi di tessuto con un microtomo rotativo. Infine, abbiamo dettaglio un protocollo per la macchiatura immunofluorescente delle ghiandole adrenali che abbiamo sviluppato per ridurre al minimo sia non specifico anticorpo che lega e autofluorescenza al fine di ottenere un segnale ottimo.

Introduzione

Immunohistochemistry è una tecnica per la rilevazione di componenti del tessuto con l'uso di anticorpi contro specifiche molecole cellulari e successive tecniche di colorazione per rilevare gli anticorpi coniugati¹. Questa procedura di immunohistochemical richiede particolare attenzione e il trattamento dei tessuti che sono spesso empiricamente determinati per l'antigene specifico, dei tessuti e l'anticorpo utilizzato². La fissazione è cruciale per mantenere lo stato "originale" del tessuto e quindi mantenendo intatto cellular e strutture subcellulari e modelli di espressione. Ulteriore elaborazione e incorporare procedu....