Morfometrica protocollo per la valutazione obiettiva dei blastocisti comportamento durante la vetrificazione e passaggi scaldavivande

Summary

Qui presentiamo un protocollo time-lapse morfometrica per seguire l'intensità della contrazione di blastocisti e re-espansione durante gli interventi di previtrification ed il recupero post-riscaldamento. L'applicazione del protocollo è possibile in vitro fertilizzazione laboratori attrezzati con microscopi time-lapse e raccomanda lo sviluppo di un metodo di vitrificazione blastocisti ottimale.

Abstract

Questo articolo viene descritto il metodo non invasivo di blastocisti morfometria basata su Time-lapse microfotografia per il monitoraggio accurato del volume di una blastocisti cambiando durante diverse fasi prima e dopo la vitrificazione. Il metodo può essere utile nella ricerca per la tempistica ottima di esposizione di blastocisti a diverse concentrazioni di crioprotettori osservando restringimento di blastocisti e re-espansione in diversi pre- e post-vetrificazione fasi. Con questa metodologia, il protocollo di vetrificazione di blastocisti può essere ottimizzato. Per una migliore dimostrazione dell'utilità di questo metodo morfometrico, vengono confrontati due protocolli di preparazione diversi blastocisti per la vitrificazione; uno con l'utilizzo di un artificiale Blastocele crollando e uno senza questo intervento prima di vetrificazione. Entrambe le variazioni di volume dei blastocisti sono seguite da Time-lapse microfotografia e misurate dagli strumenti software di fotoritocco. Le misurazioni sono effettuate ogni 20 secondi in fasi di previtrification e ogni 5 minuti nel periodo post-riscaldamento. I cambiamenti delle dimensioni blastocisti per unità di tempo sono presentati graficamente nei diagrammi di linea. I risultati mostrano una fase di previtrification di equilibrazione lungo in cui la blastocisti intatta prima si restringe e poi lentamente ricariche Blastocele, entrando vetrificazione con un Blastocele fluido-riempita. La blastocisti artificialmente compressa rimane nella sua fase rattrappito attraverso la fase di equilibrazione intero. Durante la fase di vetrificazione, anche non cambia il suo volume. Poiché la morfometria di blastocisti Mostra un volume costante delle blastocisti artificialmente crollate durante il passo di previtrification, sembra che questa fase potrebbe essere più breve. Il protocollo descritto fornisce molti parametri aggiuntivi comparativi del comportamento di blastocisti durante e dopo la crioconservazione in base la velocità e l'intensità delle variazioni di volume, il numero di contrazioni Blastocele parziale o totali blastocisti crolla e il tempo di un Blastocele totale re-espansione o il tempo di schiusa.

Introduction

Crioconservazione degli embrioni preimpianto dall'in vitro programma di fertilizzazione (IVF) è al giorno d'oggi una pratica di routine nella maggior parte dei laboratori IVF. L'embrione lento congelamento Metodo cominciò ad essere usato clinicamente nel 1985, con l'introduzione di specifiche crioprotettori e congelatori controllati dal computer, che ha permesso il raffreddamento controllato degli embrioni fino a-7 ° C, quando la nucleazione di ghiaccio (semina) è stata indotta nella circostanti Crioprotettivi medium¹. Di raffreddamento continuo, si svilupperebbe i cristalli di ghiaccio, causando l'iperosmolarità della frazione liquida....

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di etica medica nazionale il 19 aprile 2016 (n. 0120 – 204/2016 – 2).

1. messa a punto del sistema di registrazione di microscopio

1. Spegnere la piastra riscaldante del microscopio.
2. Prima di qualsiasi trattamento, scattare un'istantanea di una blastocisti sotto un microscopio invertito dotato di telecamera. Ricordarsi di notare l'ingrandimento a cui è stata registrata la blastocisti.

2. selezione e Pratoparation di blastocisti per la vitrificazione

1. Selezionare soli completamente espansi blastocisti giorno-5 o 6 ° gior....

Results

In una dimostrazione, abbiamo mostrato morfodinamica di blastocisti in un solo previtrification e una fase di post-riscaldamento. Una differenza di volume di blastocisti alla fine della fase di equilibrazione e all'inizio del recupero in terreno di coltura ha mostrato l'intensità della contrazione dell'embrione, che è, infatti, l'intensità di conservazione degli embrioni contro cristallizzazione di ghiaccio.

Come si può notare d.......

Discussion

Il protocollo per l'osservazione di blastocisti morfodinamica durante e dopo la crioconservazione può essere effettuata anche utilizzando strumenti simili e strumenti software di altri produttori. Time-lapse sistemi regolati per embriologia permettono il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale. Lo scopo di questo lavoro era di introdurre la quantificazione del comportamento di blastocisti durante la preparazione di blastocisti per la vitrificazione e dopo il loro riscaldamento. Questo è stato fatto la misurazione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertito Eclipse TE2000-U	Nikon, Giappone	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Danimarca	/
Digital camera DC1	Research Instruments, Origio, Danimarca/
Digital camera DC2	Research Instruments, Origio, Danimarca	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Danimarca/		microscopio recording software
Incubatore con legante 6% CO2, 5% O2	, Germania	/
Primo Vision microscopio	Vitrolife, Svezia	16600
Software Primo Vision Capture	Vitrolife, Svezia	16608	software di registrazione time-lapse
Adobe Photoshop CS6 Software esteso	Adobe Systems Incorporated, USA/		software di analisi video
VirtualDub	Avery Lee	/	software di editing video
Microsoft Office Excell	Microsoft, USA/		editor di fogli di calcolo
PrimoVision piatto di coltura	Vitrolife, Svezia	16604
G2-plus medium	Vitrolife, Svezia	10132	terreno di coltura per embrioni allo stadio di blastocisti
Siero umano Albumine	Vitrolife, Svezia	10064
Olio di paraffina	Vitrolife, Svezia	10029
Mezzo soluzione di equilibrazione	Irvine Scientific, Irlanda	90131
vitrificazione	Irvine Scientific, Irlanda	90132
Mezzo di soluzione di disgelo	Irvine Scientific, Irlanda	90134
Mezzo di soluzione di diluizione	Irvine Scientific, Irlanda	90135
Mezzo di soluzione di lavaggio	Irvine Scientific, Irlanda	90136
Cannucce di vitrificazione HSV	CryoBio System, Francia	025246, 025249, 025250, 025248
Recipiente per azoto liquido	/
Cryo Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Germania	229286
Serbatoio criogenico	Cryotherm, Germania
Pinze	/	/
Forbici	/	/
Pippete per la manipolazione di blastocisti	Gynetics, Belgio	ID275/10	diametro 275 &; m
Pipetta per denudazione ovocita	Vitromed, Germania	V-DEN-135	diametro 135 & micro; m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Timer a intervalli digitale	Assistente Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	software di analisi statistica
Spelafili autoregolante	Knipex, Germania	1262180