Articolo metodologico

Analisi digitale dell'immunostaining delle proteine che interagiscono con la W10 nei tessuti polmonari umani

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DOI:

10.3791/58551

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1 maggio 2019

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1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

In questo articolo

Sommario

La proteina interagenti della W10 partecipa al checkpoint del mandrino mitotico e alla patogenesi del carcinoma. Qui, introduciamo una metodologia dell'immunostaining della WINT nei tessuti del cancro del polmone umano, seguita dalla scansione digitale di interi diapositive e analisi delle immagini. Questa metodologia può fornire immagini digitali di alta qualità e risultati affidabili.

Abstract

Lo scopo di questo studio è quello di introdurre una metodologia di immunostaining dei tessuti polmonari umani, seguita da scansione digitale e analisi delle immagini di inter-slide. La scansione digitale è un modo veloce per eseguire la scansione di una pila di diapositive e produrre immagini digitali di alta qualità. Può produrre risultati concordanti con microscopia leggera convenzionale (CLM) dai patologi. Inoltre, la disponibilità di immagini digitali rende possibile che la stessa diapositiva possa essere osservata contemporaneamente da più persone. Inoltre, le immagini digitali delle diapositive possono essere memorizzate in un database, il che significa che si evita il deterioramento a lungo termine dei vetrini di vetro. Le limitazioni di questa tecnica sono le seguenti. In primo luogo, ha bisogno di tessuto preparato di alta qualità e dei vetrini originali dell'immunosofia (IHC) senza danni o residui di sigillanti in eccesso. In secondo luogo, le aree tumorali o non tumorali devono essere specificate da patologi esperti prima dell'analisi utilizzando un software, al fine di evitare qualsiasi confusione sulle aree tumorali o non tumorali durante il punteggio. In terzo luogo, l'operatore deve controllare la riproduzione del colore durante tutto il processo di digitalizzazione nell'imaging a tutta la diapositiva.

Introduzione

La proteina interagenti w10 è una componente necessaria del complesso cinetochore che è coinvolto nel checkpoint del mandrino mitotico1,2,3. È stato riferito che l'esaurimento della WINT porta ad una segregazione aberrante del cromosoma precoce1,2,3. Recenti studi hanno suggerito che la WINT è coinvolta nella patogenesi di tumori multipli promuovendo la proliferazione delle cellule tumorali4,5. In precedenza abbiamo riportato la sovraespressione della WINT nel cancro ai polmoni5. È stato ampiamente accettato che l'analisi dei vetrini da parte dei patologi che utilizzano CLM richiede molto tempo e non quantitativa6,7,8. Inoltre, il deterioramento dei vetrini di vetro conservati potrebbe rendere impossibile ritrarre i vetrini creati in precedenza. Il metodo emergente di imaging digitale a diapositiva (WSI) basato su computer può superare queste limitazioni6,7,8.

A tal fine, descriviamo una metodologia dell'immunostaining della WINT nei tessuti del cancro del polmone umano, accoppiata con la scansione digitale a tutta diapositiva e l'analisi delle immagini basate su software. Il vantaggio principale di questa metodologia è la produzione di risultati concordanti con CLM. Questa tecnologia può essere ampiamente utilizzata nelle aree di punteggio patologico della colorazione ematossina-eosina (H&E) e IHC, della fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH), dei microarray tissutali (TMA) e della scoperta e sviluppo di farmaci.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale di Hongnan dell'Università di Wuhan e dall'Ospedale Renmin dell'Università di Wuhan.

1. Preparazione dei vetrini IHC

  1. Fissare il campione di tessuto polmonare immergendo il frammento di tessuto polmonare umano (circa 3 x 3 cm) nel 4% di paraformaldeide nella salina con buffer fosfato (PBS) per 24 h a temperatura ambiente (RT).
  2. Disidratare il tessuto in 80%, 95%, e 100% etanolo per 15 min, 20 min, e 20 min, rispettivamente, a temperatura ambiente. Infine, immergere il tessuto in 100% xilene 3x per 20 min ciascuno a temperatura ambiente.
  3. Per l'incorporamento, immergere il tessuto in paraffina (63 gradi centigradi) per 30 min. Infine, cambiare di nuovo la paraffina e immergere il tessuto in esso per altri 1 h.
  4. Utilizzare un microtoma rotativo per tagliare il tessuto in sezioni spesse 5 m e posizionarli su vetrini rivestiti in poli-lisina di 20 g/mL.
  5. Per il dewaxing, mettete i vetrini in un forno a 65 gradi per 2 h e poi immergete le sezioni in dimethylbenzene per 15 min, seguite da ammollo in 100% xilene per 15 min.
  6. Idratare i vetrini con le sezioni tissutali 2x per 5 min in 100% etanolo, seguito da un trattamento con etanolo diluito in serie di 5 min nel 95% di etanolo, 5 min nell'80% di etanolo, 5 min in 70% etanolo e 5 min in 50% etanolo.
  7. Eseguire la riparazione dell'antigene.
    1. Diluire il liquido di riparazione dell'acido citrico (20x) a 1x con H2O a doppia distillazione (ddH2O).
    2. Mettere i vetrini con le sezioni di tessuto e il liquido di riparazione dell'acido citrico 1x (300 mL) in una scatola di riparazione dell'antigene e, quindi, riscaldarli nel forno a microonde ad alta potenza per 2 minuti, seguito dal riscaldamento a bassa potenza per sostenere l'ebollizione per 6 min.
    3. Lasciare raffreddare le sezioni naturalmente a temperatura ambiente.
    4. Sostituire il liquido di riparazione dell'acido citrico con 0,01 M PBS, lavare le sezioni 3x, ogni volta per 5 min, nello shaker rotativo a temperatura ambiente.
  8. Eliminare la perossidasi endogena.
    1. Diluire il 30% di H2O 2-3% con ddH2O, aggiungerlo ai vetrini (assicurarsi che copra tutti i tessuti), e incubare i vetrini in una scatola umida a temperatura ambiente per 30 min.
      Nota: La scatola bagnata è una scatola di plastica di 10 x 15 cm e può contenere acqua.
    2. Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBS nello shaker rotante a temperatura ambiente.
  9. Bloccare l'antigene non specifico.
    1. Diluire il siero di capra normale concentrato al 10% di siero di capra con PBS con 0.1% Tween 20 (PBST).
    2. Aggiungere il 10% del siero di capra agli scivoli e incubarli nella scatola bagnata a 37 gradi centigradi per 30 min.
      Nota: Il siero di capra dovrebbe coprire tutti i tessuti nelle diapositive.
  10. Macchiare i tessuti.
    1. Incubare gli scivoli con anticorpo anti-uomo anti-zWINT (1:50) a 4 gradi centigradi durante la notte.
    2. Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBST (1 mL dello 0,1% Tween 20 in 1.000 mL PBS) nello shaker rotativo a temperatura ambiente.
    3. Incubare i vetrini con anticorpo secondario (sistema di rilevamento anti-coniglio, 1:200) per 30 min a 37 gradi centigradi.
    4. Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBST nello shaker rotante.
  11. Per visualizzare l'immunostaining, aggiungere i vetrini a 300 litri di 3,3 diaminobenzide freschi e, quindi, lavare i vetrini con acqua del rubinetto a temperatura ambiente.
    Nota: Il grado di tintura viene monitorato al microscopio (ingrandimento 10X - 40X).
  12. Contromacchiare il tessuto. Macchiare i vetrini con soluzione di colorazione ematossitale per 2 min a temperatura ambiente e, quindi, lavare i vetrini con acqua del rubinetto per 15 min.
    Nota: Il nucleo appare blu al microscopio (ingrandimento 10X - 40X). Se il grado di colorazione blu è più potente, la differenziazione dell'alcool cloridrico per 3 - 5 s può essere utilizzata, seguita dal risciacquo del tessuto in blu con acqua del rubinetto per 15 min per facilitare la colorazione prominente del tessuto.
  13. Disidratare i vetrini per 5 min nel 50% di etanolo, 5 min nel 70% di etanolo, 2x nell'80% di etanolo per 5 min, 5 min in 95% etanolo e infine 2x per 5 min ciascuno in 100% etanolo a temperatura ambiente.
  14. Per trasparenza, immergere le sezioni di tessuto in un serbatoio contenente 100% xilene per 15 min e trasferire le sezioni a un altro serbatoio contenente 100% xilene per 15 min a temperatura ambiente.
  15. Per la guarnizione, prendere 50 - 100 l di gomma neutra e aggiungere 5% xilene alla miscela (evitare di mescolare in bolle). Aggiungere 15 l della miscela di cui sopra alle sezioni del tessuto polmonare. Sigillare la pellicola con il vetro di copertura e premere delicatamente le bolle.

2. Scansione automatica delle diapositive IHC

  1. Lasciare asciugare i vetrini sigillati per 12 ore a temperatura ambiente per desicarli.
  2. Selezionare manualmente l'opzione Campo luminoso e immettere l'interfaccia di scansione manuale.
  3. Rivedere il nome delle diapositive e selezionare un percorso di archiviazione per le immagini.
  4. Impostare l'area di scansione e scegliere l'opzione Analizza campioni utilizzando soglie impostate dall'utente. La soglia è di circa 50 con un valore di espansione dell'area di scansione di 200 m.
  5. Impostare il valore dello stato attivo per la scansione, selezionare automaticamente lo stato attivo (compreso tra 1050 e 2650) e infine selezionare Modalità a livello singolo.
  6. Caricare le diapositive IHC sulla workstation e avviare la scansione automatica.
    Nota: Assicurarsi che le diapositive non siano danneggiate. Mantenere i vetrini puliti e traslucidi ed evitare polvere, coriandoli e residui di sigillante in eccesso sui vetrini. Lo scivolo di vetro e la coverslip devono essere privi di segni. Non pulire i vetrini con lo xilene. La dimensione delle diapositive è indicata nella tabella 1.
  7. Scansiona automaticamente l'intera sezione del tessuto su una diapositiva con un ingrandimento 20X, 40X o 100X.
  8. Raccogliere e memorizzare le immagini alla fine della scansione di diapositive intero.

3. Analisi delle diapositive mediante il software di imaging

  1. Avviare il software di analisi delle immagini istopatologiche e selezionare Computer locale.
  2. Aprire il file in cui sono memorizzati i dati di scansione.
  3. Selezionare il livello di zoom appropriato dall'intervallo 2X a 40X.
  4. Regolare il colore per impostare il contrasto ottimale tramite Attiva/disattiva regolazione colore.
  5. Cerchiare e assegnare un nome manuale alle parti di interesse su ogni immagine.
    Nota: Ad esempio, è possibile cerchiare un'area e denominarla Area tumore.
  6. Selezionare Plugin e QC. In questo momento, Scenario Builder si apre.
  7. Selezionare Densità quant e regolare la barra di rilevamento.
    Nota: Questo processo deve essere eseguito con attenzione. La barra della tolleranza blu viene utilizzata per regolare il colore del nucleo cellulare. La barra della tolleranza Marrone viene utilizzata per regolare la saturazione del colore di riempimento nell'immagine. I risultati delle immagini dopo le regolazioni devono essere coerenti con le controparti originali.
  8. Regolare i livelli di punteggio per rendere l'intensità di colorazione delle aree cerchiate simile a quella delle immagini originali.
    Nota: il marrone scuro indica un forte positivo, il giallo brunastro è moderatamente positivo, il giallo chiaro è debolmente positivo e il bianco è negativo.
  9. Archiviare e denominare il modello come file. Applicare il modello ad altre diapositive e selezionare Annotazioneselezionata".
  10. Lascia che il software calcoli automaticamente il punteggio H per le aree cerchiate nell'immagine.

4. Quantificazione dei punteggi utilizzando il sistema di punteggio H9,10

  1. Calcolare la percentuale di immunostaining e l'intensità di colorazione (0: negativo, 1: debole, 2: moderato, 3: forte).
  2. Utilizzare un sistema di punteggio (H-score) per calcolare il punteggio patologico del tumore e aree non tumorali adiacenti.
    Nota: punteggio H (% di cellule con intensità debole x 1) - (% di cellule con intensità moderata x 2) - (% di cellule con intensità forte x 3). Pertanto, il punteggio H massimo è 300 se il 100% delle cellule viene quantificato con forte intensità.

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Risultati

Abbiamo misurato i livelli di espressione di .WINT in 28 coppie di campioni di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) (tessuti tumorali e non tumorali adiacenti), tra cui 14 carcinomi a cellule squamose (SCC) e 14 adenocarcinomi (ADC), di IHC. La scansione digitale delle diapositive ha fornito immagini digitali di alta qualità (Figura 1A). I risultati hanno mostrato che il punteggio H del cancro del polmone era significativamente superiore a quello ...

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Discussione

La scansione a scorrimento intero sta diventando un argomento caldo per la sua robusta scansione e produzione di immagini di alta qualità per scopi clinici e di ricerca11,12,13. Le immagini possono essere prodotte da microscopi a scansione a scorrimento in pochi minuti11,12,13. Applicando questa metodologia, abbiamo ottenuto immagini di...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato sostenuto dalla National Natural Foundation of China (n. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 e 81501352) e dalla Natural Foundation of Hubei Province (Cina) (N. 2017CFB631). Gli autori esprimono il loro apprezzamento a Guo Qin, Chang Min, Li Hui e ai loro colleghi di Wuhan Google Biological Technology Co., LTD per il loro supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche Muhammad Jamal per il montaggio del linguaggio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pannoramic MIDI3D HISTECHCat: PMIDI-040709Uno scanner digitale automatizzato per vetrini con un notevole set di funzioni: capacità di 12 vetrini, scansione a fluorescenza e molti altri.
QuantCenter3D HISTECHScaricato dal sito ufficiale dell'aziendaIl framework per le applicazioni di analisi delle immagini di 3DHISTCH.
LEICA RM2235Leica MicrosystemsCat: 14050038604La maggiore precisione dei nuovi accessori aggiungerà comodità all'avvicinamento del blocco al coltello e all'orientamento del campione.
Anticorpo anti-ZWINT anti-ZWINT di coniglioAbcamCat: ab197794Analisi immunoistochimica di ZWINT nel tessuto polmonare umano.
Anticorpo secondario anti-coniglioWuhan Goodbio TechnologyCat:GB23303-1Anticorpo secondario per la colorazione IHC.
Soluzione salina tamponata con fosfatoWuhan Goodbio TechnologyCat:G0002Una soluzione contenente un tampone fosfato.
OLYMPUS CX23OLYMPUSCat:6M87620Microscopio per il rilevamento di H & E o diapositive IHC.
DimetilbenzeneShanghai Lingfeng Reagente chimicoCat: 1330-20-7Un fluido incolore e infiammabile utilizzato come solvente e agente chiarificante nella preparazione di sezioni di tessuto per lo studio microscopico.
Soluzione colorante con ematossilinaWuhan Servicebio technologyCat: G1039È comunemente usato per studi istologici, spesso colora i nuclei delle cellule di blu.
Tween 20BaitgCat:2005-64-5È un tensioattivo non ionico di tipo polisorbato formato dall'etossilazione del sorbitano prima dell'aggiunta di acido laurico. Viene utilizzato come deterrente ed emulsionante in applicazioni farmacologiche.
Il liquido di riparazione dell'acido citricoWuhan Servicebio technologyCat:G1202viene utilizzato per riparare l'antigene dopo la fissazione durante la procedura IHC.
LEICA ASP200sLeicaCat: 14048043626È stato progettato per l'istopatologia di routine e di ricerca fino a 200 cassette.
LEICA Arcadia HLeicaCat: 14039354103È una stazione di inclusione di paraffina riscaldata e consente un funzionamento semplice e un controllo preciso, con conseguente miglioramento della qualità, un flusso di lavoro regolare e affidabilità.
LEICA Arcadia CLeicaCat: 14039354102Si tratta di una piastra fredda che contiene più di 60/65 cassette sulla sua ampia superficie di lavoro. È stato progettato con un modulo di controllo adattivo all'ambiente per garantire che la temperatura di esercizio sia sempre stabilizzata a -6 °C.
Software CaseViewer3DHISTECH

Riferimenti

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

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