Vi presentiamo un flusso di lavoro ingegneria di genoma per la generazione di nuovi modelli in vitro per infezione da HIV-1 che ricapitolano integrazione proviral a selezionati siti genomici. Targeting dei reporter HIV-derivato è facilitato dalla manipolazione del genoma CRISPR-Cas9-mediata, site-specific. Sono disponibili protocolli dettagliati per cella singola clone generazione, lo screening e la corretta verifica targeting.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Basati su CRISPR-Cas9 genoma ingegneria per generare modelli di Jurkat Reporter per infezione da HIV-1 con integrazione Proviral selezionati siti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Virus di immunodeficenza umana (HIV) integra il DNA provirale non casualmente nel genoma della cellula ospite alle ricorrenti siti e genomico hotspot. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di nuovi modelli in vitro per l'infezione da HIV con siti di integrazione genomica selezionate utilizzando la tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Con questo metodo, una sequenza di reporter di scelta può essere integrata in un locus genomico mirato, selezionato, riflettendo siti di integrazione clinicamente rilevanti.
Nel protocollo, la progettazione di un reporter di HIV-derivato e scegliendo di una sequenza di destinazione sito e gRNA sono descritti. Un vettore targeting con braccia di omologia è costruito e transfected nelle cellule di T di Jurkat. La sequenza di reporter si rivolge al sito genomico selezionato tramite la ricombinazione omologa, facilitata da una pausa di doppio filo Cas9-mediata al sito di destinazione. Cloni unicellulari sono generati e proiettati per ottimizzazione degli eventi mediante citometria a flusso e PCR. Cloni selezionati vengono quindi espansi e targeting corretta viene verificato mediante PCR, sequenziamento e macchiare del sud. Vengono analizzati potenziali eventi fuori bersaglio di ingegneria CRISPR-Cas9-mediata del genoma.
Utilizzando questo protocollo, sistemi di coltura cellulare romanzo può essere generato l'infezione da HIV tale modello presso siti di integrazione clinicamente rilevanti. Anche se la generazione di cloni unicellulari e verifica dell'integrazione sequenza corretta reporter è lunghe, le linee clonali risultante sono potenti strumenti per analizzare in modo funzionale scelta del sito di integrazione proviral.
Introduzione
Integrazione del DNA provirale nel genoma ospite al momento dell'infezione è un passo fondamentale nel ciclo di vita del virus di immunodeficenza umana (HIV). A seguito di integrazione, l'HIV persiste attraverso la definizione di latenza in sottoinsiemi di cellule T CD4 + longevi come cellule T CD4 + di memoria. Integrazione di HIV sembra essere non casuale1,2. Un numero di hotspot genomico con DNA provirale ricorrentemente integrato è stato rilevato in parecchi studi attraverso il sequenziamento dei siti di integrazione in individui acutamente e cronicamente infettati2,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. strategia di targeting per genoma ingegneria e Targeting disegno vettoriale (tv)
Nota: Il primo passo di ingegneria genoma prevede selezione e generazione degli strumenti necessari per il CRISPR-Cas9-mediated targeting. Selezione di un locus di sito di integrazione genomica, scelta del tipo di cella per il targeting e progettazione di un reporter di HIV-derivati per l'integrazione deve precedere questo passaggio. Questo protocollo descrive il targeting di un reporter di minimo HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA in cellule bersaglio Jurkat. Un diagramma di flusso del flusso di lavoro basati su CRISPR-Cas9 targeting, generazione, selez....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo esperimento rappresentanza abbiamo scelto di indirizzare un reporter di HIV-1-derivati minimo composta un LTR, la sequenza tdTomato-codificazione e la sequenza di polyA-segnale a due loci in introne 5 del gene BACH217. I loci per il targeting sono stati scelti secondo la vicinanza ai siti pubblicati integrazione ricorrenti trovato in diversi studi su cellule T primarie da pazienti HIV-infettati2,4.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, descriviamo un protocollo per generare modelli di HIV-1-derivati Jurkat reporter con siti di integrazione proviral selezionate l'applicazione di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma.
Alcuni punti del protocollo richiedono attenzione durante la fase di pianificazione. In primo luogo, il luogo di destinazione dovrebbe essere scelto con attenzione, come alcuni loci potrebbero essere più facile bersaglio di altri (ad es., a seconda dello stato della cromatina della regione e la de.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Britta Weseloh e Bettina Abel per assistenza tecnica. Ringraziamo anche Arne Düsedau e Jana Hennesen (piattaforma tecnologica flusso cytometry, Heinrich Pette Institut) per il supporto tecnico.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vettore per l'espressione di SpCas9 e |
| gRNA pMK | GeneArt | vettore di espressione dei mammiferi per la clonazione | |
| di cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | vettore di espressione dei mammiferi per la clonazione |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | enzima di restrizione |
| NEBuilder Hifi DNA Kit di clonazione di assemblaggio | New England Biolabs | E5520S | Kit di clonazione di assemblaggio utilizzato per la generazione di vettori target |
| Sistema PCR di precisione TaqPlus | Agilent Technologies | 600210 | DNA polimerasi con attività di correzione di bozze utilizzata per l'amplificazione dei bracci di omologia (passaggio 1.2.2.2), verifica del sito di integrazione e della sequenza reporter (passaggio 3.3.3 e 3.3.5), generazione di sonda genomica per Southern blot (passaggio 3.4.1.5) e analisi di eventi fuori bersaglio (Passaggio 3.5.4) |
| Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti (fondo tondo) | TPP | 92097 | per placcatura di diluizione |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0530 L | DNA polimerasi utilizzata per il rilevamento di eventi di targeting (passaggio 2.4.2) e generazione di una sonda specifica per il reporter per Southern blot (passaggio 3.4.1.4) |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimetilsolfossido come PCR additivo |
| Soluzione di cloruro di magnesio (MgCl2) | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 come additivo per PCR |
| Miscela di soluzione di deossinucleotide (dNTP) New | England Biolabs | N0447S | dNTP con 10 mM di ciascun nt per reazioni di PCR |
| 5PRIME HotMasterMix 5PRIME | 2200400 | miscela PCR pronta all'uso utilizzata per lo screening della PCR (passaggio 3.2.11) | |
| Mini kit di sangue QIAamp DNA | isolamento e purificazione del DNA | Qiagen | 51106 |
| purificazione PCR QIAquick | purificazione PCR | Qiagen | 28106 |
| RPMI 1640 senza glutammina | Lonza | BE12-167F | terreno di coltura cellulare |
| Siero bovino fetale South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | integratore |
| di terreno di coltura cellulareL-glutammina | Biochrom | K 0282 | integratore di terreno per colture cellulari |
| Penicillina/Streptomicina 10.000 U/mL/ 10.000 &; g/mL | Biochrom | A 2212 | integratore di terreno per colture cellulari |
| Gibco Opti-MEM Terreni di coltura a siero ridotto | Thermo Fisher Scientific 31985062 | terreno per colture cellulari a concentrazione sierica ridotta ottimizzato per la trasfezione | |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | reagente per trasfezione |
| forbolo 12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | coltura cellulare reagente |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | reagente per colture cellulari |
| Unità filtrante azionata da siringa, membrana PES, 0,22 &; m | Millex SLGP033RB | per filtrazione sterile | |
| Incubatore Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | incubatore per colture tissutali |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | membrana in nylon caricata positivamente per il blotting di DNA e RNA |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | reticolante UV |
| High Prime | di 11585592001 | Roche per la marcatura del DNA con dCTP radioattivo utilizzando oligonucleotidi casuali come primer illustra le | |
| microcolonne ProbeQuant G-50 | GE Healthcare | 28-9034-08 | per cromatografia spin-columns per la purificazione del DNA marcato |
Riferimenti
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
