Articolo metodologico

Screening dei genotipi del cotone per la Resistenza ai Nematode Reniforme

DOI:

10.3791/58577

⸱

2 maggio 2019

 , 
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un protocollo per il rapido screening non distruttivo dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. Il protocollo prevede l'esame visivo delle radici delle piantine di cotone infettate dal nematode per determinare la risposta all'infezione. Il germoglio vegetativo di ogni pianta viene quindi propagato per recuperare gli impianti per la produzione di semi.

Abstract

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Un rapido protocollo di screening di nematode reniforme non distruttivo (Rotylenchulus reniformis) è necessario per lo sviluppo di varietà di cotone resistente (Gossypium hirsutum) per migliorare la gestione dei nematodi. La maggior parte dei protocolli prevede l'estrazione di nematodi vermiformi o uova dal sistema radicale del cotone o del suolo in vaso per determinare la densità della popolazione o il tasso di riproduzione. Questi approcci sono generalmente dispendiosi in termini di tempo con un piccolo numero di genotipi valutati. Un approccio alternativo è descritto qui in cui il sistema radicale viene esaminato visivamente per l'infezione da nematodi. Il protocollo prevede l'inocuculazione della piantina di cotone 7 giorni dopo la semina con nematodi vermiformi e la determinazione del numero di femmine attaccate al sistema radicale 28 giorni dopo l'inoculazione. I dati sono espressi come il numero di femmine per grammo di peso della radice fresca per regolare per la variazione nella crescita della radice. Il protocollo fornisce un ottimo metodo per valutare la resistenza delle piante ospiti associata alla capacità del nematode di stabilire un sito di infezione; tuttavia, la resistenza che ostacola la riproduzione dei nematodi non viene valutata. Come con altri protocolli di screening, la variazione è comunemente osservata nell'infezione da nematodi tra i singoli genotipi all'interno e tra gli esperimenti. I dati sono presentati per illustrare la gamma di variazioni osservate utilizzando il protocollo. Per adattarsi a questa variazione, i genotipi di controllo sono inclusi negli esperimenti. Ciò nonostante, il protocollo fornisce un metodo semplice e rapido per valutare la resistenza host-impianto. Il protocollo è stato utilizzato con successo per identificare le adesioni resistenti da parte del G. raccolta di germoplasma arboreo e valutare la separazione delle popolazioni di più di 300 individui per determinare la genetica della resistenza. È stato inoltre sviluppato un metodo di propagazione vegetativa per il recupero delle piante per l'allevamento di resistenza. Dopo la rimozione del sistema radicale per la valutazione dei nematodi, il germoglio vegetativo viene ripiantato per consentire lo sviluppo di un nuovo sistema radicale. Più del 95% dei germogli in genere sviluppano un nuovo sistema radicale con piante che raggiungono la maturità.

Introduzione

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Rotylenchulus reniformis (Linford e Oliveira), comunemente indicati come nematode reniforme, è una delle principali specie parassitarie di nematodi presenti nei suoli del sud-est degli Stati Uniti1,2,3. Il nematode è un semi-endoparassse obbligatorio e sedentario che richiede una pianta ospite per completare il suo ciclo di vita2,4. I nematodi femminili preadulti vermiforma penetrano nella radicedell'ospite per stabilire un sito di alimentazione nella stele 2,3. Man mano che il nematode si nutre e matura, la porzione posteriore rimasta al di fuori della radice ospite si gonfia alla produzione delle uova, formando una caratteristica forma renale (Figura 1). Rotylenchulus reniformis è in grado di nutrirsi del sistema radicale di oltre 300 specie vegetali, tra cui cotone4. Il cotone di montagna (Gossypium hirsutum L.) è ampiamente coltivato nel sud-est degli Stati Uniti, ma la mancanza di R. le varietà resistenti alla reniformis ostacolano la gestione dei nematodi2,3. Strategie di gestione come il trattamento dei nematici e la rotazione con specie di colture non ospiti sono state utilizzate per ridurre il suolo R. densità di popolazione reniformis 5,6, ma le perdite di rendimento del cotone da seme possono comunemente variare da 1 a 5%2. Sintomi di R. Infezione da reniformis può includere arresto delle piante, crescita radicata delle radici, carenze nutrizionali, aborto della frutta, e maturità ritardata2. Tuttavia, i sintomi possono non essere evidenti a causa dell'uniformità dei sintomi in tutto il campo; pertanto, gli approcci per valutare R. sono necessarie infezioni da reniformis per identificare e sviluppare varietà resistenti di cotone altopiano. Valutazione di R. La resistenza alla reniformis nel cotone è considerata difficile7, perché il sistema radicale infetto può apparire normale anche se la pianta può mostrare sintomi di infezione8.

Per l'identificazione di Rè necessario un protocollo efficace di screening dei nematodi. adesioni resistenti alla reniformis della collezione germoplasma del cotone e per la determinazione della genetica della resistenza per queste adesioni. Tale protocollo aiuterà a trasferire i geni della resistenza al cotone di montagna. Vari metodi di bioastipia sono stati utilizzati per valutare R. Infezione da reniformis nel cotone8,9,10,11,12,13,14,15. In generale, sono stati utilizzati due approcci principali per l'identificazione di R. genotipi di cotone resistenti alla reniformis. L'approccio più frequentemente utilizzato prevede l'estrazione di uova e/o nematodi vermiformi da piante infette o suolo8,11,12,14,15. La metodologia generale per questo approccio prevede la semina di semi per i singoli genotipi di cotone in vasi separati, permettendo alle piantine di svilupparsi per 7-14 giorni, inoculando le piantine aggiungendo una miscela di stadi vermiformi di R. reniformis al suolo, e permettendo ai nematodi di infettare il sistema radicale per 30-60 giorni. Successivamente, i nematodi vermiformina e/o le uova vengono estratti dal sistema radicale infetto di ogni pianta o dal terreno da vaso. Il numero di nematodi o uova estratti viene quindi determinato a stimare la densità di popolazione e il tasso di riproduzione, che vengono confrontati con i genotipi di controllo al fine di identificare i genotipi resistenti.

Un approccio alternativo, come descritto qui, prevede l'esame microscopio del sistema radicale del cotone che è stato infettato da nematodi per determinare il numero di nematodi femminili parassitizzando le radici10,16. Simile ad altri approcci, i genotipi di cotone vengono piantati in vasi separati e inoculati con nematodi vermiformi circa 7 giorni dopo la semina. Entro 30 giorni dall'inoculazione, il sistema radicale viene rimosso dalle singole piante e il terreno viene risciacquato dalle radici. Successivamente, i nematodi attaccati al sistema radicale sono macchiati con colorante rosso alimentare17, e le radici sono microscopicamente esaminate per determinare il numero di siti di infezione con genotipi di cotone resistenti (identificati in base al numero di nematodi per grammo di radice) rispetto a un controllo suscettibile16. Questo secondo approccio ha il vantaggio di aumentare la produttività riducendo il numero di giorni necessari per la valutazione e aumentando il numero di genotipi individuali valutati in un singolo esperimento. Le metodologie di screening che valutano la densità di popolazione o il tasso di riproduzione sono spesso più dispendiose in termini di tempo rispetto a quelle basate su osservazioni visive dei segni di infezione7. Tuttavia, una limitazione di questo approccio è che la resistenza delle piante ospiti che ostacola la riproduzione dei nematodi come determinato dalla produzione di uova non è valutata13.

Protocolli di screening per R. La resistenza ai reniformi spesso distrugge il sistema radicale durante la valutazione7 e comporta lo scarto del germoglio vegetativo. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato un metodo di propagazione vegetativa per consentire il recupero delle piante per la produzione di seme18. Dopo la rimozione del sistema radicale per la valutazione del nematode, il germoglio vegetativo viene piantato nel terreno da vaso per consentire al sistema radicale di ricrescere. Questo metodo ha ampie applicazioni per la maggior parte R. i protocolli di screening reniformis. Un metodo semplice e rapido di propagazione vegetativa è di fondamentale importanza per l'allevamento di R. varietà di cotone alto-alto resistente reniform, dove il recupero della progenie è necessario per far avanzare genotipi resistenti alla generazione successiva.

Viene presentato un protocollo per lo screening su larga scala dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. L'obiettivo è quello di sviluppare un metodo di screening semplice e rapido non distruttivo per valutare le popolazioni di allevamento del cotone per la resistenza ai nematodi al fine di aiutare nell'allevamento di varietà di cotone altopiano resistenti. Utilizzando questo protocollo, i dati vengono in genere ottenuti entro 35 giorni, con più di 300 genotipi valutati in un singolo esperimento. I dati sono presentati per genotipi resistenti e suscettibili per illustrare la variazione comunemente osservata con questi metodi.

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Protocollo

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1. Mantenimento di una fonte di R. reniformis Inoculo

  1. Riempire vasi di terracotta di argilla (15 cm di diametro, 13,5 cm di altezza) con un mix pastorizzato a vapore di 1-parte di telo sabbioso e sabbia 2 parti. Piantare una varietà di pomodoro suscettibile (Solanum lycopersicon) in ogni vaso e posizionare i vasi in una vetraia.
    NOTA: Al posto del pomodoro possono essere utilizzate altre varietà vegetali sensibili come il cotone.
  2. Inoculare le piante di pomodoro con nematodi reniformi vermiforme (vedi passo 3.3). Mantenere le piante nella vetrina ad una temperatura di circa 28 gradi centigradi.

2. Piantare genotipi di cotone per R. reniformis Valutazione della resistenza

  1. Preparare il terreno combinando sabbia fine a 2 parti con 1 parte di salone sabbioso raccolto dal campo.
  2. Vapore pastorizzare la miscela del suolo per garantire che il terreno è privo di nematodi e agenti patogeni vegetali suolo-borne.
  3. Aggiungere la miscela di terreno ai vasi di plastica conica (4 cm di diametro, 21 cm di altezza). Prima di riempire le pentole, mettere una palla di cotone sul fondo della pentola per prevenire la perdita di terreno. Riempire parzialmente i vasi con il terreno a circa 2 cm dall'alto.
  4. Preparare un palo di plastica per ogni vaso per designare il genotipo da piantare.
  5. Semi vegetali dei genotipi di cotone selezionati per la valutazione.
    1. Piantare un singolo seme in ogni vaso per la valutazione delle popolazioni che separano, in cui ogni seme rappresenta un genotipo unico.
    2. Per le varietà di cotone o le nemostate, piantare da 2 a 3 semi in un unico vaso per assicurare la germinazione di almeno una pianta con le altre piantine rimosse dai vasi prima dell'inoculazione dei nematodi.
      Nota: In alternativa, i semi possono essere germinati per 24 a 72 h prima di piantare per ridurre al minimo il numero di vasi con semi non vitali.
  6. Semi vegetali di genotipi di controllo resistenti e suscettibili selezionati.
    Nota: I genotipi di controllo vengono replicati da 5 a 10 volte per valutare le variazioni naturali inerenti alla metodologia di screening.
  7. Riempire vasi con terreno aggiuntivo per coprire il seme in ogni pentola.
  8. Posizionare i vasi nella camera di crescita. Mantenere una temperatura costante di 28 gradi centigradi, una temperatura dell'aria ambiente, per la camera di crescita. Fornire un'illuminazione artificiale con una miscela di lampade fluorescenti e incandescenti con un fotoperiodo di 16 ore.
  9. Mettere gli emettitori d'acqua in ogni vaso e innaffiare i vasi due volte al giorno utilizzando un sistema di irrigazione automatico. Regolare il sistema di irrigazione per fornire acqua supplementare man mano che la pianta cresce.

3. Inoculazione nematode di piante di cotone e preparazione di campioni di radici

  1. Estrarre nematodi reniformi vermiformi mantenuti su piante di pomodoro suscettibili (vedi punto 1) utilizzando elutriazione19 e filazione centrifuga20 metodologie il giorno prima dell'inoculazione. Conservare i nematodi estratti a 4 gradi centigradi.
    NOTA: l'estrazione a imbuto Baermann21 è un metodo alternativo per l'estrazione dei nematodi.
  2. Determinare il numero di nematodi estratti contando il numero di nematodi in un sottocampione da 100 e preparare una sospensione di 1.000 nematodi/mL nell'acqua del rubinetto per le vaccinazioni.
  3. Inoculare le piantine di cotone 7 d dopo aver piantato con la sospensione del nematode. Creare una piccola depressione nel terreno accanto alla pianta, e pipetta 1 mL della sospensione nematode reniforme nella depressione.
  4. Rimuovere le piante dai vasi 28 d dopo l'inoculazione per la valutazione del nematode.
    NOTA: In questa fase, le piante sono alte circa 15 cm con 4-6 foglie completamente espanse.
    1. Rimuovere la maggior parte delle foglie completamente espanse dalle piante utilizzando le forbici prima di rimuovere le piante dai vasi.
    2. Per rimuovere le piante dai vasi, spremere il vaso e far scorrere il terreno nella mano.
    3. Rimuovere delicatamente il terreno dalle radici agitando l'impianto radicale nell'acqua del rubinetto in un contenitore da 10 L. Risciacquare brevemente il sistema radicale in un contenitore di acqua di rubinetto pulita.
    4. Rimuovere il sistema radicale dalla pianta circa 1 cm sotto la linea del suolo utilizzando le forbici.
  5. Collocare il sistema radicale in un contenitore di campioni monouso in plastica da 120 ml e non sterile insieme alla puntata di plastica della pentola utilizzata per l'identificazione.
    NOTA: più campioni vengono elaborati prima di procedere al passaggio 3.7. Procedere al passaggio 4 per la propagazione vegetativa del tiro dell'impianto.
  6. Preparare una soluzione del 12,5% (v/v) di cibo rosso colorando17 in acqua di rubinetto per macchiare i nematodi attaccati al sistema radicale.
  7. Aggiungere circa 30 mL della soluzione di colorazione degli alimenti rossi al campione di radice nel contenitore del provino per coprire completamente il sistema radicale.
  8. Mettere il contenitore del provino in un forno a microonde e riscaldare il campione di radice fino a quando la soluzione di colorazione inizia a bollire. Togliere il campione dal forno a microonde e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.
  9. Decantare la soluzione di colorazione alimentare rossa dal campione radice e aggiungere circa 100 mL di acqua di rubinetto al contenitore del campione per rimuovere la macchia in eccesso. Collocare il coperchio sul contenitore del provino e conservarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi. Procedere al passaggio 5 per la valutazione dell'infezione da radicale.
    NOTA: il protocollo può essere sospeso qui prima di procedere al passaggio 5.

4. Propagazione vegetativa per il recupero di impianti per la produzione di semi

  1. Mettere una palla di cotone sul fondo di un vaso di plastica conica (vedi passo 2.3) e riempire parzialmente la pentola con mezzi di scoppio del muschio di torba. Quindi, mettere il tiro vegetativo nel vaso e aggiungere saldamente i supporti da vaso per riempire il piatto. Inserire una nuova posta in plastica etichettata in ogni vaso per designare il genotipo di cotone.
  2. Mettere il vassoio di vasi in un contenitore di plastica (lunghezza 73,6 cm x 45,7 cm di larghezza x 15,2 cm di altezza) con acqua e innaffiare brevemente le piante per inumidire il supporto in vaso. Collocare i vasi in una camera di crescita con una temperatura costante di 28 gradi centigradi utilizzando un fotoperiodo di 16 h. Aggiungere ulteriore acqua al contenitore di plastica in base alle esigenze per mantenere l'umidità del suolo.
  3. Trapiantare le piante in vasi più grandi per la produzione di semi dopo circa 30 d. Riempire parzialmente un vaso di plastica 6 L con mezzi di vaso (vedi passo 4.1), rimuovere la pianta dal piccolo vaso, posizionare la pianta nel vaso 6 L, e aggiungere saldamente i supporti da vaso per riempire il vaso.
  4. Mettere le piante in una serre e aggiungere acqua per inumidire il supporto in vaso. Mantenere la temperatura nella vetrina a circa 28 gradi centigradi (l'illuminazione artificiale non è necessaria).
    1. Piante d'acqua a mano, se necessario, per circa 30 d.
    2. Quando circa il 75% delle piante richiede l'irrigazione quotidiana, le piante d'acqua ogni giorno utilizzano un sistema di irrigazione automatico. Regolare il sistema di irrigazione automatico per innaffiare più frequentemente in base alle esigenze per la crescita delle piante.
    3. Aggiungere circa 10 g di fertilizzante a rilascio lento in ogni vaso prima dell'inizio dell'iniziazione floreale.
  5. Raccogliere le piante alla maturità ed elaborare i campioni di semi di cotone per ottenere i semi per un'ulteriore valutazione.
    1. Per raccogliere i semi di cotone, rimuovere il cotone dalle bolls aperte sulla pianta a mano e metterlo in un sacchetto di carta etichettato. I semi sono attaccati alle fibre di cotone, che vengono rimossi nei seguenti passaggi.
    2. Rimuovere le fibre di lamint dai campioni di semi utilizzando un gin da laboratorio da 10 sega.
    3. Rimuovere le fibre fuzz dai campioni di semi utilizzando acido solforico concentrato. Neutralizzare i campioni di semi in una soluzione del 15% (v/v) di carbonato di sodio, risciacquare i campioni con acqua del rubinetto e asciugare i campioni in un essiccatore ad aria forzata.
    4. Collocare i campioni di semi in buste etichettate per l'archiviazione.

5. Valutazione di R. reniformis Infezione della radice

  1. Rimuovere il campione di radice dal contenitore del provino e contare il numero di nematodi femminili attaccati al sistema radicale utilizzando uno stereomicroscopio (ingrandimento 20X).
    NOTA: Solo i nematodi reniformi femminili sono in grado di infettare le radici delle piante.
  2. Posizionare l'impianto radicale su carta assorbente per circa 10 min per rimuovere l'umidità in eccesso. Pesare il sistema radicale per determinare il peso della radice fresca.
  3. Inserisci il numero di nematode e i dati sul peso della radice in un programma di fogli di calcolo del computer e calcola il numero di femmine per grammo di radice.

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Risultati

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Rotylenchulus reniformis infezione del sistema radicale per due varietà è presentato Figura 1. Relativamente meno nematodi reniformi femminili sono in grado di stabilire un sito di alimentazione per il genotipo di cotone resistente rispetto al genotipo suscettibile. La variazione della crescita delle radici è comune tra le adesioni, come illustrato nella Figura 2. Questa variazione misurata dal peso fresco delle radici p...

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Discussione

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È necessario un protocollo di screening efficace per 1) l'identificazione di R. genotipi di cotone resistenti alla reniformis al fine di valutare la genetica della resistenza e 2) l'allevamento di varietà resistenti. La maggior parte dei protocolli valuta R. reniformis densità di popolazione o tassi di riproduzione estraendo nematodi vermiformi o uova dal sistema di radici di cotone o terriccio8,11,...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, Servizio di Ricerca Agricola. Menzione di nomi commerciali e prodotti commerciali in questo articolo sono esclusivamente allo scopo di fornire informazioni specifiche e non implicano raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro. Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare. L'assistenza tecnica è stata fornita da Kristi Jordan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ray Leach Cone-tainerStuewe e figli Inc.SC10U
Vassoio cone-tainerStuewe and Sons Inc.RL98
Carteggiarevari
batuffoli di cotonevarie
etichette per piante da 4 pollici Pylon (4 in L x 5/8 in W)Pylon PlaticsL-4-WQualsiasi marca o fornitore è accettabile.
Contenitori per campioni da 4 onceFisher Scientific16-320-731Qualsiasi marca o fornitore è accettato.
Colorante alimentare rossoMcCormick & Co., Inc.
Punte per pipette da 1 mLvari
contenitori da 10 Lvarisecchi economici funzionano bene.
Vasi da 6 LNursery Supplies Inc.Poly-Tainer-Can No2AQualsiasi marca o fornitore è accettabile. È possibile utilizzare vasi di diverse dimensioni
Terreni di invasaturaSun Gro HorticultureMetro-Mix 360Qualsiasi marca o fornitore è accettabile.
FertilizzanteEverris NA Inc.Osmocote PlusQualsiasi marca o fornitore è accettabile.
Contenitore in plastica (73,6 cm L x 45,7 cm L x 15,2 cm P)Rubbermaid3O29 Qualsiasi marca o fornitore è accettabile.

Riferimenti

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