Un protocollo dettagliato per l'applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.
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Articolo metodologico
Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una completa identificazione di RNA-binding proteins (RBPs) è la chiave per comprendere la rete di regolamentazione post-trascrizionale in cellule. Una strategia ampiamente utilizzata per la cattura RBP sfrutta la poliadenilazione [poli (a)] di RNA bersaglio, che si verifica principalmente su mRNA maturo eucariotico, lasciando la maggior parte delle proteine leganti di non-poly(A) RNA non identificato. Qui descriviamo le procedure dettagliate di un metodo recentemente segnalato chiamato click chimica-assistita RNA-Interactoma acquisire (CARIC), che consente di acquisire tutto il trascrittoma RBPs sia poli (a) e non-poly(A) combinando l'etichettatura metabolica del RNA, in vivo UV cross-linking e bioorthogonal tagging.
Introduzione
Il genoma umano è trascritto in vari tipi di RNA codificanti e non codificanti (ncRNAs), tra cui mRNA, rRNA, tRNA, piccole molecole di RNA nucleare (snRNAs), piccole molecole di RNA nucleolare (snoRNAs) e lungo non-codificazione RNAs (lncRNAs)1. La maggior parte di questi RNA possiedono abbigliamento di RBPs e funzionare come ribonucleoproteina particelle (RNP)2. Pertanto, una completa identificazione di RBPs è un prerequisito per la comprensione della rete regolamentare tra RNAs e RBPs, che è implicata in varie malattie umane3,4,5
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Protocollo
Attenzione: Quando applicabile, i reattivi utilizzati devono essere acquistati sotto forma di RNAsi-libera, o disciolti in RNAsi-libera, solventi (per la maggior parte dei casi, in pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata). Durante la manipolazione di campioni di RNA e reagenti RNAsi-libera, sempre indossare guanti e maschere e cambiarle frequentemente per evitare la contaminazione RNasi.
1. preparazione del lisato di metabolicamente etichettati e cellule reticolate UV
-
Metabolica incorporazione dell'UE e 4SU
- Cellule HeLa di cultura dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% ....
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Risultati
Vengono presentati i risultati rappresentativi dei passaggi di controllo di qualità. I risultati includono figure dell'analisi di fluorescenza in gel descritto al punto 2.3.2 (Figura 1), l'analisi di western blot descritto al punto 4.1.3 (Figura 2A) e l'analisi di macchiatura d'argento descritto al punto 4.2.2 (Figura 2B). La procedura di controllo di qualità è fondamentale per l'ottimizzazione dei p.......
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Discussione
Il mantenimento dell'integrità di RNA fiera è una delle chiavi del successo esperimenti CARIC. Con appropriati ligandi di Cu (i) e funzionamento attento, degradazione del RNA può essere significativamente ridotto, sebbene degradazione parziale è stata osservata. I rapporti di sostituzione dell'UE e 4SU in campioni sperimentali sono 1,18% e 0,46%, rispettivamente (dati non mostrati). Per RNA intatto con una lunghezza di 2.000 nt, ~ 90% di RNA contengono almeno un UE e uno 4SU. Per RNAs parzialmente degradato con una lungh.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation di Cina sovvenzioni 91753206, 21425204 e 21521003 e di National Key Research and Development Project 2016YFA0501500.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Siero fetale bovino) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillina & Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-etiniluridina) | Wuhu Huaren Co. | CAS: 69075-42-9 | |
| 4SU (4-tiouridina) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10 volte PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| reticolante UV | UVP | CL-1000 | Dotato di lampada UV da 365 nm |
| DEPC (pirocarbonato di dietile) | Sigma Aldrich | D5758 | Per trattare l'acqua. Altamente tossico! |
| Tris· HCl, pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA | Thermo Fisher Scientific | 88265 | Una compressa per tampone di lisi da 50 mL. |
| LDS (Litio dodecil solfato) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| da 15 ml (cutoff 10 kDa) | Millipore | UFC901024 | |
| 0,5 mL (cutoff 10 kDa) | Millipore | UFC501096 | |
| Perle magnetiche di streptavidina | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimetilsolfossido) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotina | Clicca Strumenti di Chimica | AZ104 | |
| Solfato di Rame (II) | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris (3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Ascorbato di sodio | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Clicca Strumenti di Chimica | AZ118 | |
| Tampone campione LDS (4 volte) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific AM9260G | ||
| RNasi A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodio dodecil solfato) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Poliossietilene (20) oleil etere] | J& K | 315442 | |
| Trietanolammina | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidina agarosio | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sale sodico) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotina | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Desossicolato di sodio | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Versione: 1.5.5.1 |
Riferimenti
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
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Ristampe e permessi
