Method Article

Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive

DOI:

10.3791/58588

⸱

January 7th, 2019

 , 
1Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

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Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l'efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.

Abstract

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Fuse e - proteine fluorescenti convertibile (PA-FPs) sono state utilizzate in microscopia a fluorescenza cellule vive per analizzare la dinamica di cellule e proteine Ensemble. Finora, nessun metodo è stato disponibile per quantificare in massa e in vivo le cellule espresso quanti del PA-FPs sono fotoattivazione di fluorescenza.

Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge righelli interni, vale a dire, geneticamente accoppiato spettralmente distinta (fuse) proteine fluorescenti, a ratiometrically quantificare la frazione di tutte le PA-FPs espresse in una cellula che sono accesi per essere fluorescente. Usando questo protocollo, mostriamo che diverse modalità di fotoattivazione dato fotoattivazione diverse efficienze. Fotoattivazione breve ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) ha provocato fino a quattro volte inferiore fotoattivazione efficienza di centinaia di esposizioni a basso livello applicate da CLSM o un breve impulso applicato da widefield illuminazione. Mentre il protocollo è stato esemplificato qui per GFP (PA-) e (PA-) Cherry, può in linea di principio essere applicato a qualsiasi coppia di proteina fluorescente fuse o fotoconvertibile spettralmente distinta e qualsiasi set-up sperimentale.

Introduction

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Nel 2002, il primo ampiamente applicabili fuse (PA-GFP1) e fotoconvertibile (Kaede2) proteine fluorescenti sono stati descritti. Queste proteine fluorescenti ottico evidenziatore modificarne le proprietà spettrali all'irradiazione con luce UV, cioè, essi diventano luminose (proteine fluorescenti fuse, cioè, PA-FPs), o cambiare il loro colore (fotoconvertibile FPs). Fino ad oggi, diversi reversibile e irreversibile fuse e fotoconvertibile proteine fluorescenti sono stati sviluppati3,4. Negli studi ensemble o alla rinfusa, evidenziatori ottici son....

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Protocol

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1. plasmide costruzione

  1. Generare due colori fusione sonde. Utilizzare un vettore di espressione di cellule di mammifero (Vedi Tabella materiali) nel quale mCherry112 e PA-mCherry113 sono stati inseriti con la restrizione siti AgeI e BsrGI.
  2. Ordine personalizzato oligo-nucleotidi per amplificare le varianti monomeriche di eGFP e PA-eGFP contenente la mutazione A206K, vale a dire, mEGFP e PA-mEGFP14 senza un codone di arresto come un frammento di SalI-BamHI . Utilizzare il primer N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC A....

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Results

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Il protocollo presentato qui indica la quantificazione raziometrici della frazione di proteine fluorescenti che sono fotoattivazione di essere fluorescente (Figura 1). Questa frazione differisce secondo la modalità di fotoattivazione.

Un risultato tipico utilizzo breve tempo fotoattivazione ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) è mostrato in Figur.......

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Discussion

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Finora, nessun metodo ha esistito per determinare in massa la frazione di PA-FPs espressa in cellule vive che è fotoattivazione di essere fluorescente. Il protocollo presentato può essere utilizzato per qualsiasi coppia di proteina fluorescente spettralmente distinta. Mentre esemplificato qui per l'irreversibile PA PA-FPs-GFP e PA-Cherry, questo approccio è in linea di principio applicabile alle proteine fotoconvertibile pure. La proteina fluorescente spettralmente distinta, tuttavia, dovrà essere selezionata con attenzi.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare il laboratorio Dorigo e il servizio di Imaging di Neuroscienze presso la Stanford University School of Medicine per fornire attrezzature e lo spazio per questo progetto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
vettore di espressione di cellule di mammifero pEGFP-N1Clontech
DMEM senza rosso fenoloThermo Fisher Scientific11054020
tripsina senza rosso fenoloThermo Fisher Scientific15400054
L-glutammina (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081
HEPESThermo Fisher Scientific15630080
Camere LabTek a 8 pozzetti #1.0Thermo Fisher Scientific12565470
Fugene 6PromegaE2691

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.

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Photoactivatable Fluorescent ProteinsFluorescent Protein QuantificationConfocal Laser Scanning MicroscopyWidefield IlluminationGenetic CouplingInternal RulersPhotoactivation EfficiencyLive Cell ImagingFluorescence MicroscopySpectrally Distinct Proteins

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