Sintesi degli elastomeri molli polisilossano-urea per applicazione di lente intraoculare

Cataratta senile, che colpisce il gruppo di età ≥ 60 anni, conduce all'avanzati opacizzazione del cristallino naturale. Questa condizione relativa all'età è probabilmente causata da cambiamenti ossidativi che vengono accelerati da UV irradiazione^1,2,3. Il trattamento convenzionale per cataratta senile coinvolge l'estrazione chirurgica della lente cataractous, seguita dall'impianto di una lente intraoculare artificiale (IOL) in un obiettivo vuoto capsula tramite un sistema di iniezione². Tuttavia, una maggioranza di IOLs sono fabbricati da polimeri acrilici (acrilato idrofobo e idrofilo o polimeri in metacrilato) con strutture estremamente rigide; quindi, l'occhio perde la sua capacità di adattarsi alle varie distanze^2,4. Pertanto, i pazienti con impianti IOL monofocali dipendono da occhiali per visione da vicino (ad es., durante la lettura di un giornale o un libro)⁵.

Diversi metodi per ripristinare la capacità di alloggio dopo chirurgia della cataratta sono stati segnalati. Tra questi approcci, si possono distinguere due principali strategie: riempire la capsula vuota lente iniettando un liquido o gel-come polimeri e sviluppare morbido, pieghevole a IOLs^6,7,8. Il concetto di "lente ricarica" è promettente perché gel può essere preparata con moduli di Young bassi quanto quelli della naturale occhio umano lente (ca. 1-2 kPa)⁹; Tuttavia, questo approccio è ancora in fase sperimentale⁸e studi sono condotti solo su occhi animali.

Capsule di lente ricaricati impiantando in silicone gonfiabili palloncini¹⁰ riempito con silicone liquido o iniettando direttamente in silicone^11,12 , che successivamente è stata curata nella capsula via idrosililazione . Tuttavia, questioni legate alla superficie rughe i palloncini, una minore ampiezza di alloggio rispetto allo stato preoperatorio e la formazione di cataratta secondaria severa (opacification della capsula anteriore e posteriore) sono state noto^{7, 8,12,13}. In particolare, tempi di lunga stagionatura (70 min - 12 h) causano un rischio aumentato di perdita negli alloggiamenti del occhio circostante, che porta a infiammazione postoperatoria^10,14. Altri materiali per la sostituzione del cristallino si raccomanda pertanto, compresi idrogeli basati su polietilene glicol diacrilato, copolimeri di acrilato-modificato di vinile alcool (N-vinilpirrolidone)¹⁵, metacrilato-modificato polisilossani^16,17, poloxamer¹⁸e diisocianato-reticolato polialcoli⁹. Tuttavia, la viscosità di monomero (cioè, gel gonfiore dopo l'iniezione e la reticolazione), indici di rifrazione estremamente bassi o alti, stabilità meccanica e integrità, imprevedibile rifrazione postoperatoria, bassa gamma di alloggi, e la formazione della post-cataratta costituiscono le principali questioni^{6,7,8,9,15,18}. Commercialmente, la capacità di alloggio viene ripristinata principalmente sviluppando pieghevole a IOLs. Tali a-IOLs dovrebbe fornire alloggio dal movimento dello IOL ottico al sito anteriore della lente capsula tramite la contrazione del muscolo ciliare. Diversi modelli sono stati introdotti sul mercato nel 1996, 2001, e 2002^7,8. Tuttavia, durante gli studi clinici, le ampiezze di alloggio stimato per quelli impiantati a IOLs erano estremamente bassa (≤ 1,5 D) per consentire seduto da solo lettura (3-4 D)^{6,7,8,19 , 20}. di conseguenza, un a-IOL comprendente due ottiche collegato (dual-ottica IOL) è stato sviluppato per aumentare l'alloggio gamma^6,21. Il design della sola lente è stato esaminato per le sue prestazioni accommodative in occhi umani, anche se i risultati contraddittori sono stati segnalati^22,23,24,25.

In genere, elastomeri di silicone sono considerati di essere biologicamente inerte e non tossico; di conseguenza, gli elastomeri siliconici hanno una lunga storia di essere applicato come materiali biocompatibili in medicina e ingegneria medica (ad es., in mammarie, craniofacial impianti, protesi congiunta, medicazioni, cateteri, drenaggi e shunt) ^{26 , 27}. grazie alla loro morbidezza, la trasparenza e la permeabilità all'ossigeno alta, elastomeri di silicone anche trovano applicazioni come lenti a contatto e IOLs^2,28,29. Tuttavia, siliconi devono essere in covalenza reticolati e spesso richiedono rinforzanti per guadagnare sufficiente integrità meccanica. Reticolazione è svantaggioso come esso vieta la successiva elaborazione di elastomeri mediante metodi termoplastici (ad es., stampaggio ad iniezione) o di elaborazione da soluzioni (ad es., solvente casting). Al contrario, poliuretani termoplastici esibiscono stabilità meccanica ma sono suscettibili di degradazione all'interno dell'ambiente biologico, specialmente se basati su poliestere o polietere macrodiols sono usati. Pertanto, gli sforzi per combinare flessibilità e stabilità idrolitica o ossidativa con eccellenti proprietà meccaniche sono concentrati sull'incorporazione di idrossile - o ammino funzionali PDMS come segmenti molli in poliuretani, poliuretano-uree, e poliuree²⁷. Per migliorare la compatibilità del segmento duro uretano o urea polare con un segmento di morbido PDMS altamente non polare e per migliorare le proprietà meccaniche, diversi basati su polietere macrodiols sono incorporati con PDMS^{30,31 ,32}. In particolare, il gruppo di Thilak Gunatillake ha studiato sistematicamente lo sviluppo dei poliuretani in silicone con una migliore biostabilità e proprietà meccaniche per applicazioni biomediche a lungo termine quali l'isolamento dello stimolatore cardiaco o artificiali cuore valvole³³. Hanno sintetizzato poliuretani aromatici con segmenti molli misti composto da PDMS terminazione dell'idrossile e diversi polieteri, come pure in policarbonato alifatici dioli. Tra tutti i poliuretani sintetizzati, la combinazione di Poliesametilene ossido (PHMO) e PDMS mostre le migliori proprietà meccaniche rispetto al difficile segmento compatibilità³⁰. Negli studi successivi, hanno ulteriormente esaminato l'effetto del rapporto PDMS-a-PHMO e l'incorporazione di un estensore di catena disiloxane-basato sulle proprietà meccaniche del silicone poliuretani^{34,35, 36}. i risultati hanno rivelato che una composizione di macrodiol di 80 wt % PDMS e 20 wt % PHMO, oltre a un extender di co-catena, ad esempio 1,3-bis(4-hydroxybutyl)-tetramethyldisiloxane (BHTD), produce poliuretani più morbidi con buone proprietà meccaniche e termoplastico processabilità. Inoltre, questi in silicone-poliuretani esibiscono un biostabilità avanzata rispetto ad una comunemente applicata morbido polietere uretano^37,38,39.

La biocompatibilità e la stabilità dei materiali simili e il loro utilizzo per applicazioni cardiovascolari sono stati anche segnalati^40,41,42. Basato su questi risultati, a base di silicone poliurea elastomeri (o PSU) con un estensore di catena disiloxane-based sono pensati per resa elevata flessibilità e morbidezza, seppur con sufficiente resistenza meccanica, di mantenere la loro forma dopo l'applicazione del sforzo ripetuto. Per esempio, Hermans et al hanno costruito un prototipo sperimentale base poliuretanica dual-ottica a-IOL perché il design, che è stato utilizzato in precedenza per una fabbricazione usando il silicone, era estremamente morbido per gestire i carichi applicati all'interno enucleated maiale occhi⁴³.

Questo articolo descrive la sintesi di una morbida base di silossano PSU, che è ottimizzato in termini di proprietà meccaniche ed ottiche per applicazioni come una IOL accomodante. Come le proprietà meccaniche degli elastomeri PSU sono modificabile mediante il peso molecolare di silossano, la stessa procedura può essere applicata allo sviluppo di base di silossano PSU, che può trovare applicazioni in rivestimenti e condimenti di pelle. Inoltre, questa procedura consente di preparare il poliuretano a base silossanica o elastomeri di poliuretano-urea se terminazione carbinol PDMS è usato. A seconda del tipo di diisocianato (cioè, alifatici o aromatici) utilizzato per la sintesi, le condizioni di reazione (tra cui forse la composizione del solvente, la temperatura e tempo) potrebbero essere necessario essere modificato. Per l'applicazione di diisocianati alifatici come 4,4-methylenebis(cyclohexylisocyanate) (H₁₂MDI) o isoforone diisocianato, la reazione deve essere accelerato utilizzando un catalizzatore di organostannici, come dibutilstagno dilaurato o distannoxane diacetoxytetrabutyl. Ad esempio, la reazione tra una terminazione hydroxypropyl PDMS e H₁₂MDI procede in presenza di un catalizzatore. Inoltre, la temperatura di reazione deve essere aumentata a 50-60 ° C. Per l'applicazione di un diisocianato aromatico come 4,4-methylenebis(phenylisocyanate) (MDI), la temperatura di reazione deve essere moderatamente ma sufficientemente aumentata come diisocianati aromatici sono in genere più reattivi verso gruppi nucleofili rispetto diisocianati alifatici sono. La reazione di MDI con PDMS carbinol terminazione può essere promosso utilizzando miscele di solventi di tetraidrofurano anidro (THF) e dimetilformammide (DMF) o dimetilacetammide (DMAc) come ammine terziarie esibiscono alcune attività catalitica.

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Diversi prodotti chimici utilizzati nella sintesi presentano tossicità acuta e forte irritazione alla pelle e gli occhi, così come su inalazione. Si prega di indossare indumenti protettivi (camici da laboratorio, occhiali protettivi, guanti, pantaloni lunghi e scarpe chiuse) e gestire i prodotti chimici, se possibile, sotto cappa aspirante o in luogo ben ventilato. Eseguire tutte le sintesi sotto la cappa. Idrossido di tetrametilammonio pentaidrato (TMAH): TMAH è una base forte, acutamente tossica in caso di ingestione e a contatto con la pelle, che provoca gravi ustioni chimiche sulla pelle e occhi. Esso è sensibile all'aria ed è igroscopico. Conservarlo sotto refrigerazione e azoto. A causa del suo forte odore di ammoniaca-come di gestire TMAH in luogo ben ventilato. APTMDS: APTMDS è sensibile all'aria e devono essere conservati sotto azoto. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H₁₂MDI: H₁₂MDI è tossico su inalazione e provoca irritazione alla pelle e occhi. D₄: D₄ può ridurre la fertilità. THF: THF è nocivo, provoca irritazione su inalazione e presumibilmente è cancerogeno. Cloroformio (CHCl₃): CHCl₃ è nocivo per inalazione, presumibilmente cancerogena, possono causare possibili danni alla fertilità e un bambino del unborn ed i relativi vapori può provocare sonnolenza.

1. sintesi del catalizzatore e Macromonomers di polisilossano ammino-terminato

1. Sintesi del catalizzatore tetrametilammonio-3-aminopropyl-dimethylsilanolate
   Nota: Il catalizzatore è stato sintetizzato secondo il metodo segnalato da Hoffman e Leir⁴⁴.
   1. APTMDS di Degas sotto vuoto prima di utilizzare e conservarlo sotto azoto. Pipettare circa 10 g di APTMDS usando una siringa.
   2. Aggiungere 8,13 g (33.0 mmol) di degassato APTMDS e 11,88 g (66.0 mmol) di TMAH in un pallone a sfondo sferico tre colli 100 mL. Aggiungere 20 mL di THF per sciogliere APTMDS e sospendere TMAH, insieme a un grande ovale ancoretta magnetica.
      Attenzione: TMAH è una sostanza igroscopica, corrosiva e tossica con un forte odore di ammoniaca-come e deve essere conservato ben chiuso in frigorifero. Pesare TMAH immediatamente in un luogo ben ventilato; indossare guanti protettivi e occhiali di sicurezza durante la manipolazione. APTMDS aria sensibile e provoca ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Pesare APTMDS da una bottiglia sigillata usando una siringa; indossare guanti protettivi e occhiali di sicurezza durante la manipolazione.
   3. Dotare i tre colli pallone con un condensatore a riflusso e ingressi e uscite per azoto e calore la miscela di reazione a 80 ° C, utilizzando una glicerina o bagno di riscaldamento olio di silicone. Mescolare la miscela di reazione per 2 h sotto riflusso e con un flusso di azoto leggero, continuo.
      Nota: La sospensione iniziale, leggermente torbida passa a una soluzione chiara entro 2 h.
   4. Rimuovere il condensatore a riflusso e distillare i THF utilizzando un aspiratore. Quindi, asciugare il prodotto grezzo leggermente giallo sotto vuoto di 0,1 mbar per 5 ore a 70 ° C, utilizzando una linea di Schlenk.
      Nota: Dopo questo passaggio, il prodotto grezzo può essere conservato in frigorifero a 10 ° C fino al giorno seguente.
   5. Risospendere il prodotto grezzo in 50 mL di THF. Se necessario, utilizzare una spatola per suddividere grandi agglomerati e filtrare la sospensione utilizzando un aspiratore. Lavare il precipitato almeno 3 volte con 20 mL di THF, fino a quando il prodotto diventa un solido polvere-come bianco.
   6. Asciugare il prodotto sotto vuoto di 0,1 mbar a temperatura ambiente per 3 h. Quindi, conservare il catalizzatore in frigorifero a 10 ° C sotto azoto fino all'utilizzo.
2. Sintesi di Α, ω-bis(3-aminopropyl)-polydimethylsiloxanes
   Nota: Sintesi di PDMS, con un peso molecolare di ~ 15.500 g · mol^-1.
   1. Degas D₄ e APTMDS sotto vuoto prima dell'uso. Pipettare circa 1,5 g di APTMDS, usando una siringa.
   2. Aggiungere 19,5 g (65,7 mmol) di degassato D₄ e 0,9 g (3,6 mmol) di APTMDS in un pallone a sfondo sferico di tre colli di 100ml, è dotato di un agitatore centrifugo rivestite in PTFE e un azoto entrata ed uscita.
   3. Aggiungere ~ 26 mg del catalizzatore (dalla sezione 1.1) e mescolare la miscela di reazione per 30 min a 80 ° C sotto un flusso di azoto leggero, continuo.
      Nota: Un olio di glicerina o silicone riscaldamento vasca può essere utilizzato.
   4. Aggiungere goccia a goccia 45,5 g (153.4 mmol) di D₄ per la miscela di reazione, utilizzando un imbuto separatore (entro 2-3 h) e mescolare ulteriormente a 80 ° C per 24 h in un flusso continuo di azoto.
      Nota: La reazione può procedere durante la notte.
   5. Riscaldare la miscela di reazione fino a 150 ° C e mescolare per 2 h per decomporre il catalizzatore. Quindi, consentire il PDMS raffreddare a temperatura ambiente.
   6. Scambiare l'agitatore centrifuga con un ancoretta magnetica ovale grande e sigillare il tre colli pallone con due tappi. Usare un adattatore con una valvola e riscaldare lentamente il PDMS a 150 ° C sotto vuoto di 0,1 mbar per distillare fuori i lato ciclico prodotti utilizzando una linea di Schlenk. Consentire il PDMS raffreddare a temperatura ambiente.
      Nota: Distillazione sotto vuoto si verifica in genere in 4-5 h.
3. Sintesi di α, ω-bis(3-aminopropyl)-polidimetil-metil-phenylsiloxane
   Nota: Questa sezione descrive la procedura di sintesi per un polisilossano con un peso molecolare di ~ 15.500 g · mol^-1 e 14 mol % metil-fenil silossanici; Questa procedura è paragonabile alla sintesi PDMS, che è descritto nella sezione 1.2.
   1. Degas D₄ e APTMDS sotto vuoto prima dell'uso. Pipettare circa 1,5 g di APTMDS usando una siringa. Luogo D₄^{Me, Ph} a 70 ° C per 3-5 h in una camera sottovuoto per sciogliere completamente e di omogeneizzare il prodotto prima dell'uso.
   2. Aggiungere 4,54 g (15,3 mmol) di D₄, 14,96 g (27,5 mmol) di D₄^{Me, Ph}e 0,9 g (3,6 mmol) di APTMDS in un pallone a sfondo sferico di tre colli di 100ml, è dotato di un agitatore centrifugo rivestite in PTFE e un azoto entrata ed uscita.
   3. Aggiungere ~ 26 mg del catalizzatore (dalla sezione 1.1) e mescolare la miscela di reazione a 80 ° C per 30 min sotto un flusso continuo di azoto.
   4. Aggiungere goccia a goccia 45,5 g (153.4 mmol) di D₄ nella miscela di reazione, utilizzando un imbuto separatore (entro 2-3 h) e mescolare ulteriormente a 80 ° C per 24 h in un flusso continuo di azoto.
      Nota: La reazione può procedere durante la notte.
   5. Procedere con la sintesi seguendo la procedura descritta 1.2.5 e 1.2.6.

2. peso molecolare determinazione di polisilossano

1. Peso molecolare teorico di polisilossano
   1. Calcolare il peso molecolare teorico di polisilossano secondo la seguente equazione:
      (1)
      Qui, è il peso molecolare medio numerico di polidimetilsilossano, m è la massa (g) dei monomeri usati D₄ e APTMDS, e n è la quantità di APTMDS in moli.
2. Determinazione del peso molecolare di polisilossano di ¹H-NMR spettroscopia
   1. Sciogliere 10-20 mg di polisilossano in 0,5 mL di CDCl₃, registrare il suo spettro NMR e calibrare gli spostamenti chimici [δ] al segnale solvente a 7,26 ppm.
   2. Calcolare il peso molecolare di polisilossano dai valori integrali secondo la seguente equazione.
      (2)
3. Determinazione del peso molecolare di polisilossano per titolazione
   1. Aggiungere 1,5-2 g di polisilossano in una beuta da 250 mL e scioglierla in 50 mL di THF sotto agitazione continua utilizzando un ancoretta magnetica.
   2. Titolare di gruppi amminici con 0.1 M HCl con blu di bromofenolo, fino a quando un colore cambia dal blu al giallo è osservato. Ripetere la titolazione con tre campioni per calcolare il peso molecolare medio numerico.

3. sintesi degli elastomeri di polisilossano-urea

Nota: Questa sezione descrive la procedura di sintesi per un elastomero di urea PDMS-basato del contenuto di segmenti duri 10 w % (% HS) (PDMS: 15.500 g · mol^-1).

(3)

1. Aggiungere g 2,939 (11,2 mmol) di H₁₂MDI in un matraccio da quattro-collo rotondo-fondo reazione 250 mL, che è dotato di un agitatore centrifugo rivestite in PTFE, eliminazione di imbuto e azoto entrata ed uscita e scioglierla in 20 mL di THF.
   Attenzione: H₁₂MDI è un diisocianato di volatile basso e provoca irritazione alla pelle e occhi. Indossare guanti protettivi e occhiali di sicurezza.
   Nota: In alternativa, sciogliere H₁₂MDI in THF in un becher da 50 mL e aggiungere la soluzione attraverso un imbuto o un bicchiere tulipano nel pallone di reazione. Poi, risciacquare il becher e imbuto con 10 mL di THF.
   1. Sciogliere 45,0 g (2,9 mmol) di degassato PDMS in 100 mL di THF; Aggiungere goccia a goccia la soluzione nella soluzione H₁₂MDI utilizzando un imbuto separatore sotto agitazione continua e un flusso di azoto a temperatura ambiente. Sciacquare il bicchiere e rilasciando imbuto con 50 mL di THF e aggiungere questa soluzione alla miscela di reazione.
   2. Controllare la formazione del prepolimero tramite spettroscopia FTIR.
      Nota: I progressi di reazione possono essere monitorati in due modi: utilizzando in linea o non in linea spettroscopia ATR-FTIR.
      1. Per inline ATR-FTIR spectroscopy, inserire una sonda di ATR-FTIR in linea, che è collegata allo spettrometro, lo snodo centrale all'inizio della reazione. Utilizzare un ancoretta magnetica ovale grande invece di un agitatore rivestite in PTFE. Iniziare a registrare gli spettri della soluzione MDI H₁₂e selezionare il picco di assorbimento di NCO a 2266 cm^-1 a seguire la conversione dei gruppi isocianati.
      2. Per spettroscopia ATR-FTIR non in linea, prendere campioni di miscela di reazione usando una pipetta di Pasteur e aggiungere poche gocce sul cristallo ATR. Evaporare il solvente sotto un flusso di azoto fino a una sottile pellicola rimane sulla superficie del cristallo ATR. Registrare spettri alle fasi di reazione diversa (dopo l'aggiunta completa di PDMS e dopo l'aggiunta di ogni porzione di APTMDS).
   3. Aggiungere alla soluzione prepolimero porzioni della quantità stechiometrica dell'estensore di catena APTMDS.
      Nota: L'aggiunta dell'estensore di catena può procedere in due modi (vedere i passaggi 3.1.3.1 e 3.1.3.2).
      1. Sciogliere la quantità pesata dell'estensore di catena in 5-10 mL di THF e aggiungere goccia a goccia la soluzione per la miscela di reazione, utilizzando una pipetta Pasteur o utilizzando un imbuto, seguito da un risciacquo nuovamente con 3 mL di THF.
      2. Aggiungere parti dell'estensore di catena in una siringa e aggiungere goccia a goccia l'estensore di catena alla miscela di reazione. In questo caso, sigillare la giunzione quarta usando un tappo di gomma del setto.
         1. Aggiungere 1,65 g (6,6 mmol) di APTMDS, pari all'80% dell'importo calcolato di APTMDS, per il prepolimero. Quindi, controllare la reazione progressi tramite spettroscopia FTIR.
         2. Aggiungere 0,21 g (0,8 mmol) di APTMDS (in totale, 90% dell'importo calcolato) alla miscela di reazione, quindi controllare l'andamento della reazione di FTIR.
         3. Aggiungere 0,1 g (0,4 mmol) di APTMDS (in totale, 95%) alla miscela di reazione e controllo la reazione procede utilizzando FTIR.
         4. Infine, l'ultima parte dell'estensore di catena (0,102 g, 0,41 mmol) di aggiungere alla miscela di reazione e verificare la scomparsa della banda di assorbimento di NCO nello spettro FTIR.
            Nota: Dopo l'aggiunta della parte prima dell'estensore di catena, è osservato un aumento della viscosità.
   4. Versare la soluzione PSU in un bicchiere di PTFE-lamina-coperto di Petri e far evaporare il solvente durante la notte sotto la cappa. Inoltre, asciugare l'alimentatore in una camera a vuoto a 80 ° C per 12 h.

4. meccanica procedura di collaudo

1. Preparazione di polisilossano-urea elastomero film
   1. Sciogliere 7-8 g di piccoli pezzi PSU in 200-250 mL di CHCl₃ in una beuta da 300 mL, vagamente tappare il matraccio con un tappo di vetro e mescolare il composto utilizzando un ancoretta magnetica per almeno 24 h. Se necessario, aggiungere ulteriori porzioni di solvente.
      Attenzione: Il cloroformio è presumibilmente cancerogeno. Vapori può provocare sonnolenza su inalazione. Gestire il cloroformio in un luogo ben ventilato.
   2. Aggiungere la soluzione omogenea in un bicchiere di Petri e coprirlo con un foglio di alluminio forato. Lasciare evaporare lentamente sia inserendo la capsula di Petri in un luogo ben ventilato o in una cappa aspirante con la finestra a ghigliottina aperta il solvente.
      Nota: Quando si inserisce la capsula di Petri nella cappa, diminuire il flusso d'aria se possibile. Estremamente rapida evaporazione del solvente porta alla disomogeneità e la formazione di macchie opache nei film trasparente.
   3. Asciugare la pellicola a 80 ° C in una camera a vuoto per 12 h.
   4. Con attenzione rimuovere la pellicola dalla superficie del vetro con una piccola spatola sottile e conservare la pellicola PSU all'interno di una busta trasparente al successivo utilizzo per la caratterizzazione meccanica.
2. Prove di sollecitazione-deformazione su polisilossano-urea film di elastomero
   1. Preparare gli esemplari di fustellati a forma di osso cane dalle pellicole PSU secondo Keiper⁴⁵ (tipo S2). Posizionare la pellicola PSU, che è coperto da lamine di busta, sotto un'unità di punzonatura coltello con una forma come mostrato nella Figura 4. Spingere la leva verso il basso per perforare il provino e memorizzarlo per almeno 72 h a temperatura ambiente (23 ± 2 ° C).
   2. Accendere la macchina per prove di trazione e il computer. Avviare il software cliccando sull'icona. Selezionare il metodo come prova di trazione e verifica se la cella di carico corretto (100 N) viene installata nella macchina di prova.
   3. Selezionare l' Assistente di metodo e verificare se tutti i test le impostazioni sono corrette. Vai a pre-test e verifica se sono attivate le seguenti impostazioni: la lunghezza del campione originale (L₀) a 20 mm, il precarico a 0,1 MPa e la velocità fino a precarico viene raggiunta a 5 mm/min.
   4. Vai al test parametro e verifica se sono attivate le seguenti impostazioni: la velocità per la determinazione del modulo di Young a 1 mm/min, la velocità fino alla rottura del campione a 25 mm/min, la rilevazione della rottura del campione al 80% F_max, il determinazione del modulo di Young in regressione, l'inizio della determinazione di modulo di Young al 2% di deformazione e alla fine della determinazione di modulo di Young al 6% di deformazione. Lasciare l' Assistente di metodo e passare alla finestra principale del software.
   5. Premere il pulsante di accensione la macchina di prova e fare clic sul pulsante Vai alla posizione di partenza nella finestra principale del software.
   6. Rimuovere la pellicola di protezione e controllare il risultato della prova sotto un croce-polarizzatore per escludere eventuali tensioni interne. Misurare lo spessore di campione e la larghezza del campione utilizzando un calibro. Quindi, inserire i valori per larghezza e spessore del campione nei campi corrispondenti nella finestra principale del software.
   7. Fissare il campione di prova tra le ganasce di serraggio superiore della macchina di prova. Fare clic sul pulsante forza zero nella finestra principale del software. Fissare l'estremità inferiore del provino tra il fondo ganasce della macchina di prova.
      Nota: Se le superfici delle ganasce di serraggio sono scivolose, posizionare l'estremità del provino tra carta abrasiva di grana fine per evitare che l'esemplare scivoli durante la misurazione.
   8. Fare clic sul pulsante avviare la misurazione per avviare la prova di trazione.
   9. Dopo aver completato la misura, procedere con i passaggi 4.2.6 e 4.2.7. Dopo aver sistemato il provino tra le ganasce di bloccaggio superiore e selezione forza zero, selezionare il pulsante Vai alla posizione di partenza nella finestra principale del software. Fissare l'estremità inferiore del provino tra il fondo ganasce di serraggio, quindi fare clic su avviare la misurazione nuovamente.
   10. Ripetere i passaggi 4.2.6 - 4.2.8 per un esemplare PSU almeno una x 3 ulteriori per la valutazione statistica di modulo di Young, resistenza alla trazione e l'allungamento a rottura.
3. Prove di isteresi su film elastomero PSU
   1. Accendere la macchina per prove di trazione e il computer. Avviare il software cliccando sull'icona. Selezionare il metodo come prova di trazione ciclico e verificare l'installazione della cella di carico corretto (100 N) nella macchina di prova.
   2. Selezionare l' Assistente di metodo e verificare se tutti i test le impostazioni sono corrette. Vai a pre-test e verifica se sono attivate le seguenti impostazioni: la lunghezza del campione originale (L₀) a 20 mm, il precarico a 0,05 MPa e la velocità fino a precarico viene raggiunta a 5 mm/min.
   3. Andare per il parametro di prova e verifica l'attivazione delle seguenti impostazioni: il numero di cicli a 10, il valore nominale di carico al 100% di deformazione, il setpoint scarico a 0% di deformazione e la velocità a 25 mm/min lascia l' Assistente di metodo e passare alla finestra principale del software.
   4. Procedere con procedura 4.2.5 - 4.2.8.
   5. Ripetere le misurazioni di isteresi con due esemplari per la valutazione statistica. Calcolare l'isteresi meccanica per ogni ciclo secondo la seguente equazione.
      (4)

5. procedura coltivazione di cellule HaCaT

1. Scaldare un stoccaggio provette criogenia con cellule HaCaT e Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) in bagnomaria a 37 ° C. Sotto il banco da lavoro di sicurezza microbiologica, trasferire rapidamente la sospensione cellulare in una provetta conica per centrifuga 10ml, che viene riempita con DMEM caldo.
   1. Sottoporre la sospensione cellulare a centrifugazione per 6 min a 845 x g. Scartare una maggioranza del surnatante utilizzando un bicchiere usa e getta pipetta di Pasteur, che è collegato a una pompa a vuoto, e risospendere il pellet cellulare nel liquido restante pipettando delicatamente gli agglomerati di cellule su e giù per mezzo di una pipetta di Eppendorf.
   2. Trasferire le cellule sedimento in un pallone di cultura cellulare di 25cm² e aggiungere 9 mL di DMEM, che è completato con 10% FBS. Incubare le cellule a 37 ± 1 ° C e 5% CO₂ nell'incubatrice mobile. Controllare la proliferazione delle cellule al giorno utilizzando un microscopio invertito. Cambiare il DMEM ogni terzo giorno fino a quando le cellule diventano subconfluent.
   3. Eseguire un passaggio di cella sotto il banco da lavoro di sicurezza rimuovendo il DMEM utilizzando un pipetta Pasteur di vetro monouso. Aggiungere 10 mL di tampone PBS per lavare lo strato delle cellule. Rimuovere il tampone PBS utilizzando un pipetta Pasteur di vetro monouso nuovamente.
   4. Aggiungere 1 mL di una soluzione di tripsina/EDTA nel matraccio di cultura 25 cm² cella per staccare le cellule e incubare li nell'incubatore CO₂ CAB. Verifica se le cellule sono presenti in sospensione, utilizzando un microscopio invertito.
   5. Aggiungere 3 mL di DMEM nel matraccio di cultura cellulare per inattivare la tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per centrifuga e sottoporre le cellule a centrifugazione per 6 min a 845 x g. Rimuovere una maggioranza del surnatante, utilizzando un pipetta Pasteur di vetro. Risospendere le cellule in DMEM il restante e aggiungere 10 mL di DMEM caldo fresco, che è completato con 10% FBS.
   6. Trasferire 5 mL di sospensione cellulare in ciascuno dei matracci di cultura di 75cm² cella e aggiungere 15 mL di DMEM caldo fresco, completati con 10% FBS. Coltivare le cellule HaCaT a 37 ± 1 ° C e 5% CO₂ nell'incubatore CO₂ mobile fino a quando le cellule diventano subconfluent.
   7. Ripetere il passaggio delle cellule secondo passi 5.1.3 - 5.1.6 ma questa volta, utilizzare 2 mL di una soluzione di tripsina/EDTA e 6 mL di DMEM per inattivare la tripsina.

6. procedura per un'analisi di attuabilità delle cellule MTS usando le cellule HaCaT

Nota: Test di citotossicità In vitro sono stati eseguiti secondo Wenzelewski⁴⁶, utilizzando estratti medio delle cellule. Esempi di PSU e biomedica-grado in poliuretano sono stati sterilizzati con ossido di etilene.

1. Coltura di cellule HaCaT a 37 ± 1 ° C e 5% CO₂ in DMEM, che è completato con 10% FBS in un matraccio di cultura cellulare² 75 cm. Utilizzare le celle per i test di citotossicità in vitro , almeno dopo il quarto passaggio.
   1. Aggiungere campioni sterili di PSU e un materiale di riferimento (0,7 g) in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL ed estrarre i campioni con DMEM, senza FBS, per 72 ± 2 ore a 37 ° C e 5% di CO₂ con un rapporto di estrazione di 0,1 g/mL. Utilizzare tre estratti per ogni campione PSU. Preparare campioni ciechi riempiendo DMEM, senza FBS, in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL ed eseguire l'estrazione stessa.
   2. Il giorno 2 della procedura di estrazione, eseguire distacco cellulare secondo passi 5.1.3 - 5.1.5 con 2 mL di tripsina/EDTA e 6 mL di DMEM. Prendere un 100 µ l aliquota della sospensione cellulare e aggiungere 100 µ l di DMEM. Da questa sospensione diluita, prendere 20 µ l di aliquota e aggiungere 10 µ l di una soluzione di blu di trypan 0,5% a macchiare le cellule morte.
   3. Incubare le cellule per 2 min riempimento l'emocitometro utilizzando una micropipetta e immediatamente contare le celle all'interno delle quattro camere. Calcolare il numero di cellule vitali e non vitali per valutare la vitalità cellulare in percentuali.
      Nota: In alternativa, le cellule possono essere contati utilizzando una sistema di conteggio della cella.
   4. Seme HaCaT cellule (quarto passaggio) ad una concentrazione di 20 x 10³ cellule/pozzetto in 200 µ l di DMEM in 96 pozzetti e incubare le cellule per 24 h a 37 ° C e 5% CO₂.
   5. Il giorno 3, dopo l'estrazione, aggiungere 10% FBS per ogni estratto e cieco campioni e scaldare i campioni fino a 37 ° C con un bagno d'acqua. Rimuovere il DMEM da ciascuno seminato bene e sostituire il mezzo di estratti, campioni ciechi e i corrispondenti controlli positivi e negativi. Per ogni alimentatore estrarre (uso tre estratti per ogni campione PSU), Pipettare 200 µ l di estratto in sei pozzi.
   6. Dispensare 200 µ l del campione cieco (DMEM + 10% FBS) in sei pozzi. Dispensare 200 µ l di DMEM freschi, completati con 10% FBS (controllo negativo), in sei pozzi. Dispensare 200 µ l di controllo positivo (DMEM + 10% FBS + 1% SDS) in sei pozzi. Incubare le cellule con i controlli per 24 h a 37 ° C e 5% CO₂e gli estratti.
      Nota: Per la preparazione di un controllo positivo, preparare una soluzione di SDS 20% in acqua e diluirla con DMEM a 1:2. Quindi, diluire ulteriormente con DMEM per preparare una soluzione di SDS 1%.
   7. Il giorno 4, poco prima della fine del tempo di incubazione, è necessario preparare una soluzione stock di MTS e DMEM senza FBS (per ciascun pozzetto, uso 20 µ l di soluzione MTS + 100 µ l di DMEM). Dopo il tempo di incubazione, rimuovere l'estratti, soluzioni ciechi e controlli e pipettare 120 µ l della soluzione madre MTS in ciascun pozzetto, così come in sei pozzi senza celle per determinare lo sfondo. Incubare le cellule per 4 h a 37° C e 5% CO₂.
   8. Il giorno 4 dopo l'incubazione della soluzione MTS, misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 492 nm, utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre l'assorbanza misurata dello sfondo da quella dei pozzi seminati. Si supponga che i valori di assorbanza misurato dal controllo positivo rappresentano 0% proliferazione e impostare tali valori di assorbanza a 0. Si supponga che i valori di assorbanza misurato dal controllo negativo rappresentano 100% proliferazione e impostare tali valori a 100.
   9. Calcolare la proliferazione delle cellule dai valori di assorbanza come percentuale dei valori di assorbanza dal controllo negativo (100% proliferazione) e il controllo positivo (0% proliferazione). Valutare gli estratti di campione che esibiscono la proliferazione delle cellule fino al 81% come non citotossici.
      Nota: Secondo informazioni⁴⁷, del fornitore misurare l'assorbanza di più tardi. Pipettare 25 µ l di una soluzione di 10% SDS in ciascun pozzetto per fermare la reazione e memorizzare la micropiastra per fino a 18 h al riparo dalla luce a temperatura ambiente in una camera umidificata.

L'equilibrazione anello-catena di D4 e D4Me, Ph con il endblocker APTMDS ha reso amminopropil terminato polydimethylsiloxanes e polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimeri, rispettivamente, che sono stati sintetizzati con i pesi molecolari tra 3.000 e 33.000 g · mol-1 di regolazione del rapporto di monomero tra D4 e APTMDS (Figura 6). Pesi molecolari del PDMS preparati, che sono stati determinati da spettri 1H-NMR (Figura 5), erano simili ai valori ottenuti da titolazione. Questi valori erano in accordo con i pesi molecolari teorici calcolati fino a 15.000 g · mol–1. Durante la preparazione del PDMS con pesi molecolari superiori, i pesi molecolari ottenuti sono stati leggermente superiori a quelli presunti di calcolo teorico. La copolimerizzazione dei silossani ciclici con ciondolo fenilico gruppi D4Me, Ph è stata considerata riuscita per aumentare leggermente l'indice di rifrazione di polisilossani. L'indice di rifrazione (determinato utilizzando il rifrattometro di Abbe a 37 ° C) è aumentato da 1,401 (non modificato PDMS) a 1.4356 (14 mol % metil-fenil-silossano) (Figura 7). Gli elastomeri PSU sono stati sintetizzati in due passaggi utilizzando il preparato amminopropil terminato PDMS, diisocianato alifatico H12MDI e APTMDS, usando il THF come solvente. Questo metodo consentito la costruzione di alimentatori ad alto peso molecolare con una struttura segmentata di segmenti molli (PDMS) e segmenti duri (diisocianato + urea). Spettroscopia FTIR Inline ha confermato la reazione estremamente rapida dei gruppi isocianato con i gruppi amminici dal PDMS e l'estensore di catena APTMDS (Figura 3 e Figura 8). A differenza di preparazione dei elastomeri poliuretanici, che richiede diverse ore, la preparazione degli elastomeri PSU era conveniente. La trasparenza e le proprietà meccaniche degli elastomeri PSU erano dipendenti dal peso molecolare PDMS. Pellicole trasparenti di elastomero PSU ha esibito una trasmittanza di > 90% fino a un peso molecolare PDMS di 18.000 g · mol-1. A più alti pesi molecolari PDMS, le pellicole PSU sono diventato sempre più opache (Figura 9). Con l'aumento del peso molecolare PDMS, morbidi elastomeri PSU potrebbero essere preparati. Il modulo di Young di elastomeri PSU è diminuito da ~5.5 MPa (con un peso molecolare PDMS di 3.000 g · mol-1) a 0,6 MPa (con un peso molecolare PDMS di ≥ 26, 000 g · mol-1) (Figura 10). Inoltre, isteresi meccanica, che è stato utilizzato per valutare la stabilità meccanica sotto ripetute sollecitazione applicata, è stato ridotto per gli elastomeri PSU quando erano preparati da PDMS di alto peso molecolare. I valori di isteresi per il primo ciclo a un ceppo di 100% è diminuito da 54% (con un peso molecolare PDMS di 3.000 g · mol-1) a 6% (con un peso molecolare PDMS di 33.000 g · mol-1) (Figura 11). Il metodo di sintesi applicata consentito la preparazione degli elastomeri PSU che non rilasciano residui citotossici come gli esempi riportati in test di vitalità cellulare eseguita con gli estratti di alcuni elastomeri PSU selezionati sulle cellule HaCaT (Figura 12).

Figura 1: Sintesi del catalizzatore tetrametilammonio-3-aminopropyl-dimethylsilanolate.
Idrossido di tetrametilammonio pentaidrato (TMAH) e 1,3-Bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS) sono state reagite 2h in THF a 80 ° C. Il catalizzatore di tetrametilammonio-3-aminopropyl-dimethylsilanolate viene ricevuto come un solido bianco dopo aver lavato il prodotto grezzo con THF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: percorso di sintesi per amminopropil terminato polydimethylsiloxanes (PDMS) e polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimeri. Monomeri ciclici D4/D4Me, Ph sono equilibrati utilizzando un endblocker disiloxane APTMDS a 80 ° C per 24 h utilizzando il catalizzatore di tetrametilammonio-3-aminopropyl-dimethylsilanolate. Questa figura è stata modificata da Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: sintesi in due fasi di elastomeri segmentato urea a base di polisilossano (PSU). Nel primo passaggio, un prepolimero contenenti gruppi isocianati attivo è formato dopo la reazione di H12MDI con amminopropil terminato Polisilossano (R = CH3: PDMS; R = Ph; copolimero). Nel secondo passaggio, il peso molecolare del polimero è aumentato tramite la reazione dei restanti gruppi isocianato attivo con l'estensore di catena APTMDS. L'elastomero risultante è un polimero segmentato composto da segmenti duri dell'urea e segmenti molli del silicone. Questa figura è stata modificata da Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: specifica del cane-a forma di osso provino per prove di sforzo-. Questa figura è stata modificata da Keiper45. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: 1H-NMR spettro di polidimetilsilossano amminopropil terminato. Per il calcolo del peso molecolare, valori integrali del metilene protoni d (δ 2,69 ppm) e b (δ 0,56 ppm) e metil protoni un (δ ~ 0,07 ppm) sono stati utilizzati. Il picco c (δ ~1.5 ppm) è overlaid dal HDO picco49, corrispondente allo scambio di protoni di tracce d'acqua con solvente CDCl3; quindi, questo picco non viene utilizzato per calcolare il peso molecolare. Il peso molecolare PDMS in questo spettro è ~ 16.365 g · mol-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Correlazione lineare tra il peso molecolare di concentrazione amminopropil terminato di polydimethylsiloxanes ed endblocker. i valori sono stati determinati tramite 1H-NMR spettroscopia, la titolazione di gruppi amminici terminali e il calcolo teorico secondo l'equazione (1). Questa figura è ristampata con il permesso da Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: indici di rifrazione di amminopropil terminato polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimeri. Indici di rifrazione (RI) di polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimeri erano risoluti a 20 ° C (quadrati neri) e 37 ° C (cerchi rossi) usando un rifrattometro di Abbe. I valori di RI aumentati linearmente con la quantità delle unità fenil-metil-silossano incorporato. Valori di RI a 0% in moli rappresentano quelli da PDMS non modificato con un peso molecolare comparabile ai polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimeri. Un'ottimale RI di 1.4346 (37 ° C) è stata ottenuta per un copolimero con 14% in moli di metil-fenil-silossano. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: isocianato conversione durante la sintesi di polidimetilsilossano-urea (PSU). Questa figura mostra un terreno dipendente dal tempo della banda di assorbimento di NCO a 2.266 cm1 seguita dalla spettroscopia FTIR-ATR inline durante la sintesi del PSU. Dopo l'aggiunta di polidimetilsilossano amminopropil terminato, è diminuita l'altezza della banda NCO, indicativo della formazione delle catene prepolimero terminato NCO. Dopo l'aggiunta dell'estensore di catena APTMDS, la band di NCO completamente è sparito dagli spettri IR. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Riehle et al. 50. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: dipendenza della trasmittanza di elastomero PSU film al 750 nm e il peso molecolare di polidimetilsilossano. La trasmittanza dei film PSU è stata determinata mediante spettroscopia UV-Vis. La trasmittanza di PSU a 750 nm (il bordo superiore dello spettro visibile) è > 90% se PSU sono stati sintetizzati utilizzando PDMS con peso molecolare compreso tra 3.000 e 18.000 g · mol-1. Con un crescente peso molecolare di PDMS, aumentato l'opacità del film. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: modulo di Young di elastomeri PSU in funzione del peso molecolare di polidimetilsilossano. Moduli di Young (YM) sono stati determinati dalle misure di sforzo-deformazione dei film PSU. I valori sono espressi come valore medio ottenuto da cinque misurazioni ripetute. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La diminuzione più alta di YM è stata osservata per PSU sintetizzato da PDMS che vanno da 3.000 a 9.000 g · mol–1. Alle PDMS pesi molecolari tra 12.000 e 18.000 g · mol-1, YM valori sono compresi tra 1,5 MPa e 1,0 MPa. A pesi molecolari superiori a 26.000 g · mol-1, YM valori erano ~0.6 MPa. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Curve di isteresi di figura 11:100 % di elastomeri PSU. Le curve di isteresi di primo ciclo degli elastomeri PSU al 100% di allungamento sono illustrate. La notazione di polimero si riferisce al peso molecolare PDMS (ad es., PSU-3T è un elastomero poliureico preparato da PDMS con un peso molecolare di 3.000 g · mol-1). La più alta isteresi meccanica (43% - 54%) è stata osservata in elastomeri PSU sintetizzati da PDMS di basso peso molecolare, come indicato dalle curve pronunciate isteresi. Isteresi è diminuito con l'aumento del peso molecolare PDMS dal 14% (15.000 g · mol-1) al 6% (33.000 g · mol-1). Questa figura è stata ristampata con il permesso di Riehle et al. 48. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Risultati dei test di citotossicità in vitro su cellule HaCaT trattate con estratti di PSU. Questa figura mostra la proliferazione delle cellule delle cellule HaCaT trattate con estratti di media delle cellule degli elastomeri PSU. I valori sono espressi come il valore medio ottenuto da tre estratti testati per campione, con sei misurazioni ripetute per ogni Estratto (18 ripetizioni in totale). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard da queste misure. Il vuoto rappresenta il medium DMEM (senza campione), che è stata trattata analoga al mezzo cellulare utilizzato per l'estrazione delle cellule. Un uretano polietere medicale è stato selezionato come il materiale di riferimento. Elastomeri siliconici poliurea (PSU-18T, PSU-16T e PSU-14Ph) sono stati selezionati come campioni rappresentativi, che si basavano su PDMS con peso molecolare di 16.000 e 18.000 g · mol-1 (PSU-18T e PSU-16T), mentre PSU-14Ph si basava su un Polidimetil-metil-fenil-silossano-copolimero con 14% in moli di metil-fenil-silossani e un peso molecolare di ~ 16.600 g · mol-1. La proliferazione media delle cellule HaCaT, trattati con gli estratti di elastomeri il PSU e il poliuretano di riferimento era al 100% e superiore. Di conseguenza, gli estratti del PSU elastomeri e poliuretano di riferimento non sono citotossici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.