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Articolo metodologico

Repressione della crescita delle cellule di mieloma multiplo In Vivo di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)-consegnato oligo antisenso MALAT1

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DOI:

10.3791/58598

⸱

13 dicembre 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive la sintesi di un nanotubo di carbonio a parete singola (SWCNT)-coniugato MALAT1 gapmer antisenso del DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), che dimostra la consegna affidabile del SWCNT e il potente effetto terapeutico di anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Metodi utilizzati per la sintesi, la modifica, la coniugazione e iniezione di SWCNT-anti-MALAT1 sono descritti.

Abstract

I nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono un nuovo tipo di nanoparticelle, che sono stato utilizzato per fornire più tipi di farmaci nelle cellule, come proteine, oligonucleotidi e droghe sintetiche della piccolo-molecola. Il SWCNT ha dimensioni personalizzabili, un'ampia area superficiale e non può vincolare in modo flessibile con farmaci attraverso diverse modifiche sulla sua superficie; Pertanto, è un sistema ideale per il trasporto di farmaci nelle cellule. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è un cluster di RNA non codificante più di 200 nt, che non può essere tradotto in proteina, ma svolgono un ruolo importante nei processi biologici e fisiopatologici. Trascrizione di adenocarcinoma polmonare metastasi-collegata 1 (MALAT1) è un lncRNA altamente conservata. È stato dimostrato che i livelli elevati di MALAT1 sono relazionati con la prognosi difficile di vari cancri, compreso il mieloma multiplo (MM). Abbiamo rivelato che MALAT1 regola la morte delle cellule e la riparazione del DNA in MM; così, MALAT1 può essere considerato come un obiettivo terapeutico per MM. Tuttavia, la consegna efficiente dell'oligo antisenso per inibire/atterramento MALAT1 in vivo è ancora un problema. In questo studio, abbiamo modificare il SWCNT con PEG-2000 e coniugato un oligo di anti-MALAT1 ad esso, testare la consegna di questo composto in vitro, iniettare per via endovenosa un modello di topo MM diffuso e osservare un'inibizione significativa di progressione di MM, che indica tale SWCNT è una navetta di consegna ideale per gapmer anti-MALAT1 del DNA.

Introduzione

Il SWCNT è un nanomateriale romanzo in grado di fornire vari tipi di droghe, come acidi nucleici, proteine e piccole molecole stabile ed efficiente con ideale tollerabilità e minima tossicità in vitro1 e vivo in2. Un SWCNT funzionalizzati ha solubilità ottima biocompatibilità e acqua, può essere utilizzato come un servizio di navetta per molecole più piccole e può portarli per penetrare la membrana cellulare3,4,5.

lncRNAs sono un cluster di RNA (> 200 nt) che sono trascritti dal genoma al mRNA ma non può essere tradotto in proteine. La prova aumentante ha dimostrato che lncRNAs partecipano alla regolazione dell' espressione di gene6 e sono coinvolti nell'iniziazione e progressione della maggior parte dei tipi di cancro, tra cui MM7,8,9. MALAT1 è una trascrizione nucleare arricchito non codificante, 2 (NEAT2) e un lncRNA altamente conservato10. MALAT1 è inizialmente riconosciuto in metastatico del polmone non a piccole cellule (NSCLC) cancro11, ma ha stato sovraespresso in numerosi tumori5,12,13; è uno della più altamente espressi lncRNAs ed è correlata con una prognosi difficile in MM8,14. Il livello di espressione di MALAT1 è significativamente più alto in pazienti con MM extramedullary corso mortale rispetto a quelli diagnosticati solo come MM15.

In uno studio precedente, abbiamo confermato che anti-MALAT1 oligos robustamente portare a danni al DNA e l'apoptosi in MM16 utilizzando oligonucleotidi antisenso di DNA gapmer MALAT1 di targeting (anti-MALAT1) in cellule di MM. Il DNA di gapmer è composto di DNA antisenso e collegato da 2'-OMe-RNA, che ha potuto richiamare MALAT1 fenditura da RNasi H attività una volta legato17. L'efficienza di consegna in vivo di oligo antisenso ancora limita il suo uso clinico.

Per verificare la consegna effetto di SWCNT per anti-MALAT1 gapmer i oligos, l'anti-MALAT1 gapmer DNA è coniugato a DSPE-PEG2000-ammina funzionalizzati SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 allora è iniettato per via endovenosa in un modello di topo diffusa MM; un'inibizione notevole è osservata dopo quattro trattamenti.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali erano pre-approvati da la Cleveland Clinic IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care).

1. sintesi di SWCNTs funzionalizzati

  1. Mescolare 1 mg di SWCNTs, 5mg di DSPE-PEG2000-ammina e 5 mL di acqua sterilizzata nucleasi-free in una fialetta di scintillazione (20 mL). Agitare bene per dissolvere completamente tutti i reagenti.
  2. Sottoporre ad ultrasuoni il flaconcino in un sonicatore vasca di acqua ad un livello di potenza di 40 W per 1 h a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiare l'acqua ogni 20 min per evitare il surriscaldamento). E centrifugare a 24.000 x g per 6 h, quindi raccogliere il supernatante. Questa soluzione SWCNT funzionale può essere memorizzata a 4 ° C per 2 mesi.
  3. Aggiungere 1 mL di soluzione SWCNT dal passaggio 1.2 a un dispositivo di filtro centrifugo di MWCO kDa 100, seguita da 4 mL di acqua sterilizzata nucleasi-free. Centrifugare per 10 min 4.000 x g a RT per rimuovere extra DSPE-PEG2000-ammina. Ripetere l'aggiunta di 4 mL di acqua e la centrifugazione 5 x. Più di 0,5 mL di soluzione SWCNT residuo sarà lasciato nel filtro dopo ogni centrifugazione.
  4. Misurare la concentrazione della soluzione SWCNT avanzata nel filtro utilizzando uno spettrometro UV/VIS a 808 nm dopo il lavaggio finale. La concentrazione finale è in genere circa 50 mg/L (calcolati secondo il metodo sviluppato da Kam et al.18).
    Nota: Assicurarsi che SWCNTs DSPE-PEG-funzionalizzati sono solubili in acqua dopo passo 1.4 e sono stabili in diverse soluzioni biologiche senza aggregazione visibile dopo poche settimane.

2. coniugazione del Anti-MALAT1 Gapmer DNA affiancata da 2'-O RNAs modificate per SWCNT funzionalizzati

  1. Aggiungere 0,5 mg di Sulfo-LC-SPDP in 450 µ l di DSPE-PEG2000-ammina funzionalizzati SWCNT. Aggiungere 50 µ l di PBS 1x 10 e poi incubare per 2 h a TA.
  2. Per rimuovere extra Sulfo-LC-SPDP, aggiungere la reazione dal punto 2.1 a un dispositivo di filtro centrifugo di MWCO kDa 100, seguita da 4 mL di acqua priva di nucleasi. Centrifugare per 10 min a 4.000 x g a RT. Repeat l'aggiunta di 4 mL di acqua e la centrifugazione 5x.
  3. Aggiungere 200 nM del tiolo-modificato anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA in 1,5 mL di soluzione commerciale di DTT e incubare per 90 min a RT. purificare il prodotto con una colonna di NAP-5, dopo il protocollo del produttore. Eluire l'anti-MALAT1-Cy3 con 500 µ l di sterilizzato nucleasi-free 1 x PBS.
    Nota: Il SWCNT funzionalizzate possono essere memorizzati con DTT aggiunto, che potrebbe fendere i legami bisolfurico formati durante l'immagazzinaggio dei chitosani anti-MALAT1 gapmer del DNA. Il DTT aggiunto può essere rimosso da aNAP-5 colonna prima coniugazione con SWCNT.
  4. Raccogliere la soluzione DSPE-PEG2000-ammina SWCNT sulfo-LC-SPDP-trattati lasciato nel filtro e diluirla con 500 µ l di soluzione anti-MALAT1-Cy3. Quindi, viene quindi incubato a 4 ° C per 24 h. Il coniugato SWCNT-anti-MALAT1 possono essere memorizzati a 4 ° C per 3 settimane. Seguendo la stessa procedura, il SWCNT coniugati con oligo antisenso scramble può essere sintetizzato e utilizzato come SWCNT-controllo.

3. coda vena iniezione di SWCNT-Anti-MALAT1

  1. Generare un modello di topo diffusa di MM.
    1. Per ottenere i migliori risultati di confronto, in modo casuale organizzare 14 cenno del capo. Topi di CB17-Prkdcscid/J (8 settimane) in versione di prova o controllo gruppi (sette in ogni gruppo) con lo stesso rapporto maschio/femmina.
    2. Pulire la panchina di operazione e sterilizzarlo con alcool al 70%.
    3. Utilizzare una lampada di riscaldamento per riscaldare il mouse per aiutare la coda della vena per apparire. Reprimere il mouse correttamente con un dispositivo di ritenuta iniezione di coda.
    4. Iniettare 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry cellule in 50 µ l di PBS tramite la vena della coda senza anestesia. Premere il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool per 30 s. Mark il mouse iniettato e tornare a una gabbia pulita.
  2. Iniziare il trattamento il giorno 7 dopo l'iniezione di cellule MM.1S.
    1. Iniettare 50 µ l di PBS contenente SWCNT-anti-MALAT1 nella vena della coda del mouse. Utilizzare PBS contenente SWCNT-controllo come un controllo.
    2. Premere il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool per 30 s.
    3. Osservare l'emorragia locale sulla coda e il comportamento generale del mouse per 1 min e poi ritornare una gabbia pulita. Osservare tutto iniettati topi nuovamente prima di restituire la gabbia al rack, per assicurarsi che le iniezioni sono tollerate bene.
  3. Ripetere l'iniezione ogni 7 giorni fino al termine dell'esperimento.
    1. Terminare l'esperimento quando si degrada la salute generale del mouse: quando non mangiare o bere, la comparsa delle zampe di pallide, qualsiasi sanguinamento sottocutaneo, una mancanza di respiro, diminuita attività, una paralisi degli arti inferiori, e/o di una massa palpabile nella addome è osservato.

4. valutazione della progressione della malattia

  1. Valutare lo stato generale dei topi ogni giorno dopo l'iniezione di cellule MM.1S-Luc-mCherry. Prestare particolare attenzione se i topi sviluppano paralizza degli arti inferiori.
  2. Valutare la crescita del tumore usando un sistema di imaging in vivo 1 volta a settimana, prima dell'iniezione di SWCNT-anti-MALAT1.
    1. Preparare fresco 15 mg/mL D-luciferina con PBS 1X.
    2. Anestetizzare i topi con un vaporizzatore di isoflurane (3 – 5% per induzione e 1-3% per la manutenzione, a seconda dello stato dei topi).
    3. Iniettare 150mg/kg D-luciferina in ogni mouse intraperitonealmente, 5 min prima di formazione immagine; quindi, l'immagine i topi in posizione prona con uno spettro sistema di imaging.
    4. Raccogliere immagini sequenziali dei topi ogni 2 min, fino a quando non viene raggiunta la saturazione di luminescenza. Regolare l'intervallo di tempo in base al D-luciferina assorbimento/segnale.
  3. Utilizzare CO2 a sacrificare i topi una volta raggiunto il termine dell'esperimento.
  4. Poiché si tratta di un modello diffuso MM, elaborare i topi come segue.
    1. Pesare il mouse prima della dissezione.
    2. Raccogliere il sangue periferico dal cuore per un dosaggio di esame emocromocitometrico completo (CBC) effettuato da una macchina di contatore di cellule del sangue. I conteggi dei globuli bianchi e globuli rossi, così come il rapporto dei linfociti, è indici primari.
    3. Isolare la milza e pesarlo. Calcolare il rapporto del peso della milza/corpo; Considera > 0.5% come ingrossamento della milza.
    4. Raccogliere i tessuti del midollo osseo, milza, linfonodi, rene e il tessuto con la metastasi visibile.
    5. Se il mouse ha sviluppato una paralisi degli arti inferiori, raccogliere la colonna vertebrale.
    6. Estrarre RNA e proteina da campioni di midollo osseo.
    7. Difficoltà tutti i rimanenti tessuti in formalina.
    8. Per la decalcificazione, immergere i campioni dell'osso in soluzione di EDTA 0,25 M (pH 8.0) per 5 giorni dopo 24 h di fissazione.
    9. Immergere tutti i campioni nell'alcool di 75% per l'archiviazione a lungo termine.
  5. Confrontare la potenza del segnale della luciferasi allo stesso tempo punti in due gruppi. Da entrambi i gruppi, è necessario registrare le date di sacrificio di ogni mouse e calcolare le curve di sopravvivenza dei due gruppi con il software.
    Nota: Tutte le procedure sono riassunti nella Figura 1.

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Risultati

Per dimostrare l'effetto di inibizione di anti-MALAT1 gapmer DNA in MM, abbiamo buttato giù l'espressione di MALAT1 e usato in cellule H929 e MM.1S. Quarantotto ore più tardi, le cellule sono stati raccolti per l'analisi dell'efficienza di abbattimento e lo stato di apoptosi in cellule trasfettate con anti-MALAT1 gapmer o controllo del DNA. risultati di qRT-PCR ha mostrati che anti-MALAT1 gapmer DNA abbattuto l'espressione di MALAT1 in cellule H929 e MM.1S in modo efficiente (

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Discussione

La prova ha indicato che lncRNAs prendere parte nella regolazione di numerose procedure fisiologiche e patofisiologiche nei cancri, compreso MM7,8,9; Essi hanno il potenziale per essere mirati per il trattamento del cancro, che può essere realizzato da oligonucleotidi antisenso20,21,22. L'US Food and Drug Administration (FDA) ha approva...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Lerner Research Institute proteomica, genomica e imaging core per la loro assistenza e supporto. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da NIH/NCI grant R00 CA172292 (per J.J.Z.) e fondi di Start-up (a J.J.Z.) e la clinica e traslazionale Science Collaborative (CTSC) della Case Western Reserve University Core utilizzazione pilota Grant (a J.J.Z.). Questo lavoro utilizzata il microscopio confocale Leica SP8 che è stato acquistato con un finanziamento da istituti nazionali di salute SIG grant 1S10OD019972-01.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
SWCNTsMillipore-Sigma704113
DSPE-PEG2000-AmminaAvanti Polarizzazione dei lipidi polari880128
bagnoschiumatoreVWR97043-992
Filtro centrifugo da 4 mLMillipore-SigmaZ740208-8EA
Thermo Fisher ScientificaccuSkan GO SpettrofotometroUV/Vis per micropiastrecoefficiente di estinzione di 0,0465 L/mg/cm a 808 nm
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
Soluzione DTTMillipore-Sigma43815
NAP-5 colonnaGE Healthcare17-0853-01
sistema di imaging in vivoPerkinElmer
NOD. CB17-Prkdcscid/J topiCharles River lab250
Citometro a flussoBecton Dickinso
LipofectaminaInvitrogen11668019Lipofectamin2000
Siero fetale bovino (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 medioInvitrogen11875-093
MALAT1-QF:sintetizzato da IDT Azienda5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR:sintetizzato da IDT Company5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF:sintetizzato da IDT Company5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3'
GAPDH-QR:sintetizzato da IDT Company5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
PCR quantitativa utilizzando la master mix SYBR Green PCRThermo Fisher ScientificA25780
RevertAid kit di sintesi di cDNA di primo supportoThermo Fisher ScientificK1621
anti-MALAT1sintetizzato da IDT Company5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
Kit di analisi della vitalità cellularePromega CorporationG7570Kit di analisi della vitalità cellulare luminescente
accuSkan GO Spettrofotometro per micropiastre UV/VisThermo Fisher Scientific
Filtro centrifugoMillipore-SigmaUFC910008
SPSS SoftwareIBMversione 24.0
D-LuciferinMillipore-SigmaL9504
Spettrometro UV/VIS

Riferimenti

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