Photobleaching permette l'Imaging a Super-risoluzione dell'anello FtsZ nel cianobatterio Prochlorococcus

Sommario

Qui descriviamo un metodo photobleaching per ridurre l'autofluorescenza di cianobatteri. Dopo photobleaching, microscopia stocastico ricostruzione ottico viene utilizzata per ottenere immagini tridimensionali ad alta super-risoluzione dell'anello FtsZ cianobatterica.

Abstract

Microscopia di Super-risoluzione è stato ampiamente utilizzata per studiare le interazioni della proteina e strutture subcellulari in molti organismi. Negli organismi fotosintetici, tuttavia, la risoluzione laterale dell'imaging di Super-risoluzione è solo ~ 100 nm. La bassa risoluzione è dovuto principalmente sullo sfondo di alta autofluorescenza delle cellule fotosintetiche causato da laser ad alta intensità che sono necessari per l'imaging di Super-risoluzione, come il microscopio stocastico ricostruzione ottico (tempesta). Qui, descriviamo un assistita photobleaching tempesta metodo che è stato sviluppato recentemente per formazione immagine il picocyanobacterium marino Acinetobacter. Dopo photobleaching, l'autofluorescenza di Acinetobacter è efficacemente ridotto così quella tempesta può essere eseguita con una risoluzione laterale di ~ 10 nm. Utilizzando questo metodo, acquisiamo l'organizzazione in vivo tridimensionale (3D) della proteina FtsZ e caratterizzano le quattro diverse morfologie di anello di FtsZ durante il ciclo cellulare di Acinetobacter. Il metodo che qui descritto potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione di altri organismi fotosintetici.

Introduzione

Microscopie di Super-risoluzione possono rompere il limite di diffrazione di luce e di fornire immagini all'interno di risoluzioni Sub-diffrazione (< 200 nm). Essi sono stati ampiamente utilizzati in molti organismi per studiare la localizzazione della proteina e strutture subcellulari. Maggiore super-risoluzione microscopia metodi includono illuminazione strutturata microscopia (SIM), stimolato microscopia di svuotamento di emissione (STED), tempesta e microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM). I meccanismi e le applicazioni di questi super-risoluzione microscopi sono stati esaminati altrove^1,2.

Protocollo

1. preparazione e la fissazione del campione

1. Inoculare 1 mL di axeniche Prochlorococcus MED4 a 5 mL della base di acqua di mare Pro99 medio¹². Crescere Prochlorococcus culture a 23 ° C sotto la luce con un'intensità di 35 µmol fotoni/m²s. cinque giorni più tardi, raccogliere 1 mL di coltura in una provetta da 1,5 mL.
   Nota: Cinque giorni dopo l'inoculazione, Acinetobacter MED4 raggiungerà la fase tarda del registro, con circa 10⁸ cellule/mL, che è appropriato per l'imaging di tempesta.
2. Aggiungere 100 µ l di formaldeide preparati al momento da 25% paraformaldeide (PFA) (w/v) ....

Risultati

TEMPESTA realizza formazione immagine super-risoluzione attivando fotomodulabili singoli fluorophores casualmente. La posizione di ogni fluoroforo è registrata e un'immagine di Super-risoluzione è quindi costruita basata su queste posizioni⁴. Pertanto, la precisione della posizione fluoroforo è importante per la ricostruzione di immagine di Super-risoluzione. Gli spettri di assorbimento di Acinetobacter picco a 447 nm e 680 nme Acinetobacter ha un.......

Discussione

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura per ridurre significativamente l'autofluorescenza del cianobatterio Prochlorococcus (Figura 3) e, quindi, immunostain le proteine nelle cellule, che ci ha permesso di utilizzare tempesta per studiare il FtsZ 3D morfologie di anello in Acinetobacter (Figura 4). Questo protocollo potrebbe essere adottato per l'imaging di Super-risoluzione in altri organismi fotosintetici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Particelle di polistirene	Spherotech	PP-20-10	2.0-2.4 µ m
Vetrino coprioggetti	Marienfeld	0111580	18 mm &vuoto;, Spessore n. 1
Etanolo	Scharlau	ET00021000
Poli-L-lisina bromidrato	Sigma-Aldrich	P9155	mol peso 70.000-150.000
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Soluzione di glutaraldeide, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Sale disodico, 2-idrato	Biotecnologia d'oro	E-210-500
Base Trizma	Sigma	T1503
Lisozima		Sigma L6876
Siero di capra	Sigma	G9023
anti- Anabaena Anticorpo FtsZ	Agrisera	AS07217
Capra anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato	Life Technologies	A-21039	coniugato con Alexa Fluor 750
D-glucosio anidro	Fisher Scientific	D16-1
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich
Cicloottatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
glucosio ossidasi	Sigma-Aldrich	G2133
catalasi	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Sorgente			250 W
STORM	Microscopio		SRiS
Rohdea	Software NBI	SRiS 3.0	per l'acquisizione di immagini
Software Luna	NBI	SRiS 3.0	per la correzione della deriva
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home

856177 luminosa allo xeno NBI