Questo protocollo descrive la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag colla molecolare in gabbia. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery.
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Articolo metodologico
Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nucleo cellulare è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie. Qui, dimostriamo che la traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti usando in gabbia Tag colla molecolare (Cagedcolla-R), cui più pendenti di guanidinium ione (Gu+) sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici (butirrato-sostituiti nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gli ospiti con etichettati Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e rimangono in endosomi. Tuttavia, al momento photoirradiation, Cagedcolla-R è convertito in uncaged molecolare colla (Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu+ , che facilita la fuga endosomal e conseguente traslocazione nucleare degli ospiti. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery, poiché gli ospiti con tag possono migrare nel citoplasma seguito da nucleo cellulare solo quando photoirradiated. In gabbia Tag: colla-R in grado di fornire macromolecolari ospiti come punti quantici (QD) così come gli ospiti della piccolo-molecola. In gabbia Tag: colla-R può essere uncaged con non solo luce UV, ma anche luce di due fotoni vicino infrarosso (NIR), che possa penetrare in profondità nel tessuto.
Introduzione
Il nucleo delle cellule, che porta le informazioni genetiche, è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e genetica disordini di1,2,3. Per consegna nucleare delle droghe, coniugazione di peptide tag come localizzazione nucleare (NLS) di segnali4,5,6 è stato ampiamente studiato. Tuttavia, al fine di ridurre gli effetti col....
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Protocollo
1. preparazione degli ospiti con gabbiacolla-R Tag
- Preparare la soluzione di colla-NBD Caged.
- Sintetizzare Cagedcolla-NBD (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte20.
- Preparare una soluzione stock di Cagedcolla-NBD (10 mM) a secco dimetilsolfossido (DMSO).
Nota: Conservare la soluzione magazzino buio. La soluzione può essere diluita con amplificatori acquosi o terreni di coltura delle cellule al momento di utilizzo.
- Preparare la soluzione di colla-QD Caged.
- Sintetizzare Caged
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Risultati
Prima photoirradiation, Hep3B cellule incubate con Cagedcolla-NBD ha esibito l'emissione di fluorescenza punctate dal loro interno (λext = 488 nm; Figure 4A e 4C, verde). Un Micrografo analogo è stato ottenuto al momento di eccitazione a 543 nm per colorante rosso fluorescente (figure 4B e 4C, rosso), che indica che il Cagedcolla-NBD localizzata negli endosomi. D.......
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Discussione
Le indagini precedenti di luce-attivato traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule sono stati raggiunti utilizzando in gabbia NLS7,8,9. Come accennato in precedenza, questi metodi richiedono tecniche aggiuntive per incorporare le proteine NLS-etichettate nel citoplasma. Al contrario, nostro tag colla-R Cagedconsente non solo la traslocazione nucleare indotta da foto, ma anche l'assorbimento cellulare degli .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il centro per l'integrazione di NanoBio, l'Università di Tokyo. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzione per giovani scienziati (B) (26810046) per K.O. e parzialmente supportato da sovvenzione per ricerca promosso appositamente (25000005) con T.A. R.M. grazie Research Fellowships di Japan Society per la promozione della scienza (JSPS ) per giovani ricercatori e il programma per scuole laureate leader (GPLLI).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Azide-PEG4-NHS estere | Fare clic sugli strumenti chimici | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Membrana in cellulosa rigenerata (MWCO 3.500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Membrana in cellulosa rigenerata (MWCO 25.000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
| Substrato in vetro a 8 camere | Nunc | 155411JP | |
| Piastra di coltura a 96 pozzetti | Nunc | 167008 | |
| Terreno essenziale minimo dell'aquila (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industrie | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Kit di conteggio delle cellule-8 | Dojindo | CK04 | |
| Microscopio a scansione laser confocale | Carl-Zeiss | LSM 510 | Dotato di laser di eccitazione a due fotoni (laser Mai Tai, Spectra-Physics) |
| Laser confocale microscopio a scansione | Leica | TCS SP8 | |
| Sorgente luminosa allo xeno | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Lettore di micropiastre | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
Riferimenti
- Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
- Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
- Verma, I. M., Weitzman, M....
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Ristampe e permessi
