Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Cella-libera espressione genica reazioni sono di grande interesse per varie applicazioni in biochimica, delle biotecnologie e biologia sintetica. Senza cellula di espressione delle proteine è stato determinante per la preparazione di campioni di proteine pure, che erano alla base di numerosi studi in biologia strutturale. Per esempio, sistemi senza cellula sono stati utilizzati con successo per l'espressione della proteina complessi¹ o membrana proteine², che sono difficili da produrre utilizzando espressione basati su cellule. In particolare, senza cellula reazioni erano usate anche per delucidare la struttura del codice genetico, a partire con gli esperimenti innovativi di Nirenberg e Matthaei nel 1961³l'espressione genica.

Recentemente, c'è stato un rinnovato interesse nei metodi senza cellula in biotecnologie e biologia sintetica^4,5,6. Sistemi senza cellula possono essere ampliate con composti non-biologico, e componenti di origine biologica, diversa possono essere combinati più facilmente⁷. Anche se sistemi senza cellula hanno lo svantaggio evidente che essi non "crescono e si dividono", è concepibile per preparare aperte senza cellula bioreattori con funzioni metaboliche di base e lasciarli a sintetizzare metaboliti quando dotati di energia e di carbonio semplice ingressi⁸. All'interno del campo emergente della biologia sintetica, sistemi senza cellula promettono di essere un "telaio" più prevedibile per l'attuazione delle funzioni biologiche sintetici.

Attualmente, le reazioni di espressione genica senza cellula sono effettuate utilizzando estratti cellulari (da diverse fonti quali batteri, lieviti, insetti), o sistemi di trascrizione/traduzione che sono stati ottimizzati per diverse applicazioni (ad es., procariotiche vs eucariotiche espressione genica, produzione di proteine di membrana, ecc.). Un popolare protocollo per la preparazione dell'estratto di cellula batterica (comunemente chiamato TXTL) è stato fornito recentemente da V. Noireaux e colleghe⁹. Sue proprietà biofisiche sono stati accuratamente caratterizzata¹⁰, e il sistema TXTL è stato già utilizzato con successo per eseguire una serie di complesse attività biochimiche: ad esempio, l'Assemblea dei batteriofagi funzionale tramite senza cellula espressione del genoma dei fagi¹¹, la sintesi di proteina batterica filamenti¹²o l'attuazione del gene senza cellula circuiti^13,14.

Un altro sistema popolare in biologia senza cellula sintetica è il sistema puro, che viene ricostituito da componenti purificate^15,16. Rispetto al sistema TXTL, non contiene nucleasi o macchine di degradazione della proteina. Durante la degradazione di DNA lineare, molecole del RNA o proteine è meno di un problema nel sistema puro, vie di decadimento sono in realtà importante per l'implementazione di funzioni dinamiche. Al fine di ridurre l'effetto di degradazione di exonuclease di modelli lineari genica nel sistema TXTL (attraverso RecBCD), la proteina di GamS fine-protezione dovrà essere aggiunto. Sia il TXTL e il sistema puro sono disponibili in commercio.

Un argomento strettamente legato alle preoccupazioni senza cellula biologia lo studio dell'effetto di compartimentalizzazione su reazioni biochimiche e ulteriormente la creazione di strutture alveolari artificiali o protocellule^{17,18,19 ,20}. Ricerca sulle cellule artificiali in genere implica l'incapsulamento di un sistema di reazione biochimica all'interno di compartimenti vescicolari effettuata in fosfolipidi o altri anfifili. Mentre tali sistemi aiutano a esplorare gli aspetti fondamentali della compartimentalizzazione, o la comparsa di cellularità e strutture auto-replicanti, si trovano ad affrontare le problematiche tipiche di sistemi chiusi: in assenza di un metabolismo funziona e appropriato meccanismi di trasporto di membrana, è difficile mantenere reazioni compartimenti in esecuzione per lunghi periodi di tempo - molecole di carburante vengono utilizzati e prodotti di scarto si accumulano.

Un'interessante alternativa alla compartimentazione all'interno di tali compartimenti che imita cella è l'organizzazione spaziale di materiale genetico mediante metodi fotolitografiche. Immobilizzazione dei "geni su un chip" è stato lanciato dal gruppo Bar-Ziv presso l'Istituto di Weizmann più di dieci anni fa²¹. Tra le principali questioni che dovevano essere risolti erano l'adsorbimento non specifico del DNA e la potenziale denaturazione delle proteine sulla superficie del chip. Bar-Ziv et al ha sviluppato un resist fotolitografia dedicato chiamato "Daisy", che era composta di un silano terminale reattivo per l'immobilizzazione delle molecole resistere sulle superfici di biossido di silicio, un distanziatore lungo polietilenglicole (PEG) che ha assicurato biocompatibilità e capigruppo un photocleavable, che è stato convertito in un'ammina reattiva all'irradiazione con luce ultravioletta (UV). È stato dimostrato che Daisy può essere utilizzato per immobilizzare molecole di DNA del gene-lunghezza (con lunghezze diverse kilo-di coppie di basi (kbp)) su una superficie del chip. Da un punto di vista della fisica di polimeri, i sistemi rappresentati spazzole polimero innestati su un substrato solido. A causa della natura di polielettrolita del DNA, la conformazione di queste spazzole è fortemente influenzata dalla osmotico e altri effetti di ioni specifici^22,23.

La cosa più importante, ha dimostrato che geni immobilizzati substrato sono ancora funzionali e possono essere trascritto e tradotto in RNA e proteina. Gene pennelli sono accessibili per la polimerasi del RNA dalla soluzione²⁴, e il complesso composto macromolecolare della trascrizione/traduzione non è denaturato alla superficie. Uno dei vantaggi di immobilizzazione dei componenti genetiche su un substrato è che essi possano funzionare in un sistema di reattore aperto microfluidici che continuamente viene fornito con molecole precursori piccolo e da quali prodotti di scarto può essere rimosso^{25 , 26}.

Recentemente abbiamo sviluppato una variante di questo metodo chiamato Bephore (per fascio di elettroni biocompatibile e photoresist)²⁷, che era basato esclusivamente su componenti disponibili in commercio e utilizzati reazioni di invasione di strand DNA sequenza-specifiche per la realizzazione di una procedura di Litografia multistep semplice da implementare per la creazione di cellule artificiali basati su chip. Una descrizione schematica della procedura è illustrata nella Figura 1. È basato su molecole di DNA tornante contenente un gruppo di photocleavable, che sono immobilizzati su un livello di PEG biocompatibile. Photocleavage dei tornanti espone una sequenza di filamento singolo punto d'appoggio, attraverso il quale DNA molecole di interesse (contenente la sequenza DIS "spostando") possono essere collegato via invasione strand toehold-mediata.

Mentre Bephore è potenzialmente più semplice da implementare, Daisy permette la realizzazione di molto denso e pulito "spazzole del gene", che presenta vantaggi in determinate applicazioni. In linea di principio, tuttavia, Litografia Daisy e Bephore potrebbe essere facilmente combinato. Un metodo di Litografia correlata utilizzando spazzole di DNA strand displacement per strutturazione del DNA su oro precedentemente è stato sviluppato da Huang et al., ma non è stata utilizzata nel contesto dell'espressione genica senza cellula^28,29.

Il seguente protocollo forniamo che una descrizione dettagliata della produzione di DNA pennelli per l'espressione genica senza cellula utilizzando il metodo Bephore. Descriviamo come il chip del gene sono fabbricati e dimostrare l'uso di multi-step foto-litografia per l'immobilizzazione spazialmente strutturato dei geni su un chip. Inoltre discutiamo la realizzazione di camere di reazione e l'applicazione della microfluidica per lo svolgimento delle reazioni di espressione genica su chip.

Nota: Un calendario per i passaggi nelle varie sezioni è data nel informazioni supplementari (sezione 1).

1. chip Fabrication

Nota: come substrati, wafer di silicio di uso (diametro 100 mm, spessore mm 0,525) con uno strato di 50 nm di biossido di silicio o lastre di vetro (24 mm x 24 mm, n. 1.5; 22 mm x 50 mm, n ° 4). A seconda dell'applicazione, altri formati e spessori possono essere più adatti.

1. I substrati tramite un RCA pulizia procedura (acqua, soluzione di ammoniaca NH₃(aq) 30% e perossido di idrogeno H₂O₂ 30%, con un rapporto di 5:1:1)
   1. Mescolare la soluzione di acqua e ammoniaca in un bicchiere di Becher e riscaldare la miscela a 70 ° C su una piastra calda continuando a mescolare.
   2. Aggiungere il perossido di idrogeno e il substrato. Per un throughput più elevato, posto più substrati (soprattutto i vetrini piccola) in un supporto di politetrafluoroetilene (PTFE).
   3. Dopo 30 min, togliere il substrato, risciacquare abbondantemente con acqua da una bottiglia di lavare e asciugare con una pistola di azoto. Procedere immediatamente con la PEGilazione del substrato.
      Attenzione: Indossare protezioni per occhi e pelle e lavorare in una cappa aspirante. Non chiudere ermeticamente il contenitore dei rifiuti al fine di consentire per il rilascio di gas dalla miscela.
2. PEGilazione del substrato
   Nota: Ripetuti di congelamento e scongelamento lo stock di biotina-PEG-Silano riduce la reattività del silano a causa di condensazione dell'umidità dell'aria. Quindi, preparare provette da 5 mL con adeguate quantità di biotina-PEG-Silano (ad es. 10-20 mg) e riempirli con argon asciutto prima di congelarle fino all'utilizzo.
   1. Biotina-PEG-Silano si dissolvono in toluene asciutto nel Vortex (5 mg/mL).
   2. Posizionare il substrato in un piatto di petri di vetro (diametro 120 cm, 2 cm di altezza) in una cappa aspirante.
   3. Dispensare la soluzione (≈ 200 µ l per un singolo vetro vetrini coprioggetto, pochi mL per un wafer di silicio grande) sul substrato, che copre tutta la superficie, ma evitare la soluzione che scorre oltre il bordo del substrato.
   4. Chiudere la piastra di Petri. Per ridurre l'essiccazione del substrato, aggiungere una copertura supplementare con un tovagliolo di carta bagnato.
   5. Dopo 30 min, aggiungere circa 40 ml di alcol isopropilico, quindi estrarre il substrato, nuovo sciacquare accuratamente con alcol isopropilico e asciugarlo con una pistola di azoto (per lastre di vetro, ricordate il lato pegilato). Conservare il substrato al buio fino all'utilizzo.
      Attenzione: Indossare protezioni per occhi e pelle e lavorare in una cappa aspirante.

2. preparazione dei geni per l'immobilizzazione

Nota: Primer sequenze, modificazioni del DNA e un protocollo PCR esemplare sono date nel informazioni supplementari (paragrafi 2-4).

1. Utilizzare primer modificate per amplificare il gene di interesse da reazione a catena della polimerasi (PCR). Un iniettore trasporta un fluoroforo per visualizzazione in microscopia a fluorescenza, e l'altro iniettore è separato dalla sequenza DIS da un distanziatore di glicole trietilenico al fine di mantenere la sequenza DIS single-stranded in tutta la PCR.
2. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione colonna spin e misurare la sua concentrazione mediante un fotometro di assorbimento. La concentrazione non dovrebbe essere molto inferiore a 100 nM.
3. Regolare la concentrazione di NaCl a 1m utilizzando una soluzione di NaCl 5m concentrata. L'alta concentrazione di sale facilita il DNA pennello Assemblea processo²².

3. fotolitografia

Nota: La photocleavable del DNA (PC) deve essere manipolati solo in un ambiente giallo-chiaro. Foglio giallo per camere bianche può essere utilizzato per filtrare la luce di lampade a luce bianche convenzionale.

1. Preparazione del substrato
   1. Preparare la miscela di Bephore (DNA di PH 7,5 µM streptavidina, 1,5 µM PC DNA, da 1 µM in 1X PBS (phosphate-buffered saline)) e la passivazione mescolare (senza etichetta DIS DNA, 1 mg/mL BSA (albumina di siero bovino,) in PBS 1x 10 µM). Entrambi possono essere conservate al buio in frigorifero per diverse settimane.
   2. Tagliare il substrato in piccoli pezzi (pochi cm²) utilizzando una taglierina di vetro o rompendo un wafer di silicio lungo una linea di cristallo premendo sul bordo con un bisturi. Come un segno di allineamento semplice, creare un graffio breve dal centro verso un bordo del substrato utilizzando il tagliavetro. Piccole particelle di colpo fuori il chip con una pistola di azoto.
   3. Mescolare due gocce di colla siliconica bicomponente, mescolando per esempio con una punta di pipetta e applicare la colla sulla superficie del chip, lasciando vuota la zona intorno alla punta del graffio (Figura 2A). La colla fornisce una barriera idrofoba che facilita la procedura di lavaggio e riduce la quantità di DNA richiesto per le incubazioni. In un passaggio successivo, la colla può essere facilmente staccata.
   4. Incubare 10 µ l (o quanto necessario per coprire il chip) del Bephore-mix a temperatura ambiente (TA) sul chip. Durante l'incubazione, posto il chip in una scatola, ad esempio una casella di punta della pipetta parzialmente riempito con acqua per ridurre l'evaporazione.
   5. Dopo 1 h, lavare il chip più volte (x 5 con 50 µ l) di pipettaggio con PBS 1X per rimuovere unbound Bephore-mix.
   6. Togliere quanto più buffer possibile senza seccare il chip e incubare 10 µ l di passivazione-mix sul chip a TA.
   7. Dopo 2 h, lavare il chip più volte (10x con 50 µ l) di pipettaggio con PBS 1X per rimuovere gli agenti passivazione non associato.
2. Litografia di proiezione
   Nota: Per la litografia, può essere utilizzato un microscopio dritto con un 60 x obiettivo a immersione in acqua. I tempi di illuminazione dipendono l'obiettivo, la sorgente luminosa, la maschera, densità di superficie del substrato (diapositiva di chip o vetro di silicio) e il DNA desiderato. Con un obiettivo 60x, tempi tipici di esposizione hanno variato da meno di un minuto per una Litografia in due fasi con le regioni di sovrapposizione (15 s su chip di silicio, 45 s per vetrini) per 2-3 min per un'esposizione completa. Non usare un vetrino coprioggetto (ad eccezione di quarzo fuso) in cima al substrato, poiché esso blocca la luce UV.
   1. Tagliare un photomask stampato (Vedi file supplementari con Litografia esemplare maschere e sezione supplementare 5) su una dimensione appropriata per montare un supporto maschera adatta, che può essere inserito nella posizione della fermata del campo (Figura 2B). Per la precisa multi-step Litografia, allineare la maschera con segni di allineamento sul supporto.
   2. Posizionare il substrato in una diapositiva di microscopia e spostarlo il tavolino del microscopio. Per la modellatura delle lastre di vetro Bephore, inserire nero lamina (ad es. ricambio lamina dalle fotomaschere stampate) tra microscopia diapositiva e Bephore per fornire uno sfondo scuro per la litografia.
   3. Inserire un filtro rosso il percorso di illuminazione, messa a fuoco sulla superficie del substrato e navigare nella regione del substrato, che sarà esposte, ad esempio la regione all'estremità del graffio.
   4. Inserire il supporto della maschera, bloccare l'illuminazione e modificare il filtro UV (Figura 2). A bassa intensità luce, aprire l'otturatore e utilizzare la fotocamera a fuoco rapidamente la maschera sul substrato.
   5. Bloccare il percorso della luce per la fotocamera e illuminare il substrato ad alta intensità luminosa per il tempo di esposizione desiderato.
   6. Prelevare il campione dal microscopio e attentamente rimuovere quanto più buffer possibili dal substrato senza seccarla.
   7. Aggiungere 10-20 µ l di DNA con dis-sequenza. Posto il substrato in una scatola di bagnato per tenerlo da asciugare. Incubare il DNA sul substrato per 2 h (oligonucleotidi ad una concentrazione micromolar) o diverse ore/notte (DNA kbp-lungo a una concentrazione di circa 100 nM) a TA.
   8. Rimuovere il DNA dal chip e lavare più volte con PBS 1X. Al fine di ridurre lo spreco di DNA (soprattutto per i frammenti più lunghi), conservare il DNA prelevato dal substrato e riutilizzarlo.
3. Litografia di multi-step
   Nota: Per un allineamento preciso di due o più esposizioni in un'unica area, mantenere il campione sul palco per evitare disallineamenti angolari. Assicurarsi che il chip non prosciugarsi. Per il posizionamento di diversi DNA pennelli in diverse regioni su un substrato, utilizzare un tavolino motorizzato in unità per l'area designata oppure utilizzare un substrato con segni di allineamento appropriato.
   1. Dopo la prima esposizione (sezione 3.2), incubare DNA con dis-sequenza sul substrato. È importante che tutti i siti di legame risultante dalla prima esposizione sono occupati. Di conseguenza, incubare oligonucleotidi (10 µM) per circa 3 ore a TA.
   2. Per immobilizzare geni dis-etichettati, metterli sul substrato per diverse ore o pernottamento in RT, quindi lavare il campione e aggiungere il mix di passivazione per un altro 2 h a RT. procedere con la successiva esposizione.
   3. Per ulteriori esposizioni, ripetere i passaggi precedenti (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS dispositivi

Nota: Preferibilmente, lavorare in un ambiente pulito. La realizzazione di un dispositivo PDMS segue un protocollo standard come descritto da McDonald et al. ³⁰

1. Fabbricazione di stampi master tramite fotolitografia
   1. Un wafer di silicio (76,2 mm di diametro, 525 µm spessore) sonicazione in acetone per 5 min ad alta potenza e sciacquare con acqua deionizzata e alcool isopropilico. In seguito inserire la cialda su un piatto caldo a 150 ° C per 15 min.
   2. Facoltativamente, al fine di migliorare l'adesione di resistere ai wafer, aggiungere promotore di adesione di 2-3 mL e spin a 3000 rpm per 30 s. calore la cialda a 120 ° C per 2 min.
   3. Aggiungere circa 2-3 mL photoresist (Vedi Tabella materiali). Girare la cialda per 15 s a 500 giri/min, poi a 3000 rpm per 30 s. Ciò dovrebbe comportare un 20 µm spessore strato di photoresist. Lasciate che lo strato di photoresist rilassarsi a temperatura ambiente per 10 min.
   4. Per la cottura di pre-esposizione, posizionare la cialda su un piatto caldo a 50 ° C per 2 min, poi a 85 ° C per 5 min.
   5. Posizionare la cialda sotto strato di fotoresist con la cianografia dei compartimenti. Preferibilmente, utilizzare una maschera-allineatore. Strato di fotoresist dovrebbe avere una risoluzione di dpi 64.000 (Vedi file supplementari con maschere di litografia e sezione supplementare 5).
   6. Esporre la cialda per 1 min con luce UV (-linea 5-10 mW/cm²) attraverso il photomask.
   7. Per la cottura di post-esposizione, posizionare la cialda a 50 ° C per 2 min e poi a 85 ° C per 5 min. Lasciate che la cialda di rinfrescarsi e rilassarsi per 1 h a temperatura ambiente.
   8. Posizionare la cialda in un piatto con lo sviluppatore per 3 min mentre agitando delicatamente il bicchiere. Sciacquare la cialda con alcool isopropilico e asciugare con una pistola di azoto. Posizionare la cialda su un piatto caldo a 130 ° C per 45 min.
2. Preparazione del dispositivo PDMS
   1. PDMS mix base e induritore in un rapporto di 10:1 e versare su wafer in un contenitore chiuso fino ad uno strato di circa 5 mm ha formato sopra la cialda PDMS. Per ottenere un dispositivo PDMS di solo 1 mm di spessore, invece di girare il cappotto la cialda con PDMS a 100 giri/min per 2 min.
   2. Posizionare il contenitore in un essiccatore e applicare un vuoto (circa 85 kPa) per circa 30 min. Quindi, il calore il PDMS a circa 70° C per 1-2 h in un forno.
   3. Separare il dispositivo PDMS da wafer. Tagliare il PDMS in lastre, in modo che ciascun pezzo contiene una serie di scomparti. Nel caso in cui il PDMS sarà collegato a una configurazione di microfluidica, perforare (1 mm di diametro) come un ingresso e di uscita alle estremità del canale di alimentazione.
   4. Pulire il PDMS con alcol isopropilico e acqua deionizzata e asciugare con una pistola di azoto. Memorizzare il PDMS privo di polvere.

5. compartimenti Gene Expression

Nota: La procedura seguente descrive l'assembly di un titolare di esempio (Figura 3) per l'osservazione dell'espressione genica compartimenti su un microscopio invertito con un incubatore di gabbia per controllo della temperatura. Il titolare è stato costruito utilizzando materiali facilmente reperibili e strumenti (plastica spessa cloruro di polivinile (PVC) di 3.5-5 mm, viti e dadi, trapano) e può essere personalizzato per adattarsi a diversi tipi di microscopi. Tale che entrambe le parti del titolare sono pronte allo stesso tempo, deve essere eseguita la procedura descritta in 5.1 e 5.2.

1. Assemblea del supporto inferiore
   1. Preparare un chip Bephore con indicatore di allineamento (ad es. un graffio) e la colla sul supporto del chip utilizzando nastro adesivo biadesivo (Figura 3B). Il chip deve essere maggiore rispetto al dispositivo PDMS che lo copre.
   2. Immobilizzare uno o più geni sul chip (vedere paragrafi 2 e 3).
   3. Aggiungere del grasso vuoto intorno al foro centrale del proprietario del fondo, poi collegare il titolare di chip.
      Nota: Il titolare di chip ora aderisce al titolare del fondo con il grasso, pur mantenendo la possibilità di ri-posizionamento del chip nel piano x-y.
2. Assemblea del supporto superiore
   1. Preparare un truciolo PDMS sottile con scomparti utilizzando la procedura di rivestimento di rotazione al punto 4.2.1. Tagliare il PDMS più piccolo possibile, lasciando aperto un canale su un lato per consentire lo scambio di molecole rifiuti e precursore di diffusione.
   2. Pulire un vetro vetrino coprioggetti (24 mm x 24 mm, n. 1.5) e il retro del chip PDMS (lato senza compartimenti) con plasma ad ossigeno per 42 s (operati a 200 W e 0,8 mbar con il campione in una gabbia di Faraday).
   3. Posizionare il chip PDMS al centro del vetrino con gli scompartimenti rivolto verso l'alto. Cuocere il vetro con il PDMS per 1 h a 70 ° C.
   4. Aggiungere del grasso vuoto intorno al grande foro del supporto superiore.
   5. Prima di iniziare l'esperimento, pulire il vetrino e il PDMS chip con plasma ad ossigeno per 42 s per eseguire il rendering il PDMS idrofila.
   6. Posizionare il vetrino con il PDMS sul supporto superiore ( Figura 3) e premere delicatamente il vetro sul grasso (Figura 3).
3. Assemblea del supporto
   1. Preparare 100 µ l di un sistema di espressione senza cellula e tenerlo sul ghiaccio.
   2. Rimuovere il buffer dal chip delicatamente e lavarlo una volta con 10 µ l di sistema senza cellula di espressione. Successivamente, aggiungere 60 µ l di sistema senza cellula espressione sul chip e rimuovere la colla siliconica bicomponente dai bordi del chip (già rimosso nella Figura 3B).
   3. Aggiungere 20 µ l di sistema di espressione sul PDMS. Dopo aver posizionato la goccia sul PDMS, controllare rapidamente nel microscopio stereoscopico che gli scomparti sono ben bagnati e senza bolle d'aria. Se ci sono bolle d'aria, provare a lavarle con il resto del sistema senza cellula espressione.
   4. Per assemblare i due pezzi del titolare e per allineare chambers e spazzole di DNA, lavorare sotto un microscopio stereoscopico e immobilizzare il supporto inferiore con un braccio pinza, così le due viti e dadi ad alette sono facilmente accessibili con entrambe le mani (Figura 3D-F ).
   5. Inserire il supporto superiore titolare del fondo e abbassarla fino a quando le goccioline di sistema senza cellula espressione fusibile (Figura 3D). Controllare attraverso il microscopio stereoscopico se i compartimenti e il segno di allineamento sono in una regione simile nel piano x-y, altrimenti tirare sul primo detentore e riposizionare il vetro slide sul supporto superiore.
   6. Dal basso, avvitare la wingnuts fino a toccare il lato inferiore del titolare. Serrare con cautela la wingnuts, allineando i compartimenti e il chip in x-y-aereo tramite la maniglia nella parte inferiore del sostegno del chip (Figura 3E). Una volta in contatto, serrare i dadi ad alette solo molto leggermente (Figura 3F).
      Nota: Questo passaggio richiede qualche esperienza e dipende dall'impostazione sperimentale. Sotto il microscopio, i modelli di interferenza derivanti da liquido tra PDMS e vetro può indicare che la forza applicata è troppo piccola, mentre una minore intensità di fluorescenza (da un pennello di DNA o proteine espresse) al centro di un hint di vano a un troppo alto pressione (vedere anche informazioni supplementari, sezione 6).
   7. Spruzzare la spugna nel recinto anti-evaporazione con acqua e inserire il titolare nella casella. Riempire una siringa da 5 mL con colla siliconica bicomponente e utilizzarlo per sigillare la scatola (Figura 3).
   8. Trasferire la casella al microscopio a temperatura controllata e l'immagine del pennello del DNA e la reazione in microscopia a fluorescenza. Anche senza illuminazione, la fluorescenza del pennello DNA sfuma in un sistema senza cellula espressione. Il pennello mantiene comunque, sua attività, può essere indicato da espressione genica ripetuta dallo stesso pennello.
      Nota: Quando si utilizza una lastra di vetro di Bephore invece di un chip di silicio, la posizione (alto/basso) del chip PDMS e Bephore può essere scambiata, consentendo l'uso di obiettivi con più piccole distanze di lavoro.

6. sostenuta espressione in dispositivi microfluidici

Nota: La messa a punto sperimentale viene assemblato le parti mostrate in Figura 4A. Dettagli sull'assembly della fase a temperatura controllata sono dati in informazioni complementari (sezione 7).

1. Tubazione e sistema senza cellula di espressione
   1. Preparare il sistema di espressione senza cellula in una provetta (circa 200 µ l). Perle di polistirolo contrassegnati con le tinture fluorescenti possono essere aggiunti a monitor più tardi la portata attraverso un canale di alimentazione.
   2. Collegare il tubo di un regolatore di pressione. Porre la provetta in un serbatoio di ghiaccio di grandi dimensioni che mantiene il freddo per circa 12 ore. Riempire di ghiaccio se necessario.
      Nota: In alternativa a un regolatore di pressione, pompa a siringa fornisce una portata costante del sistema senza cellula espressione anche se i cambiamenti di resistenza di flusso, ad esempio a causa di bolle d'aria, che potrebbe aiutare con il lungo termine esperimenti.
   3. Collegare il tubo contenente il sistema di espressione senza cellula al PTFE tubi (diametro interno pari a 0,8 mm), che raggiunge a piatto riscaldato. Spezzettare un ago di siringa (diametro di 0,9 mm) 1-2 cm con estremità smussate e inserire un pezzo la tubazione di PTFE. Più tardi servirà come connettore per il PDMS. Se si tenta di ridurre al minimo la lunghezza della tubazione tra il palco e il tubo (Figura 4).
   4. Per raffreddare il tubo di PTFE, avvolgerlo intorno più grandi tubi di gomma che sono collegato a un serbatoio di acqua con ghiaccio e una pompa peristaltica. Fissarli con nastro adesivo insieme con nastro adesivo (Figura 4).
2. Assemblea del supporto superiore
   1. Pulire il lato piatto del chip PDMS con plasma ad ossigeno (42 s) e posizionarlo su una diapositiva di microscopia con fori di montaggio di ingresso e uscita di PDMS (Figura 4B). I fori nel vetro possono essere forati in anticipo con un testa di foratura del vetro. Assicurarsi che le micro-camere non si affacciano sul vetrino.
   2. Applicare nastro bi adesivo al lato piatto del titolare PDMS. Attaccare un pezzo di foglio nero (ad esempio da una maschera di litografia) nella regione tra i due fori del supporto per evitare la fluorescenza di fondo dal nastro adesivo.
   3. Attaccare il vetrino con il chip PDMS al titolare.
   4. Trattare il PDMS e il supporto PDMS con l'annesso vetro slide con plasma ad ossigeno in un plasma pulitore (42 s).
   5. Applicare grasso per vuoto intorno al grande foro nel supporto superiore e inserire il supporto PDMS (Figura 4B). Il titolare PDMS, ora aderisce al titolare del superiore, pur mantenendo la possibilità di ri-posizionamento in direzioni x-y.
   6. Collegare il tubo di PTFE con il connettore di ago di siringa verso l'ingresso del chip PDMS. Per facilitare l'accesso per il PDMS attraverso il supporto superiore, la piastra di plastica superiore può essere rimosso brevemente per questo e per il passaggio seguente.
   7. Inserire un secondo pezzo di PTFE tubi (circa 5 cm) con un connettore di ago di siringa all'uscita (Figura 4).
   8. Posizionare il supporto PDMS nel supporto superiore quindi è libero di muoversi in tutte le direzioni. Posto il primo detentore senza bloccare sul palco riscaldata come in Figura 4E senza serrare qualsiasi wingnuts.
   9. Con il microscopio, passare alla posizione dei compartimenti PDMS e centrale nella campo della telecamera. Non spostare il palco da questo punto in.
   10. Rimuovere il supporto superiore con il PDMS dal palco.
3. Piatto riscaldato e Bephore vetrino
   1. Impostare la temperatura del piatto riscaldato a 37 ° C
   2. Incollare una lastra di vetro di Bephore (n. 4) con le spazzole di gene alla fase temperatura controllata del microscopio di fluorescenza invertito utilizzando nastro biadesivo, con il segno di allineamento circa al centro del campo visivo del microscopio. Questo posizionamento del marchio allineamento assicura che i vani saranno abbassati all'incirca alla stessa regione.
   3. Acquisire un'immagine del corrispondente canale di fluorescenza del pennello gene e segnare la sua posizione nell'immagine della telecamera.
   4. Estrarre il tampone dalla spazzola gene, ma non lasciarlo andare a secco. Aggiungere 20 µ l del sistema cellulare - libera espressione al pennello di gene e utilizzare pinzette per rimuovere la cornice di colla del silicone.
4. Assemblaggio dell'apparato microfluidico
   1. Aggiungere pressione al tubo campione fino a quando il sistema di espressione senza cellula ha riempito la tubazione di PTFE e appare nella parte inferiore del dispositivo PDMS. Inoltre, Pipettare 10 µ l di sistema senza cellula espressione sul micro-chambers sul PDMS. Assicurarsi che i vani sono privo di bolle d'aria.
   2. Con cautela abbassare il fermo superiore su lastra di vetro e allineare le micro-camere con il pennello di gene. Prima che mark sia PDMS e allineamento raggiungere sullo stesso piano focale, è possibile utilizzare le piccole viti sul retro il titolare PDMS per allineare con precisione la posizione x-y e l'orientamento del dispositivo PDMS con il pennello di gene (Figura 4E).
   3. Tenere la posizione e premere il PDMS sul vetrino serrando i dadi ad alette lungo le viti che fissano il supporto superiore per il tavolino del microscopio (Figura 4E).
   4. Aumentare la pressione nel tubo che contiene il sistema di espressione senza cellula e monitor il flusso delle perline fluorescenti attraverso il canale di alimentazione (flusso tassi tra 0,5-5 µ l all'ora sono raccomandati) (Figura 4F). Se necessario, aumentare la pressione di PDMS sul vetro serrando i dadi ad alette.

Litografia in due fasi: la figura 5 Mostra il risultato di un processo litografico in due fasi su un vetrino con sovrapposizione pattern dei filamenti fluorescente contrassegnati DIS.

Espressione di una proteina fluorescente da un pennello di gene: Figura 6 dimostra l'espressione della proteina fluorescente YPet dal DNA immobilizzato. In diversi punti del tempo che abbiamo valutato il tasso di espressione genica in parte sbianca la proteina fluorescente e osservando il recupero del segnale di fluorescenza, trascurando il recupero immediato, che non deriva dalla espressione della proteina. Dopo lo sbiancamento prima a due ore di espressione, l'intensità di fluorescenza ha recuperato rapidamente e rosa superiore al suo valore prima lo sbiancamento. Dopo quattro e sei ore, la fluorescenza non ha recuperato alla sua intensità precedente, che indica che senza la fornitura di miscela fresca espressione, la reazione terminato dopo circa 3-4 h.

Accoppiamento di microfluidica: espressione genica possa essere sostenuta per lunghi periodi di tempo fornendo i vani di espressione con precursore ulteriori molecole tramite microfluidica. Figura 7 Mostra un tale sistema, permettendo l'espressione di YPet oltre 10 h.

Osservazione di TIRF: Bephore può essere applicato anche per studiare l'interazione delle proteine fluorescente contrassegnati con una spazzola di DNA a livello di singola molecola. Soprattutto in un ambiente rumoroso, Litografia aiuta a distinguere tra specifico e non specifico di interazione con il pennello o la superficie, rispettivamente. Figura 8 dà un esempio, con fluorescente contrassegnati T7 RNA polimerasi vincolanti o aderendo preferenzialmente al pennello di DNA rispetto alla superficie circostante.

Figura 1 : Bephore fotolitografia. R. un substrato con una superficie di diossido di silicio (SiO2) è coperto con uno strato di biotinylated polietilenglicole (PEG-bt), che è biocompatibile e permette per il fissaggio di un photocleavable del DNA tornante via interazioni di biotina-streptavidina. Qui, il PC contiene sequenza domini abcb * ed una modificazione di photocleavable (stella viola) ed è ibridato al filo del PH con dominio un *. B. illuminazione ultravioletta (UV) fende il PC, rilasciando un frammento di DNA (cb *) in soluzione. C-D. L'area di singolo filamento risultante sull'aids PC (b) come un punto d'appoggio per lo spostamento del PH di una fluorescente contrassegnato (stella verde) DIS strand. E. anche più a lungo, double-stranded DNA ("Template") può essere collegato alla superficie modellata. Tale DNA è preparato mediante PCR con primer che trasportano una sequenza DIS alle sue estremità 5', dove il primer e DIS sono separati da un distanziatore di glicole trietilenico per mantenere DIS singolo filamento durante la PCR (veda inoltre informazioni supplementari, sezioni 2-4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2 : Preparazione per fotolitografia del campione. R. mettere un chip Bephore con un indicatore di allineamento su una diapositiva di microscopia o un altro titolare di chip (ad es. il titolare in Figura 3B). Applicare la colla del silicone della due-componente come una barriera idrofoba lungo i bordi del chip (passi 3.1.2-3). B. posizionare la maschera sul supporto maschera. Qui, abbiamo rimosso l'iride della fermata campo e modificato il suo titolare così la maschera possa essere detenuta da piccoli magneti. Per un allineamento preciso (angolare) in multi-step Litografia, garantire che l'allineamento contrassegna il titolare e la partita di maschera (punto 3.2.1). C. per spostarsi sul chip e allineare la maschera con i segni di allineamento sul chip, fate scorrere il filtro rosso. Per l'esposizione ai raggi UV, inserire il filtro UV (passi 3.2.2-5). Figura riprodotta dalle informazioni di supporto del precedente lavoro27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Montaggio di un supporto per l'osservazione dell'espressione genica suddiviso in compartimenti. R. parti del titolare (unità righello: cm). B-C. Parte superiore e inferiore del titolare sono assemblati separatamente, con il supporto inferiore che trasportano un chip Bephore fantasia (vedere paragrafo 5.1) e titolare del top che trasportano un chip PDMS con scomparti (vedere paragrafo 5.2). D-F. Chip e PDMS attentamente entrano in stretto contatto, osservando contemporaneamente e l'allineamento di scomparti e spazzole di DNA in un microscopio stereoscopico (passi 5.3.1-6). G. prima di trasferire il titolare di un microscopio invertito, temperatura controllata, l'intero sistema è incapsulato in una scatola di anti-evaporazione (passi 5.3.7-8). Figura riprodotta dalle informazioni di supporto del precedente lavoro27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Microfluidici installazione e campione titolare per l'espressione genica di compartimenti stagni. R. parti del supporto del campione, il dispositivo PDMS, il tavolino del microscopio a temperatura controllata e la lastra di vetro di Bephore (unità righello: cm). B. una diapositiva di microscopia che trasportano il PDMS con scomparti è incollata al titolare PDMS ed esposta a plasma ad ossigeno insieme il PDMS in un plasma cleaner. Il PDMS viene quindi inserito nel supporto superiore (passi 6.2.2-5). C. il tubo di sistema senza cellula espressione è collegato ad un regolatore di pressione e posti su ghiaccio. La tubazione (linea rossa tratteggiata nella rientranza) per il sistema di espressione senza cellula viene raffreddata da gomma tubi (linea blu tratteggiata) attraverso cui ghiaccio l'acqua viene pompata da una pompa peristaltica (paragrafo 6.1). D. Il tubo è collegato nella posizione di ingresso sul dispositivo PDMS. Un altro pezzo di tubo è collegato alla presa (passi 6.2.6-7). E. il superiore titolare è disposto sulla fase di microscopio e attentamente abbassato verso la diapositiva di Bephore. Il titolare PDMS può essere spostato ancora nel piano x-y per allineare i compartimenti nel PDMS con il pennello di gene sul chip Bephore. Il wingnuts vengono utilizzato per premere il PDMS sul chip Bephore e fissare il supporto superiore per il tavolino del microscopio (passi 6.4.1-3). F. il sistema di espressione senza cellula viene pompata attraverso i micro-canali nel PDMS ed espressione genica dai pennelli di DNA può essere monitorato in epifluorescenza (passo 6.4.4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Fotolitografia in due fasi. A-B. Fluorescente etichettati oligonucleotidi (verde: ATTO 532; rosso: Alexa Fluor 647) sono stati consecutivamente immobilizzati su una Bephore vetro diapositiva tramite maschera proiezione Litografia con tempi di esposizione di 45 s. C. Sovrapposizione di sottofigure A e B, dimostrando il preciso allineamento delle singole esposizioni. Scala bar: 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Compartimenti stagni di espressione genica. R. pennello A DNA su una lastra di vetro Bephore (tempo di esposizione UV: 2 min), codifica per la proteina fluorescente YPet è stata stata allineata con un vano su un chip PDMS (Vedi sezione 5 e Figura 3). B. espressione genica nella camera con il DNA ha dato un segnale forte fluorescenza con un gradiente di concentrazione di proteina formando lungo un canale, che collegava la camera per il mix di espressione di fuori del dispositivo PDMS. La camera di controllo senza geni immobilizzati è rimasto relativamente scura. C. il profilo di intensità di fluorescenza nel tempo per entrambe le camere. Ogni due ore la proteina fluorescente è stata parzialmente sbiancata (frecce nere) per controllare se l'espressione era ancora attivo. Dopo 4 h, la fluorescenza non ha recuperato alla sua intensità precedente, che indica che l'espressione aveva terminato. Scala bar: 300 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Espressione genica compartimenti sostenuta. R. pennello A DNA su una lastra di vetro Bephore (tempo di esposizione UV: 2 min), codificanti per YPet è stata stata allineata con un vano su un chip PDMS. I vani sono collegati a un canale di alimentazione (freccia bianca) attraverso il quale sistema di espressione senza cellula viene pompato (Vedi sezione 6 e Figura 4). B. il vano contenente il pennello gene Mostra un segnale di fluorescenza da YPet espressione (in verde) per il sistema di espressione genica senza cellula. Il vano vicino senza un pennello di gene rimane relativamente scuro. Componenti freschi del sistema senza cellula espressione fluire attraverso il canale di alimentazione e diffondono in scomparti, mentre i prodotti di scarto vengono trasportati via. C. il profilo di intensità di fluorescenza nel tempo per entrambe le camere. Le proteine fluorescenti sono stati parzialmente sbiancate in diversi punti nel tempo (frecce nere) per verificare se l'espressione era ancora attivo. A causa del flusso nel canale di approvvigionamento, espressione genica è stata mantenuta per almeno 10 h. (il picco nella traccia rosso contrassegnato dalla freccia rossa è stato causato da una bolla d'aria che temporaneamente prosciugato la soluzione dai comparti). Scala bar: 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Studi di singola molecola su Bephore vetro diapositive nella microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM). R. obiettivo-tipo TIRFM permette l'imaging a singola molecola vicino l'interfaccia acqua-vetro. Abbiamo immobilizzato fluorescente identificati geni (verde, ATTO 532, tempo di esposizione UV: 2 min) con un T7 promotore lungo litograficamente definite strisce e osservato il comportamento di T7 RNA polimerasi (arancia, etichettati con Alexa Fluor 647) interagendo con la superficie. B. immagine di fluorescenza Mostra due strisce di geni immobilizzati. C. T7 RNA polimerasi allegare in modo specifico e non specifico alla superficie (singola immagine, tempo di esposizione di 50 ms). D. Un'immagine media ottenuta da tutti i fotogrammi di un video di fluorescenza (5.000 fotogrammi come in subfigure C) espone l'interazione specifica della polimerasi del RNA con la spazzola di DNA. Scala bar: 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.