Un protocollo dettagliato è descritto per la separazione, identificazione e caratterizzazione di proteoforms nei campioni della proteina mediante capillare zonale elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS). Il protocollo può essere utilizzato per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma.
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Articolo metodologico
Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zona capillare elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS) è stata riconosciuta come uno strumento utile per proteomica di top-down che mira a caratterizzare proteoforms nel complessi proteomi. Tuttavia, l'applicazione di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica è stato ostacolato dalla scarsa capacità di caricamento del campione e stretta finestra di separazione di CZE. Qui, un protocollo è descritto usando CZE-MS/MS con un volume di caricamento del campione microliter-scala e una finestra di separazione 90 min per proteomica su larga scala di alto verso il basso. La piattaforma CZE-MS/MS è basata su un lineare poliacrilammide (LPA)-rivestito separazione capillare con flusso elettroosmotico estremamente basso, un metodo di concentrazione dinamica campioni online basati su pH-giunzione ad alta efficienza per l'impilamento della proteina, un interfaccia di flusso CE-MS Electro-cineticamente pompato guaina con sensibilità estremamente elevata e un trappola ionica spettrometro di massa ad alta risoluzione di massa e velocità di scansione. La piattaforma può essere utilizzata per la caratterizzazione ad alta risoluzione dei campioni semplice della proteina intatta e la caratterizzazione su larga scala di proteoforms in vari complessi proteomi. Ad esempio, una separazione altamente efficiente di una miscela di proteine standard e una rivelazione altamente sensibile di molte impurità utilizzando la piattaforma è dimostrata. Come altro esempio, questa piattaforma in grado di produrre oltre 500 proteoform ed eseguire 190 identificazioni di proteina da un proteoma di Escherichia coli in una singola CZE-MS/MS.
Introduzione
Top-down proteomica (TDP) si propone per la caratterizzazione su larga scala di proteoforms all'interno di un proteoma. TDP si basa sulla separazione liquido-fase effettiva di proteine intatte prima dell'analisi electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (ESI-MS/MS) a causa dell'elevata complessità e grande concentrazione gamma dinamica del proteoma1,2 ,3,4,5. L'elettroforesi capillare zonale (CZE) è una tecnica potente per la separazione di biomolecole basato sul loro rapporto dimensione-a-carica
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Protocollo
1. preparazione del rivestimento di LPA sulla parete interna del capillare separazione
-
Pretrattamento del capillare
- Svuotare un capillare di silice fusa (120 cm di lunghezza, 50 µm di diametro interno [ID], 360 µm di diametro esterno [od]) successivamente con 500 µ l di 1 M di idrossido di sodio, acqua deionizzata, acido cloridrico 1M, acqua deionizzata e LC-MS metanolo utilizzando una pompa a siringa.
- Asciugare il capillare con gas azoto (10 psi, ≥ 12 h) e riempire il vaso capillare con 50% (v/v) 3-(trimetossisilil) metacrilato di propile in metanolo utilizzando una pompa a siringa. Entrambe le estremità del capillare ....
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Risultati
La figura 1 Mostra un diagramma del sistema dinamico di basati su pH-giunzione CZE-ESI-MS utilizzato nell'esperimento. Una lunga spina del campione in un buffer di base viene iniettata in una separazione rivestite con LPA capillare riempita con un acido BGE. Dopo l'applicazione di alte tensioni I e II, gli analiti nella zona di esempio sarà concentrato tramite il metodo di giunzione pH dinamico. Per valutare le prestazioni del sistema CZE-MS, una mis.......
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Discussione
Qui forniamo un protocollo dettagliato per utilizzare CZE-MS/MS per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e per l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma. Nella Figura 1è riportato un diagramma del sistema CZE-ESI-MS/MS. Ci sono quattro passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la preparazione del rivestimento di LPA di alta qualità sulla parete interna della separazione capillare è estremamen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il gruppo di Heedeok Hong presso il dipartimento di chimica, Michigan State University, per gentilmente fornire le cellule di Escherichia coli per gli esperimenti. Gli autori ringraziano il sostegno del National Institute of General Medical Sciences, il National Institutes of Health (NIH) attraverso Grant R01GM118470 (per X. Liu) e Grant R01GM125991 (al L. sole e X. Liu).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| capillare in silice fusa | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µ m i.d. 360 µ M o.d. |
| Pellet di idrossido di sodio | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Acqua corrosiva |
| di grado LC-MS | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Acido cloridrico | Fisher Scientific | SA48-1 | Metanolo corrosivo |
| Fisher Scientific | A456-4 | Tossico, pericolo per la salute | |
| 3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile | Sigma-Aldrich | M6514 | sensibile all'umidità e al calore |
| Acros Organics | 423805000 | ||
| Acrilammide | Acros Organics | 164855000 | Tossico, pericolo per la salute |
| Persolfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A3678 | Pericolo per la salute, lisozima ossidante |
| Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| citocromo C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Mioglobina | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-caseina | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Anidrasi carbonica | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Ditiotreitolo | Sigma-Aldrich | D0632 | Pericolo per la salute |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Pericolo per la salute |
| Acido formico | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosivo, Pericolo per la salute |
| Colonna trappola C4 | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 &; m particelle, 300 & Aring; pori, 4,0 mm d.i. 10 mm di lunghezza |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Tossico, ossidante Bicarbonato |
| di ammonio | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Filtri a flusso rapido Nalgene | Thermo Scientific | 126-0020 | 0,2 &; m CN e |
| E. coli | K-12 MG1655 | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Saggio BCA Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Thermo Scientific | 23250 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| Sistema HPLC per la desalinizzazione delle proteine | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acido acetico | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autocampionatore | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Interfaccia di flusso della guaina pompata elettrocineticamente | CMP Scientific | ||
| Q Spettrometro di massa ibrido HF Exactive Quadrupolo-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
| Estrattore per micropipette Sutter fiammato/marrone | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Disgregatore cellulare ad ultrasuoni per lisi cellulare | Branson | 101063196 | Modello S-250A |
| Concentratore di vuoto | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
Riferimenti
- Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
- Catherman, A. ....
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Ristampe e permessi
