Articolo metodologico

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

DOI:

10.3791/58644

⸱

24 ottobre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo dettagliato è descritto per la separazione, identificazione e caratterizzazione di proteoforms nei campioni della proteina mediante capillare zonale elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS). Il protocollo può essere utilizzato per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma.

Abstract

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Zona capillare elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS) è stata riconosciuta come uno strumento utile per proteomica di top-down che mira a caratterizzare proteoforms nel complessi proteomi. Tuttavia, l'applicazione di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica è stato ostacolato dalla scarsa capacità di caricamento del campione e stretta finestra di separazione di CZE. Qui, un protocollo è descritto usando CZE-MS/MS con un volume di caricamento del campione microliter-scala e una finestra di separazione 90 min per proteomica su larga scala di alto verso il basso. La piattaforma CZE-MS/MS è basata su un lineare poliacrilammide (LPA)-rivestito separazione capillare con flusso elettroosmotico estremamente basso, un metodo di concentrazione dinamica campioni online basati su pH-giunzione ad alta efficienza per l'impilamento della proteina, un interfaccia di flusso CE-MS Electro-cineticamente pompato guaina con sensibilità estremamente elevata e un trappola ionica spettrometro di massa ad alta risoluzione di massa e velocità di scansione. La piattaforma può essere utilizzata per la caratterizzazione ad alta risoluzione dei campioni semplice della proteina intatta e la caratterizzazione su larga scala di proteoforms in vari complessi proteomi. Ad esempio, una separazione altamente efficiente di una miscela di proteine standard e una rivelazione altamente sensibile di molte impurità utilizzando la piattaforma è dimostrata. Come altro esempio, questa piattaforma in grado di produrre oltre 500 proteoform ed eseguire 190 identificazioni di proteina da un proteoma di Escherichia coli in una singola CZE-MS/MS.

Introduzione

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Top-down proteomica (TDP) si propone per la caratterizzazione su larga scala di proteoforms all'interno di un proteoma. TDP si basa sulla separazione liquido-fase effettiva di proteine intatte prima dell'analisi electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (ESI-MS/MS) a causa dell'elevata complessità e grande concentrazione gamma dinamica del proteoma1,2 ,3,4,5. L'elettroforesi capillare zonale (CZE) è una tecnica potente per la separazione di biomolecole basato sul loro rapporto dimensione-a-carica6. CZE è relativamente semplice, che richiede solo un'aperta tubolare fusi con silice capillare, un elettrolita di sfondo (BGE) e un alimentatore. Un campione di proteine intatte possa essere caricato in capillare mediante pressione o tensione e separazione viene avviato immergendo entrambe le estremità del capillare nel BGE e applicando una tensione elevata. CZE possibile approccio ultra-alta efficienza di separazione (> 1 milione piastre teoriche) per la separazione di biomolecole7. CZE-MS ha una sensibilità maggiore drasticamente rispetto ampiamente usato cromatografia liquida a fase inversa (RPLC)-MS per l'analisi di proteine intatte8. Anche se CZE-MS ha un grande potenziale per su larga scala discendente proteomica, sua ampia applicazione in proteomica ha stato ostacolato da diversi problemi, tra cui una bassa capacità di caricamento del campione e la finestra stretta separazione. Il campione tipico volume in CZE di carico è di circa l'1% del volume totale capillare, che di solito corrisponde a meno di 100 nL9,10,11. La finestra di separazione di CZE è solitamente meno di 30min a causa della forte elettroosmotico flusso (EOF)9,10. Questi problemi limitano il CZE-MS/MS per l'identificazione di un gran numero di proteoforms e proteoforms basso abbondante da un complesso proteome.

Molto sforzo è stato fatto per migliorare il volume di CZE tramite campioni online concentrazione metodi (ad esempio, solid-phase microextraction [SPME]12,13, campo-migliorato campione d'impilamento [FESS]9 di carico del campione , 11 , 14e dinamico pH junction15,16,17,18). È più semplice di SPME, richiedendo solo una differenza significativa tra il tampone e il BGE in conducibilità e pH FESS e dinamico pH junction. FESS impiega un tampone con molto minore conducibilità di BGE, portando a un accatastamento di analiti sul confine tra la zona di esempio e la zona BGE nel capillare. Giunzione pH dinamico utilizza una spina di esempio di base (ad es., bicarbonato di ammonio 50 mM, pH 8) e un acido BGE (ad es., acido acetico 5% [v/v], pH 2.4) su entrambi i lati della spina del campione. Su richiesta di un'alta tensione positiva alla fine iniezione del capillare, titolazione della spina esempio base si verifica, messa a fuoco gli analiti in una spina stretta prima di subire una separazione CZE. Recentemente, il gruppo di sole sistematicamente rispetto FESS e giunzione pH dinamico per l'impilamento online di proteine intatte, dimostrando quella giunzione pH dinamico potrebbe produrre prestazioni decisamente migliori rispetto a FESS per la concentrazione online di proteine intatte quando il volume di iniezione del campione era 25% del volume totale capillare19.

Capillari di separazione neutro rivestiti (ad es., poliacrilammide lineare [LPA]) sono stati impiegati per ridurre l'EOF nel capillare, rallentando la separazione CZE e ampliando la separazione finestra20,21. Recentemente, il gruppo Dovichi sviluppato una procedura semplice per la preparazione del rivestimento di LPA stabile sulla parete interna dei vasi capillari, che utilizzano ammonio persolfato (APS) come l'iniziatore e la temperatura (50 ° C) per la produzione di radicali liberi e polimerizzazione22 . Molto recentemente, il gruppo di sole impiegava la separazione rivestite con LPA capillare e il metodo di giunzione pH dinamico per la separazione di CZE di proteine intatte, raggiungendo un volume e una finestra di separazione 90 min19di carico del campione di microliter-scala. Questo sistema CZE apre la porta all'utilizzo di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica.

CZE-MS richiede un'interfaccia altamente robusta e sensibile alla coppia CZE a MS. Tre interfacce di CE-MS sono stati ben sviluppati e commercializzati nella storia della CE-MS, e sono la guaina co-axial-flow interfaccia23, l'interfaccia sheathless utilizzando una punta porosa come il ESI emettitore24e la electro-cineticamente guaina pompato flusso interfaccia25,26. La guaina-flow-interfaccia-based electro-cineticamente pompata CZE-MS/MS ha raggiunto un limite di basso zeptomole peptide rilevamento9, oltre 10.000 identificazioni del peptide (IDs) dal HeLa delle cellule proteoma in una singola eseguita14, una caratterizzazione veloce di proteine intatte11e le analisi altamente stabile e riproducibile di biomolecole26. Recentemente, il capillare di separazione LPA-rivestito, il metodo di giunzione pH dinamico e l'interfaccia di flusso elettro-cineticamente pompato guaina sono stati utilizzati per su larga scala discendente proteomica un proteoma di Escherichia coli (Escherichia coli)19 ,27. La piattaforma CZE-MS/MS si avvicinò oltre 500 proteoform ID in una singola esecuzione19 e quasi 6.000 proteoform ID tramite accoppiamento con cromatografia di esclusione dimensionale (SEC)-RPLC frazionamento27. I risultati mostrano chiaramente la capacità di CZE-MS/MS per proteomica su larga scala di alto verso il basso.

Qui, una procedura dettagliata dell'utilizzo di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica è descritto. CZE-MS/MS il sistema impiega il capillare LPA-rivestito per ridurre il EOF nel capillare, il metodo di giunzione pH dinamico per la concentrazione delle proteine, l'interfaccia di flusso guaina electro-cineticamente pompato per l'accoppiamento CZE per MS, un orbitrap online massa spettrometro per la raccolta degli spettri MS e MS/MS di proteine e un software TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificazione e caratterizzazione) per ricerca ID tramite database proteoform.

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Protocollo

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1. preparazione del rivestimento di LPA sulla parete interna del capillare separazione

  1. Pretrattamento del capillare
    1. Svuotare un capillare di silice fusa (120 cm di lunghezza, 50 µm di diametro interno [ID], 360 µm di diametro esterno [od]) successivamente con 500 µ l di 1 M di idrossido di sodio, acqua deionizzata, acido cloridrico 1M, acqua deionizzata e LC-MS metanolo utilizzando una pompa a siringa.
    2. Asciugare il capillare con gas azoto (10 psi, ≥ 12 h) e riempire il vaso capillare con 50% (v/v) 3-(trimetossisilil) metacrilato di propile in metanolo utilizzando una pompa a siringa. Entrambe le estremità del capillare con gomma della silice ed esso Incubare a temperatura ambiente per almeno 24 h.
      Nota: Durante questa fase, la parete interna del capillare è funzionalizzata con C = C. Longer risultati di incubazione nel migliore rivestimento capillare a causa di una reazione più completa.
    3. Tagliare una piccola porzione (~ 5 mm) del capillare da entrambe le estremità con una pietra che fende. Sciacquare il capillare con metanolo (500 µ l) utilizzando una pompa a siringa per ripulire i reagenti non reagiti. Asciugare il capillare con gas azoto (10 psi, ≥ 12 h).
  2. Preparazione del rivestimento LPA
    Nota: Questa procedura si basa su Zhu et al. 22 con modifiche minori.
    1. Preparare una soluzione di acrilammide (40 mg di acrilammide in 1 mL di acqua) e la soluzione di ammonio persolfato (APS) (5% [p/v] in acqua).
    2. Aggiungere 2-3 µ l della soluzione APS in 500 µ l di soluzione di acrilammide, vortice la miscela e degassare esso con gas azoto per 5 min rimuovere l'ossigeno nella soluzione.
    3. Caricare la miscela nel capillare pretrattati con un aspirapolvere, sigillare entrambe le estremità del capillare con gomma della silice e viene quindi incubato in un bagno di acqua a 50 ° C per 40 min.
    4. Rimuovere una piccola porzione (~ 5 mm) del capillare da entrambe le estremità con una pietra che fende. Spingere la soluzione non assorbita da capillare con acqua (200 µ l), utilizzando la pompa a siringa.
      Nota: Assicurarsi che il polimero spinto fuori il capillare è una consistenza simil-gel di agarosio. Una fase di incubazione più lungo (fino a ~ 45-50 min) può provocare un migliore rivestimento capillare. Con periodi più lunghi di reazione, il capillare potrebbe diventare bloccato e ad alta pressione è necessaria per spingere fuori il polimero con acqua. Una pompa HPLC può essere utilizzata per questo scopo.

2. incisione del capillare con acido fluoridrico

Attenzione: Utilizzare le procedure di sicurezza adeguate durante la gestione di soluzioni di acido fluoridrico (HF). Tutte le operazioni correlate a HF devono essere fatte in una cappa chimica. Prima di qualsiasi operazione di HF, assicurarsi che il 2,5% di calcio gluconato gel è disponibile per l'uso in caso di esposizione. Guanti doppi sono necessari, un guanto di nitrile tipico all'interno e un pesante neoprene guanto all'esterno. Indossare un camice da laboratorio e occhiali di sicurezza chimica. Dopo le operazioni di HF, separare rifiuti pericolosi liquidi e solidi. I rifiuti liquidi di HF devono essere neutralizzati immediatamente con una soluzione di idrossido di sodio ad alta concentrazione per l'archiviazione temporanea prima di pick-up dei rifiuti. I rifiuti solidi di HF deve essere temporaneamente memorizzati in un contenitore di plastica che è fiancheggiato da due sacchetti di Ziploc un-gallone plastica spesse e un coperchio. Sia i rifiuti solidi e liquidi devono essere etichettati correttamente.

  1. Bruciare una porzione del capillare utilizzando una fiamma delicata (ad es., tasca accendino) per rimuovere il polyimide-rivestimento esterno (1 cm di lunghezza) di circa 4 cm da un'estremità del capillare. Pulire delicatamente la parte bruciata del capillare utilizzando per rimuovere la poliimmide rivestimento completamente.
    Nota: Procedere con cautela, come la porzione del capillare senza il rivestimento di polyimide sarà un po' fragile.
  2. Praticare un piccolo foro all'estremità di un tubo di 200-µ l circa le stesse dimensioni come il diametro esterno del capillare a tenere sufficientemente capillare in posizione una volta che si è infilata attraverso questo foro. Infilare l'estremità del capillare che è vicino alla parte bruciata attraverso il foro fino a quando la parte bruciata è nel tubo.
    Nota: Si consiglia di testare le dimensioni del foro con l'estremità del capillare dalla parte bruciata per garantire la dimensione corretta, come la parte bruciata del capillare è fragile.
  3. Aggiungere ~ 150 µ l di HF (48-51% soluzione acquosa) al tubo 200-µ l in modo che la soluzione di HF è circa a metà la parte bruciata sul capillare. Incubare il capillare della soluzione di HF a temperatura ambiente per 90-100 min.
    Nota: È consigliabile che viene creato un altro foro nel coperchio del tubo e qualche piccolo oggetto (ad es., un piccolo puntale) viene utilizzato per reggere il tubo, mentre l'incubazione si svolge. La punta della pipetta possa essere usata per perforare la schiuma o qualche altra piattaforma solida da cui la camera di reazione può appendersi, creando un ambiente sicuro. Posizionare gli asciugamani di carta sotto il tubo contenente HF e seguire le procedure corrette in caso di una caduta.
  4. Rimuovere il capillare dal tubo e lavare l'esterno con acqua deionizzata per rimuovere qualsiasi residuo HF.
    Nota: Assicurarsi che il diametro esterno del capillare alla parte più stretta della parte bruciata è ora inferiore a 100 µm, come dovrebbe essere.
  5. Tagliare la parte incisa del capillare nel mezzo della parte più stretta, usando una pietra che fende per produrre un capillare di separazione con meno di 100 µm in o.d. a un'estremità. Tagliare l'estremità del capillare per ottenere una separazione di 1 m capillare non incisi.
    Nota: Smaltire i rifiuti di HF secondo il protocollo istituzionalmente prescritto.

3. preparazione dei campioni

  1. Preparazione di una miscela di proteine standard
    1. Preparare una miscela di proteine standard contenenti citocromo c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lisozima (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-caseina (24 kDa, 0,4 mg/mL), mioglobina (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), anidrasi carbonica (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) e albumina di siero bovino (BSA, 66,5 kDa 1,0 mg/mL) in LC-MS del grado dell'acqua come una soluzione di riserva.
      Nota: La soluzione di riserva può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per l'uso.
    2. Diluire la soluzione di riserva di un fattore 10 con una soluzione di bicarbonato di ammonio di 50 mM (pH 8.0) in acqua di grado di LC-MS per l'analisi di CZE-MS.
      Nota: Filtrare la soluzione di bicarbonato di ammonio prima dell'uso con un filtro a membrana (ad es., 0,2 µm della membrana di nitrato di cellulosa e 50 mm di diametro).
  2. Preparazione di un campione di e. coli
    1. Cellule di e. coli (K-12 MG1655) di cultura in LB medium a 37 ° C agitando a 225 giri/min fino a quando il valore di OD600 si avvicina a 0,7. Raccogliere Escherichia coli cellule tramitecentrifugazione (3.283 x g, 10 min) e lavarli più volte con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere il mezzo.
    2. Sospendere le cellule di e. coli nel buffer di lisi contenenti urea 8 M, inibitori della proteasi e 100 mM ammonio bicarbonato (pH 8.0) e ultrasonicate in ghiaccio per 15 minuti con un disgregatore cella ultrasonica con un corno di Coppa per lisi cellulare completo.
      1. Impostare il Duty Cycle (%) a 50 e il Controllo in uscita a 7 per il disgregatore cella ultrasonica.
    3. Centrifugare il lisato a 18.000 x g per 10 min. raccogliere il surnatante e gettare il pellet. Utilizzare una piccola aliquota del surnatante per la misura della concentrazione di proteine con il dosaggio di acido (BCA) bicinconinico.
      Nota: Il lisato deve essere diluito almeno di un fattore tre per ridurre la concentrazione di urea inferiori a 3 M per diventare compatibile con il dosaggio BCA. Il dosaggio BCA è effettuato basata sulla procedura del produttore.
    4. Mescolare 1 mg di proteine di e. coli con acetone freddo con un rapporto di volume di 1:4 e mantenere la miscela a-20 ° C durante la notte per precipitare le proteine.
      Nota: Eseguire tutti gli esperimenti utilizzando acetone in una cappa chimica.
    5. Rotazione verso il basso proteine precipitate (12.000 x g, 5 min) e rimuovere il surnatante. Lavare la pallina con acetone freddo nuovamente (stesso volume come prima) e girare di nuovo verso il basso.
    6. Rimuovere il supernatante e lasciar asciugare per un paio di minuti la cappa chimica il pellet.
      Nota: Non stata il pellet di proteina.
    7. Sciogliere il precipitato proteine di e. coli (1 mg) in 200 µ l di urea 8 M in 100 mM ammonio bicarbonato (pH 8.0).
    8. Denaturare, ridurre e alchilata il campione.
      1. Incubare il campione a 37 ° C per 30 min denaturare le proteine.
      2. Ridurre con ditiotreitolo (DTT) aggiungendo 2 µ l di soluzione DTT 1 M (in 100 mM bicarbonato d'ammonio) nel campione e incubare il campione a 37 ° C per 30 min.
      3. Alchilata le proteine con iodoacetamide (IAA) con l'aggiunta di 6 µ l di soluzione di IAA di 1 M (in 100 mM bicarbonato d'ammonio) al campione e incubare il campione per 20 min a temperatura ambiente al buio.
      4. Placare la IAA in eccesso con DTT aggiungendo 2 µ l di soluzione 1 M DTT e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Acidificare il campione con acido formico (FA) per ottenere una concentrazione finale FA dell'1% (v/v).
        Nota: Riduzione e alchilazione vengono eseguiti per facilitare lo svolgersi delle proteine per frammentazione a valle. Quei passi perderà le informazioni dei legami bisolfurico. Se l'obiettivo è quello di studiare i legami disolfuro sulle proteine, evitare questi passaggi. Ricordarsi di gestire tutte le soluzioni concentrate di acido in una cappa chimica.
    9. Dissalare l'esempio utilizzando una colonna di trappola di C4 (ad es., 4 mm di i.d., 10 mm di lunghezza, imballato con particelle di 3 µm avendo 300-Å pori) con un sistema HPLC. Utilizzare un rivelatore UV a lunghezza d'onda di 254 nm per il rilevamento.
      1. Impostare la velocità di flusso della fase mobile a 1 mL/min attiva la colonna irrigando con 80% (v/v) acetonitrile (ACN), 0,1% FA in acqua per 10 min ed equilibrare irrigando con 2% (v/v) ACN, 0,1% FA in acqua per 10 min.
      2. 500-µ g proteine su colonna di carico e desalt da li scarico con 2% (v/v) ACN, 0,1% FA in acqua per 10 minuti ad una velocità di flusso di 1 mL/min.
      3. Eluire le proteine con 80% (v/v) ACN, 0,1% FA in acqua per 3 minuti ad una velocità di flusso di 1 mL/min. Raccogliere l'eluato e si lyophilize con un concentratore a vuoto.
        Nota: La colonna di trappola C4 può essere utilizzata per dissalare grandi quantità di proteine ma non basso microgrammi di proteine a causa di perdita del campione possibile. Per materiali della proteina limitata, considerare l'utilizzo di puntali per pipette con C4 media per proteina desalificazione. Fare attenzione a non stata le proteine quando il campione di liofilizzazione.
    10. Sciogliere il 500 µ g di proteine (supponendo che nessuna perdita di campione durante la preparazione del campione) in 250 µ l di bicarbonato di ammonio 50 mM (pH 8.0) per gli esperimenti CZE-MS.

4. set-up del sistema CZE-MS/MS e analisi dei campioni

  1. Set-up del sistema CZE
    1. Preparare un BGE contenente 5% o 10% (v/v) di acido acetico (pH ~2.4 o ~ 2.2) in LC-MS del grado dell'acqua. Mettere ~1.5 mL della BGE in un flaconcino BGE che corrisponde con il tampone dell'autocampionatore CZE.
      Nota: Assicurarsi BGE fresco ogni settimana e il cambio della soluzione BGE nel flacone ogni giorno per evitare qualsiasi contaminazione.
    2. Aggiungere una soluzione (5-200 µ l) di campione in una provetta di inserto e mettere il tubo di inserimento in un thatmatches di fiala del campione con il vassoio di campione dell'autocampionatore CZE.
    3. Caricare il campione, il BGE e la separazione capillare nell'autocampionatore CZE.
      Nota: La lingua utilizzata nel presente protocollo più accuratamente riflette l'uso di un campionatore particolare (Vedi Tabella materiali), ma i principi possono essere applicati ad altri campionatori.
      1. Selezionare esempio caricare nella pagina controllo manuale dell'autocampionatore CZE. Caricare il flaconcino BGE in tampone di autocampionatore, notando la sua posizione in tampone. Caricare la fiala del campione nel vassoio di campione di autocampionatore, notando la sua posizione nel vassoio di campione.
        Nota: Può essere usato nel controllo manuale cliccando sull'immagine dello strumento per il Monitoraggio dei dispositivi nella pagina principale strumento e quindi selezionando manuale sotto il Controllo diretto.
      2. Caricare il capillare di separazione nell'autocampionatore CZE, usando l'estremità del capillare non incisi. Mettere l'autocampionatore per la posizione di allineamento tramite controllo manuale. Infilare l'estremità non-inciso del capillare in un buco che viene utilizzato per contenere la separazione capillare fino a quando esso non può essere fisicamente filettato ulteriormente.
        Nota: In questo caso, alla fine del capillare è quasi alla stessa altezza come la fine dell'elettrodo, e almeno 50 µ l del campione è necessaria nella fiala del campione per assicurarsi che l'estremità del capillare è immersa nel campione durante l'iniezione. Se il volume del campione è bassa (cioè, 5 µ l), l'altezza dell'estremità di iniezione del capillare deve essere regolata come descritto nel passaggio 4.1.3.2.1.
        1. Se il volume del campione è inferiore a 50 µ l (cioè, 5 µ l), regolare l'altezza dell'estremità di iniezione del capillare. Mettere l'autocampionatore in Standby utilizzando il controllo manuale. Digitare la posizione del campione nel sistema e spostare il capillare al campione. Spingere l'estremità di iniezione del capillare ulteriormente fino a raggiungere il fondo del flaconcino campione.
          Nota: In questo caso, l'iniezione del campione può essere eseguita con un campione di soli 5 µ l nel flaconcino.
      3. Continuando a utilizzare il controllo manuale, a filo capillare con il BGE per 20 min, utilizzando una pressione di 20 psi.
  2. Set-up dell'interfaccia CZE-MS
    1. Tirare un capillare in vetro borosilicato (1 mm di diametro esterno, mm 0,75 a i.d., 10 cm di lunghezza) in due electrospray emettitori con un orifizio di 20-40 µm in o.d.
      Nota: Mantenere la lunghezza dell'emettitore electrospray come 4-5 cm e tagliare con una pietra che fende se necessario. Smaltire tutti i vetri dei rifiuti in un contenitore di sharps. Le impostazioni per ottenere consigli di 20 - 40 µm sono come segue. Impostare il calore a 498, il pull a 5, la velocità a 10, il ritardo di 150 e la pressione a 200. Verificare la dimensione degli emettitori con un microscopio prima dell'uso. Se necessario, regolare i parametri leggermente.
    2. Montare un flusso commerciale guaina electro-cineticamente pompato interfaccia (Vedi Tabella materiali) alla parte anteriore dello spettrometro. Riempire il serbatoio tampone di guaina con un buffer contenente 10% (v/v) metanolo e 0.2% (v/v) FA in acqua di grado di LC-MS.
    3. Lavare la T nell'interfaccia con la guaina buffer tramite l'applicazione di pressione manualmente con una siringa. Infilare l'estremità 1-mm-diametro esterno di un emettitore di electrospray attraverso una tubazione di manica e collegare l'emettitore con una porta della Ttramite un raccordo. Semplicemente lavare la T manualmente nuovamente con una siringa per riempire l'emettitore con il buffer di guaina.
    4. Regolare la distanza tra l'orifizio dell'emettitore e l'ingresso dello spettrometro a ~ 2 mm con l'aiuto della fotocamera che è venuto con l'interfaccia. Applicare una tensione di 2 - 2.2 kV presso il flaconcino di buffer di guaina per electrospray. Regolare la tensione di spray per raggiungere una stabile electrospray.
      Nota: Se nessun electrospray o un electrospray instabile viene rilevato, controllare l'interfaccia per assicurarsi che non ci sono nessun grandi bolle l'emettitore, in Te nelle tubazioni che utilizzato per collegare il flaconcino di buffer di guaina e la T. La distanza tra l'orifizio dell'emettitore e l'ingresso di uno spettrometro di massa può essere approssimativamente stimata confrontando con il o.d. 1 mm dell'emettitore. La tensione di spruzzo dipende dalle dimensioni dell'emettitore. Per emettitori di 20 - 40 µm, 2-2.2 kV è abbastanza buono. Ricorda di essere sempre attenti quando si usano alte tensioni.
    5. Disattivare la tensione di spruzzo e delicatamente infilate l'estremità Incisa della separazione capillare attraverso la T nell'emettitore fino a quando esso non può essere spinto più ulteriormente. Applicare una pressione bassa (cioè, 5 psi) all'estremità di iniezione del capillare durante questo processo per assicurarsi che non ci siano bolle nel capillare.
      Nota: Il capillare è collegato a T tramite una tubazione di manica e un raccordo. Regolare la posizione dell'estremità acidato del capillare l'emettitore con l'aiuto della telecamera entro 500 µm. La distanza può essere approssimativamente stimata confrontando con il o.d. 1 mm dell'emettitore.
    6. Interrompere la bassa pressione all'estremità di iniezione del capillare. Sciacquare l'emettitore un po ' con il buffer di guaina. Ancora una volta, applicare 2-2.2 kV di tensione dello spruzzo per testare lo spray.
  3. Messa a punto di un metodo CZE per iniezione del campione, separazione, vampate di calore capillare e attivazione dello spettrometro per acquisizione dati
    1. Selezionare nuovo metodo sotto il menu a discesa File sullo schermo principale strumento per avviare un nuovo metodo.
    2. Seleziona ingresso come SV/EV, vassoio come campione, pressione di 5 psi, KV 0 e durata come 95 s per un'iniezione di campione.
      Nota: Il campione viene iniettato il capillare tramite l'applicazione di pressione. Il volume di iniezione del campione può essere calcolato in base il tempo di pressione e iniezione usando la legge di Poiseuille. Ad esempio, 5 psi per un'iniezione di campione 95-s corrisponde a circa 500 nL del volume di caricamento del campione per una separazione lunga 1 m capillare (i.d. 50 µm).
    3. Selezionare i parametri per la separazione di CZE e impostare i parametri per l'acquisizione dei dati di attivazione.
      1. Impostare ingresso come InV, vassoio come Buffer, pressione 0 psi, KV come 30 e la durata come 4.200 s per la separazione del campione di miscela standard della proteina. Impostare ingresso come InV, vassoio come Buffer, pressione 0 psi, KV come 20 e la durata come 6.600 s per la separazione del campione del proteoma di e. coli .
        Nota: La tensione applicata per la separazione può essere regolata in base sulla complessità del campione. Per campioni della proteina semplice, 30 kV può essere applicato per accelerare l'analisi. Per campioni complessi, 20 kV viene applicato per rallentare la separazione e acquisire ulteriori spettri MS/MS per proteoform ID.
      2. Impostare i parametri per innescare l'acquisizione di dati sotto Eventi temporizzati. Impostare il tempo (s) come 0,0 e tipo come relè 1 per Activate nel passaggio 1; Impostare il tempo (s) come 1.0 e tipo come relè 1 per Deactivate nel passaggio 2.
    4. Seleziona ingresso come InV, vassoio come Buffer, pressione 10 PSI, KV come 30 e la durata come 600 s per vampate di calore capillare.
    5. Salvare i file di metodo per il CZE-MS e MS/MS esperimenti.
  4. Set-up della MS e MS/MS
    1. Impostare i parametri MS e MS/MS per l'analisi della proteina intatta utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole-ion trap (Vedi Tabella materiali).
      Nota: La modalità ioni positivi e maggiore energia collisionale dissociazione (HCD) per frammentazione sono impiegati.
      1. Regolare le impostazioni del file di sintonia: attivare la modalità di proteine intatte e utilizzare una pressione di intrappolamento di 0.2. Impostare il trasferimento di ioni temperatura capillare a 320 ° C e il livello di RF s-obiettivo a 55.
      2. Generare il file metodo MS e MS/MS.
        1. Per MS completa, è possibile impostare il numero di microscans a 3, la risoluzione a 240.000 (a m/z 200), il valore di destinazione del controllo (AGC) di guadagno automatico 1E6, il tempo di iniezione non superiore a 50 ms e l'intervallo di scansione a 600-2000 m/z.
      3. Per MS/MS, è possibile utilizzare acquisizione dati-dipendente (DDA) per gli otto ioni più intensi in un completo spettro di MS. Impostare la finestra di isolamento a 4 m/z e l'energia collisionale normalizzato (NCE) al 20%. Impostare il numero di microscans a 1, la risoluzione a 120.000 (a m/z 200), il valore di destinazione AGC a 1E5 e il tempo di iniezione non superiore a 200 ms.
      4. Impostare la soglia di intensità per l'innesco di frammentazione di 1E5 e gli ioni con uno stato di carica superiore a 5 per essere isolato per frammentazione. Accendere l' escludere isotopi e impostare l'esclusione dinamico a 30 s.
        Nota: Il numero di microscans per MS/MS può essere aumentato a 3. In questo caso, un metodo Top3 DDA può essere utilizzato al fine di ridurre il tempo di ciclo.
    2. Impostare una connessione via cavo tra l'autocampionatore CE e lo spettrometro di massa per l'attivazione automatica dell'acquisizione dati. Collegare un'estremità di un filo A contatto di relè 1 e relè 1 contatto B sul retro dell'autocampionatore CE. Collegare l'altra estremità del filo di inizio - e iniziare a + sul lato lo spettrometro di massa.
  5. CZE-MS/MS esperimento e l'analisi dei campioni
    1. Applicare 30 kV utilizzando il controllo manuale CE all'estremità di iniezione del campione e 2-2.2 kV presso il flaconcino di tampone guaina usando l'alimentatore esterno per testare la separazione capillare ed electrospray.
      Nota: La separazione di corrente, in questo caso, è di circa 8-9 µA se 5% (v/v) di acido acetico è usato come il BGE.
    2. Impostare una sequenza di acquisizione di dati sul computer uno spettrometro di massa selezionando una nuova sequenza.
      1. Selezionare sconosciuto come il tipo di campione e specificare un nome file e percorso. Indicare il metodo di MS per essere utilizzato per ogni campione eseguito con Strumento metodo.
        Nota: Poiché non vi è un computer separato per il controllo l'autocampionatore CE, la posizione del campione non deve necessariamente essere specificato qui.
    3. Impostare una sequenza di separazione di CZE sul computer CE per indicare la posizione del buffer, posizione del campione e il metodo CZE. Per avviare una nuova sequenza, selezionate sequenza sotto il menu a discesa di analisi nella pagina principale strumento.
    4. Prima di avviare il metodo di acquisizione dei dati del computer di spettrometro di massa selezionando Esegui sequenza (o eseguire esempio per corse singole). Quindi, avviare la sequenza di CE sul computer autocampionatore CE.
      Nota: Quando la tensione di separazione è il dopo l'iniezione del campione, viene inviato un segnale dall'autocampionatore CE per lo spettrometro di massa per innescare l'acquisizione dei dati. La separazione corrente diminuirà all'inizio durante la separazione dovuto l'accatastamento dinamico pH giunzione campione. Quindi, la corrente recupera gradualmente.

5. database ricerca dei file Raw raccolti con il Software TopPIC

  1. Trasferire i file RAW, inclusi i dati di MS e MS/MS, dal computer spettrometro di massa a un computer dedicato alla ricerca di database.
    Nota: Questi file RAW possono essere grande e richiede un computer potente per raggiungere una ricerca veloce database.
  2. Scarica ProteoWizard e TopPIC suite sul computer dedicato alla ricerca di database.
    Nota: ProteoWizard e TopPIC suite sono software open-source e si possono trovare online (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC suite: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). Database UniProt sono utilizzati per ricerche nelle banche dati e possono essere trovati sul sito Web di UniProt.
  3. Convertire i file RAW in file .mzML con msconvert, uno strumento di conversione del formato di file MS in ProteoWizard28. Nella GUI di msconvert (MSConvertGUI.exe), fare clic sul pulsante Sfoglia e selezionare il file RAW da convertire. Selezionare Simone come formato di output e mantenere tutte le altre opzioni sui valori predefiniti. Fare clic sul pulsante Start in basso a destra della GUI.
  4. Convertire i file .mzML file .msalign con lo strumento TopFD in TopPIC suite29.
    1. Nella GUI di TopFD (topfd_gui.exe), fare clic sul pulsante File e selezionare il file .mzML creato nel passaggio precedente. Mantenere i valori predefiniti dei parametri e, quindi, fare clic sul pulsante Start in basso a destra della GUI.
      Nota: TopFD converte cluster isotopico precursore e frammento di monoisotopic masse e identifica le funzioni possibili proteoform in MS1 dati combinando i cluster isotopico di precursore con simili monoisotopic masse e tempi di migrazione stretta. Tre file verranno generati da TopFD, tra cui un file di ms1.msalign, un file di ms2.msalign e un file con estensione feature. I file ms1.msalign e ms2.msalign contengono riconducibili monoisotopic masse degli spettri MS1 e MS/MS, rispettivamente. Il file con estensione feature contiene caratteristiche possibili proteoform.
  5. Eseguire una ricerca nel database con TopPIC (versione 1.1.3) in TopPIC suite30.
    1. Nella GUI di TopPIC (toppic_gui.exe), fare clic sul file di Database e selezionare un database appropriato per la ricerca.
    2. Fare clic su file di spettro e selezionare il file di ms2.msalign generato nel passaggio 5.4.1 come input. Selezionare il file di funzionalità MS1 e scegliere il file. feature generato al punto 5.4.1.
    3. Impostare carbamidomethylation di cisteina (C57) come una modificazione fissa a causa del trattamento di IAA.
      Nota: Un file di testo possa essere creato anche con varie modifiche fisse da un editor di testo. Quindi, il file di testo è selezionabile utilizzando il pulsante File accanto a modifiche fisse nella GUI TopPIC.
    4. Selezionare la funzionalità di database di Decoy e, sotto impostazioni di taglio, selezionare FDR (tasso di falsi scoperta) nel menu a discesa accanto a livello di spettro. Impostate il FDR a 0.01 a livello di spettro e 0,05 a livello proteoform.
      Nota: TopPIC fornisce più opzioni per filtrare i risultati: spettro-livello FDR, proteoform-livello FDR o entrambi. Il FDR vengono valutati in base al target-esca approccio31.
    5. Uscire dalla funzione di generazione non è selezionata e impostare la tolleranza di errore (ppm) a 15.
    6. In Avanzate dei parametri, è possibile selezionare 2 per il numero massimo di turni di massa nel menu a discesa. Impostare la massa massima shift (Da) delle modifiche sconosciute a 500 procuratore. tutti gli altri parametri di lasciare i valori predefiniti e fare clic sul pulsante Start nella parte inferiore destra della GUI.
      Nota: Il software di TopPIC genera due file di testo risultanti. Il file con il suffisso. OUTPUT_TABLE contiene l'elenco di corrispondenze individuate proteoform-spettro (PrSMs) e quella con un suffisso. FORM_OUTPUT_TABLE contiene l'elenco di proteoforms identificato. Per ogni PrSM, il software fornisce informazioni generali sulla partita, il modello di frammentazione osservati, gli ioni frammento abbinati e spostamenti di massa.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1 Mostra un diagramma del sistema dinamico di basati su pH-giunzione CZE-ESI-MS utilizzato nell'esperimento. Una lunga spina del campione in un buffer di base viene iniettata in una separazione rivestite con LPA capillare riempita con un acido BGE. Dopo l'applicazione di alte tensioni I e II, gli analiti nella zona di esempio sarà concentrato tramite il metodo di giunzione pH dinamico. Per valutare le prestazioni del sistema CZE-MS, una mis...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui forniamo un protocollo dettagliato per utilizzare CZE-MS/MS per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e per l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma. Nella Figura 1è riportato un diagramma del sistema CZE-ESI-MS/MS. Ci sono quattro passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la preparazione del rivestimento di LPA di alta qualità sulla parete interna della separazione capillare è estremamen...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il gruppo di Heedeok Hong presso il dipartimento di chimica, Michigan State University, per gentilmente fornire le cellule di Escherichia coli per gli esperimenti. Gli autori ringraziano il sostegno del National Institute of General Medical Sciences, il National Institutes of Health (NIH) attraverso Grant R01GM118470 (per X. Liu) e Grant R01GM125991 (al L. sole e X. Liu).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
capillare in silice fusaPolymicro Technologies106815001750 µ m i.d. 360 µ M o.d.
Pellet di idrossido di sodioMacron Fine Chemicals7708-10Acqua corrosiva
di grado LC-MSFisher ScientificW6-1
Acido cloridricoFisher ScientificSA48-1Metanolo corrosivo
Fisher ScientificA456-4Tossico, pericolo per la salute
3-(Trimetossisilil)metacrilato di propileSigma-AldrichM6514sensibile all'umidità e al calore
Acros Organics423805000
AcrilammideAcros Organics164855000Tossico, pericolo per la salute
Persolfato di ammonioSigma-AldrichA3678Pericolo per la salute, lisozima ossidante
Sigma-AldrichL6876
citocromo CSigma-AldrichC7752
MioglobinaSigma-AldrichM1882
ß-caseinaSgma-AldrichC6905
Anidrasi carbonicaSigma-AldrichC3934
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DitiotreitoloSigma-AldrichD0632Pericolo per la salute
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Pericolo per la salute
Acido formicoFisher ScientificA117-50Corrosivo, Pericolo per la salute
Colonna trappola C4Sepax Technologies110043-4001C3 &; m particelle, 300 & Aring; pori, 4,0 mm d.i. 10 mm di lunghezza
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Tossico, ossidante Bicarbonato
di ammonioSigma-Aldrich1066-33-7
Filtri a flusso rapido NalgeneThermo Scientific126-00200,2 &; m CN e
E. coliK-12 MG1655
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSaggio BCA Sigma-AldrichD8537
Thermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
Sistema HPLC per la desalinizzazione delle proteineAgilient1260 Infinity II
Acido aceticoFisher ScientificA38-212
CE autocampionatoreCMP ScientificECE-001
Interfaccia di flusso della guaina pompata elettrocineticamenteCMP Scientific
Q Spettrometro di massa ibrido HF Exactive Quadrupolo-OrbitrapThermo Fisher Scientific
Estrattore per micropipette Sutter fiammato/marroneSutter InstrumentsP-1000
Disgregatore cellulare ad ultrasuoni per lisi cellulareBranson101063196Modello S-250A
Concentratore di vuotoThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115
Acido fluoridrico altamente tossico cellule di di 50 mm di diametro

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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