Utilizzo di sistemi robotici per elaborare e incorporare colici murini campioni per le analisi istologiche

Summary

Mancanza di standardizzazione per la processazione dei tessuti murini riduce la qualità delle analisi istopatologica murino rispetto agli esemplari umani. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'esame istopatologico di murini tessuti infiammati e uninflamed colici a dimostrare la fattibilità di sistemi robotici abitualmente utilizzati per l'elaborazione e l'incorporamento di campioni umani.

Abstract

La comprensione delle malattie umane è stata notevolmente ampliata grazie allo studio di modelli animali. Tuttavia, la valutazione istopatologica di modelli sperimentali deve essere così rigorosa come quella applicata per i campioni umani. Infatti, trarre conclusioni affidabili e accurate criticamente è influenzato dalla qualità della preparazione della sezione di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per l'analisi istopatologica dei tessuti murini che implementa diversi passaggi automatizzati durante la procedura, dalla preparazione iniziale per l'inclusione in paraffina dei campioni murini. La riduzione delle variabili metodologiche attraverso la standardizzazione del protocollo rigoroso da procedure automatizzate contribuisce alla maggiore affidabilità delle analisi patologica murino. In particolare, questo protocollo viene descritto l'utilizzo di trattamento automatizzato e l'incorporamento di sistemi robotici, abitualmente utilizzati per la lavorazione di tessuti e inclusione in paraffina di campioni umani, per elaborare murini esemplari di infiammazione intestinale. Concludiamo che l'affidabilità dell'esame istopatologico dei tessuti murini è aumentato significativamente dopo l'introduzione di tecniche standardizzate e automatizzate.

Introduction

Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati diversi modelli sperimentali per sezionare i meccanismi patogenetici che portano a malattie umane^1,2. Al fine di valutare la gravità di una malattia, i ricercatori devono valutare l'effetto di un trattamento e studiare le variazioni architettoniche citologiche ed istologiche o la quantità di infiammazione³. Per eseguire su tali modelli sperimentali, dettagliate analisi istopatologiche sono necessari, spesso confrontando campioni murine ed umane^4,5.

Inoltre, campioni umani sono comunemente trattati e segnati da strutture di core di istopatologia e patologi esperti umani attraverso standardizzato criteri istopatologici e metodi. Al contrario, tessuti murini sono solitamente fisso, incorporate e analizzati dai ricercatori con esperienza limitata dei protocolli istopatologici. La qualità e l'affidabilità dell'esame istopatologico inizia con la preparazione di sezioni di tessuto di alta qualità. Diversi fattori contribuiscono criticamente per aumentare o diminuire la qualità dell'analisi finale, tra cui la fissazione, macroscopica di sezionamento, la lavorazione, paraffina embedding ed embedding dei campioni^6,7.

Tutti questi passaggi che coinvolgono la manipolazione del campione sono soggetti a errori manuali, tra cui l'incorporamento manuale dei campioni e, in misura minore, microtomo manuale di taglio e colorazione. Allo stato attuale, l'intero processo di preparazione di tessuti murini per valutazione istologica si basa su protocolli che variano da laboratorio a laboratorio e i protocolli manuali. L'obiettivo di questo studio è quello di implementare protocolli standardizzati automatizzati per ridurre gli errori e variabilità nell'esame istopatologico murino.

A nostra conoscenza, descriviamo qui i primi protocolli per tessuto completamente automatizzato di elaborazione e incorporamento per la valutazione istologica dei tessuti murini; Questi sono abitualmente utilizzati nelle unità di patologia per le analisi di campioni umani. Come esempio pratico della fattibilità del metodo, è stato analizzato un modello murino di infiammazione intestinale, cioè, il modello di colite cronica causata da somministrazione ripetuta di Destrano solfato di sodio (DSS) in acqua potabile^{8 ,9}. Questa impostazione sperimentale strettamente assomiglia umano infiammatorie intestinali (IBD) malattie¹⁰ poiché animali DSS-trattati mostrano segni di infiammazione intestinale, per esempio, perdita di peso, feci o diarrea e accorciamento del colon, nonché di fibrosi ^8,9,11. Come osservato per i pazienti IBD umani, DSS trattamento genera un decorso della malattia complessa. In questo contesto, elaborare valutazioni istologiche sono tenuti a comprendere la profonda alterazione dell'architettura del tessuto. Così, l'implementazione di protocolli descritti per aumentare la qualità di preparazione del campione per la vostra comodità ricercatori basandosi sull'interpretazione di istologici e immunohistochemical analizza per impostazioni sperimentali murine. Modelli sperimentali murini di malattie umane che coinvolge alterazioni dell'architettura del tessuto, la presenza di tessuto cellulare si infiltra in o infiammazione in diversi tessuti e organi (cervello, fegato, intestino, pelle) potrebbe utilizzare l'incremento della qualità della preparazione del campione per esame istopatologico.

Protocol

Procedure di animali sono state approvate dal Ministero della salute (auth. 127/15 27/13) e seguivano le indicazioni di cura degli animali dell'Istituto europeo di oncologia IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care)

1. cronica colite induzione dall'amministrazione ripetitive DSS

1. Topi in 2 gruppi (trattamento DSS vs controllo H₂O, almeno 5 littermates topi per ogni gruppo sperimentale) abbinati per età separata e sesso.
2. Amministrare il 2,5% DSS (40 kDa) nell'acqua potabile per 7 giorni per il gruppo di trattamento e acqua al gruppo di controllo.
   Nota: Questo modello induce un transmurale cronica infiammazione intestinale⁹.
3. Dopo 7 giorni, interrompere il trattamento di DSS e dare acqua a entrambi i gruppi per 14 giorni. Ripetere questa operazione 3 volte.
   Nota: L'amministrazione ripetitive di DSS induce alterazioni della mucosa colica molto somiglianti IBD umana, cioè, fibrosi⁹.
4. Sacrificare topi secondo le procedure autorizzate da IACUC istituzionali, cioè, per inalazione di CO₂ .
5. Aprire l'addome del mouse e il peritoneo con un bisturi.
   Nota: Sterilità è consigliato ma non strettamente necessario.
6. Separare i due punti dal piccolo intestino con pinze e pinzette. Asportare il colon con pinze e pinzette.
   Nota: Misurazione della lunghezza del colon (Figura 1A) è un metodo per determinare se si è verificato colite in topi DSS-trattati.
7. Risciacquare il colon in una capsula di Petri con 10 mL di 1x freddo di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e premere delicatamente per rimuovere il materiale fecale.

2. murino tessuti fissazione

1. Immergere ogni esemplare del colon murini in 10 mL di 10% neutra tamponata formalina (NBF) a TA (temperatura ambiente).
   Nota: Sterilità è consigliato ma non strettamente necessario.
2. Difficoltà il tessuto per 18 – 24 h a TA.

3. due punti di sezionamento e preparazione tessuto

1. Rimuovere tessuti fissi dal Contenitore NBF con pinzette piccole e metterli in una capsula di Petri. Mettere i due punti su una piastra di lavoro taglio con piccole pinzette.
2. Tagliare i due punti in frammenti (0,2 cm a 0,3 cm di lunghezza) con un bisturi sterile. Questa lunghezza del frammento è ottima per non superare lo spessore della cassetta.
3. Pick up segmento di uno e due punti con piccole pinzette (Figura 2A). Inserire il segmento di uno e due punti in uno della plastica sporgenti punte della paraffina orientata l'incorporamento di cassette con piccole pinzette (Figura 2B).
4. Ripetere l'operazione (3.2-3.3) con un ulteriori segmenti del colon 3 per cassetta. Evitare di inserire i segmenti adiacenti punte sporgenti, per minimizzare la sovrapposizione dei tessuti
5. Richiudere la cassetta premendo con cura i quattro bordi (Figura 2). Evitare la spremitura del tessuto per evitare danni ai tessuti.
6. Inserire la griglia in una struttura di sostegno in plastica. Etichettare il telaio di supporto per identificare il campione. Ripetere per ogni campione biologico.

4. tessuto lavorazione

1. Accendere il processore automatico premendo il pulsante di alimentazione (Figura 3A, 3B).
2. Riscaldare per 1 h per assicurare la fusione di cera di paraffina. Attendere che lo strumento conferma che la paraffina è completamente sciolto, osservando la presenza dell'icona dedicato (Figura 3).
3. Inserire ogni cassetta orientato (contenente gli esemplari del tessuto) manualmente il cestello metallico fornito dal processore automatizzato (Figura 3D). Posizionare le cassette verticalmente da rivestimento li vicino uno a altro per ottimizzare l'occupazione di cestino.
4. Chiudere il cestello metallico (Figura 3E).
5. Aprire il coperchio della storta (Figura 3F). La storta è il luogo dove il cestello è inserito nella macchina. Inserire il cestello nell'alloggiamento dedicato del processore (Figura 3). Chiudere il coperchio della storta (Figura 3 H).
6. Utilizzare il touch screen del computer strumento per definire il protocollo di lavoro (Figura 3I). Scegliere la sequenza delle soluzioni, tempi e temperatura da attuarsi secondo lo schema previsto nella tabella 1.
7. Assegnare il protocollo deve essere eseguito su storta contenente il Cestino facendo clic sull'icona computer dedicato (Figura 3J). Avviare il protocollo facendo clic sul Pulsante Start (Figura 3 L).
8. Attendere che lo strumento conferma la fine del protocollo, osservando la presenza dell'icona dedicata e ascoltando il tono di allarme provenienti dalla macchina.
9. Aprire il coperchio della storta. Togliete il cestello dal processore (Figura 3 M).

5. tessuto incorporamento

1. Accendere il embedder automatica premendo il pulsante di alimentazione (Figura 4A).
2. Riscaldare per 1 h per assicurare la fusione di cera di paraffina. Attendere che lo strumento conferma che la paraffina è completamente fusa osservando la temperatura del bagno di paraffina indicato dal termometro interno dello strumento.
3. Trasferire manualmente tutte le cassette trasformate dal cestino del processore al rack embedder. Ogni rack può contenere fino a 32 cassette. (Figura 4B, 4C).
4. Aprire il coperchio principale embedder (Figura 4, 4D, 4E).
5. Utilizzare il touch screen del computer strumento per segnalare per la robotica sistema che un rack viene inserita (Figura 4F).
6. Aprire il coperchio dell'alloggiamento di aspirazione (Figura 4). Inserire il ripiano nel corpo della presa. Ogni embedder può contenere contemporaneamente fino a 4 rack (Figura 4 H, 4I). Chiudere il coperchio dell'alloggiamento di aspirazione (Figura 4J).
7. Utilizzare il touch screen del computer strumento per avviare la procedura di incasso, secondo la tabella 2 (Figura 4 K).
   Nota: Ciascun rack di 32 cassette dura circa 45 minuti per essere incorporato.
8. Attendere che lo strumento conferma la fine del protocollo, osservando la presenza dell'icona dedicato (Figura 4 L).
9. Rimuovere la griglia di presa (Figura 4 M). Chiudere il coperchio principale embedder.
10. Rimuovere i blocchi incorporati (che contiene le griglie di orientamento) dal rack. Trasferire i blocchi incorporati in una scatola di cartone di stoccaggio.

6. micrometro di sezionamento

1. Accendere la piastra di raffreddamento del microtomo. Impostare la temperatura tra -8 e -10 ° C.
2. Accendere il bagno termostatico acqua del microtomo, contenente 2 L di acqua distillata. Impostare la temperatura del bagno d'acqua tra 42 – 45 ° C.
3. Posto la paraffina incorporati blocchi sulla piastra di raffreddamento. Attendere almeno 5 minuti per consentire i blocchi raffreddare.
4. Prendere un isolato dalla piastra di raffreddamento e inserirlo nel supporto per blocco microtomo.
5. Impostare il microtomo spessore a 10 µm. Trim il blocco di taglio tagliando 6 volte a 10 µm di spessore.
6. Modificare l'impostazione di spessore del microtomo da 10 µm a 3 µm. taglio uno a 3 µm sezione per colorazione ematossilina ed eosina (H & E).
7. Raccogliere la sezione 3 µm con una piccola spazzola. Mettere la sezione 3 µm nel bagno d'acqua, si posa con cura sulla superficie dell'acqua per ridurre le rughe del tessuto. Raccogliere la sezione di tessuto dal bagnomaria termostatato su una lastra di vetro singolo.
   1. Se necessario, tagliare sezioni aggiuntive.
8. Etichettare il vetrino scrivendo l'identificazione dei campioni.
9. Mettere i vetrini in un forno a 37 ° C per almeno 10 min.
10. Mettere vetrini in rack per analisi immediate o in scatole di immagazzinaggio.

7. ematossilina ed eosina (H & E)

1. Accendere il coloratore automatico premendo il pulsante di alimentazione. Consentire l'inizializzazione del braccio robotico, osservando il cambiamento della barra di caricamento sul monitor dello strumento.
2. Inserire i vetrini nel rack stainer, inserire verticalmente fino a 30 diapositive.
3. Etichettare il rack con l'etichetta di plastica identification (RFID) appropriata frequenza radio. Tagging RFID è un sistema che identifica il protocollo di colorazione corretto caricato nel computer stainer.
4. Inserire il rack il coloratore automatico. Consentire al computer caricare automaticamente e avviare il protocollo di colorazione secondo il riconoscimento del tag RFID.
   Nota: Il protocollo per la macchiatura di H & E è descritto in tabella 3.

8. la macchiatura di Immunohistochemical

1. Eseguire immunohistochemical e Mallory tricromica colorazione come descritto in precedenza⁷.

Results

Colite cronica sperimentale indotta dalla somministrazione ripetuta di DSS nell'acqua potabile è un modello murino di infiammazione intestinale molto somiglianti umano IBD^8,9. Figura 1 descrive gli effetti del trattamento di DSS, tra cui colon accorciamento (Figura 1A), un parametro ampiamente usato per segnare la presenza di infiammazione indotta da DSS e colica espressi...

Discussion

Utilizziamo diversi passaggi automatizzati durante la preparazione dei tessuti murini per analisi istopatologica. Questo protocollo mira a fornire suggerimenti tecnici per incrementare la riproducibilità e la standardizzazione di tutto il processo, migliorando così la qualità complessiva della valutazione istopatologica finale. Abbiamo implementato strumenti automatizzati e metodi per la preparazione e l'incorporamento dei tessuti, abitualmente utilizzati in strutture di nucleo di patologia per lo studio di campioni uman...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente Absolute Ethanol anidro	Carlo Erba	414605	Reagente
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L
Reagente Alluminio Solfato di Potassio	SIGMA	A6435
Reagente Anilina Blue	SIGMA	415049
carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	reagente
CD11b (clone M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	anticorpo
CD20 IHC (clone SA275A11)	Biolegend	150403	anticorpo
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	anticorpo
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	anticorpo
CD45.2 (clone 104)	BioLegend	109837	anticorpo
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	anticorpo
Citrato Tampone pH 6 10x	Reagente	SIGMA	C9999
Dab	Vector Laboratories	Reagente SK-4100
DPBS 1x	Reagente	Microgem	L0615-500
DSS	TdB Consultancy	Reagente DB001	Reagente
EDTA	SIGMA	E9884
EnVision Flex Reagente bloccante la perossidasi	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	reagente
F4/80 (clone BM8)	BioLegend	123108	anticorpo
Formalina	PanReac	2.529.311.215	reagente
acetico glaciale	SIGMA	71251	reagente
Capra-anti-ratto-HRP	Agilent DAKO	P0448	anticorpo
ematossilina	DIAPATH	C0303	reagente
LEICA Microtomo rotante (RM2255)	Leica	RM2255	apparecchiatura
Ly6g (clone 1A8)	BD Biosciences	551459	anticorpo
Ossido di mercurio II	Reagente 203793 SIGMA
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACREAGENTE legale
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	reagente
Orange G	SIGMA	O3756
Paraffina	Reagente	Sakura	7052
Attrezzatura Peloris	LEICA
Reagente Percoll	SIGMA	P4937
RPMI 1640 senza L-Glutammina	Microgem	Reagente L0501-500
STS020	Attrezzatura	Leica
Cassetta sezionabile Paraform Tissue-Teck	Attrezzatura
Tissue-Tek Embedder automatizzato di paraffina	Sakura		apparecchiature
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	reagente