Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.
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Articolo metodologico
Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono
In questo articolo
Sommario
Abstract
Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.
Introduzione
i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccan....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.
1. valutazione della fase del ciclo estrale
- Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10.
- Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.
- Introdurre la punta della pipetta di plastica nella vagina.
- Sciacquare delicatamente il liquido 4 – 5 volte per raccogliere il campione.
- Posizionare il filo finale c....
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Risultati
I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, present.......
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Discussione
MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una t.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l'assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 settimane |
| Acqua ultrapura | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Pipetta in plastica sterile | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacità: 1,7 mL |
| Vetrini per microscopio smerigliato | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Microscopio ottico | Microscope World | MW3-H5 | 10x e 20x obiettivo |
| Ketathesia- Ketamina HCl Iniezione USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Farmaco controllato. |
| Xilazina Soluzione Sterile | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Farmaco controllato. |
| Etanolo | Fisher Scientific | BP2818100 | Diluire al 70% di etanolo con acqua. |
| Ago calibro 21 G | BD Biosciences | 305165 | |
| Siringa | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Forbici operative | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, affilato/smussato, curvo e 9 cm, dritto, fine |
| pinzetta | Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Frantumatori tissutali Bessman | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacità: da 10 a 50 mg |
| Provette per microfughe prive di RNasi | Thermo Fisher Scientific AM12400 | 1,5 mL | |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| RNA Direct-zol MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Kit miScript II RT | Qiagen | 218161 | |
| Risposta infiammatoria del topo & Autoimmunità miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Provette PCR a parete sottile, prive di DNasi, senza RNasi | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | per 20 μ Reazioni L |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Termociclatore o blocco di raffreddamento/riscaldamento | Fornitore generale da laboratorio Microcentrifuga | ||
| Fornitore generale da laboratorio Cycler | |||
| in tempo reale Fornitore | generale da laboratorio Pipettatore | ||
| multicanale | Fornitore generale da laboratorio Tampone | ||
| di lavaggio RNA | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| tampone di digestione DNA | Zymo Research | E1010-1-4 | mL |
| RNA tampone di prelavaggio | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Analizzatore di ozono ultravioletto | Teledyne API | Modello T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Regolatori di flusso di massa | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical....
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Ristampe e permessi
