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Articolo metodologico

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

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⸱

DOI:

10.3791/58664

⸱

7 gennaio 2019

 , 
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

Abstract

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

Introduzione

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D'altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.

Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell'omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall'inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l'esposizione dell'ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.

Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all'ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all'identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un'enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l'analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l'espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.

1. valutazione della fase del ciclo estrale

  1. Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10.
  2. Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.
  3. Introdurre la punta della pipetta di plastica nella vagina.
  4. Sciacquare delicatamente il liquido 4 – 5 volte per raccogliere il campione.
  5. Posizionare il filo finale contenente fluido vaginale su un vetrino.
  6. Osservare il rossore vaginale non colorato sotto un microscopio chiaro con un obiettivo 20x.
    Nota: Animali che non presentano cicli regolari a causa di pseudogravidanza o altre cause devono essere escluse dall'esperimento. Si consiglia di eseguire le secrezioni vaginali quotidiane per almeno tre cicli consecutivi confermare la ciclicità.

2. esposizione all'ozono

  1. Inserire un massimo di 4 topi in due contenitori di vetro di 1,2 L con coperchi di maglia di filo e acqua ad libitum.
  2. Mettere un contenitore di vetro nel suo alloggiamento di ozono e l'altro nella camera di esposizione di aria filtrata.
  3. Regolare la concentrazione di ozono ai livelli di ozono 2 ppm e monitor regolarmente.
    Nota: L'apparato di ozono fornisce un flusso d'aria regolato (> 30 aria modifiche/h) con controllo temperatura (25 ° C) e umidità relativa (50%). Il sistema genera ozono di un ozonizzatore di scarica elettrica, che è monitorato e controllato da un analizzatore di ozono ultravioletta e controllori di flusso di massa, come descritto in precedenza11.
  4. Rimuovere i contenitori di vetro dopo 3 h di esposizione di aria ozono/filtrata. Restituire gli animali per gabbia con biancheria, cibo e acqua ad libitum.

3. polmone raccolta

  1. 4 h dopo l'esposizione, anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di un chetamina/xilazina cocktail (90 mg/kg ketamina, xilazina 10 mg/kg).
    Nota: Per confermare un adeguato livello di anestesia, controllare il mouse per un pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare l'anestetico, se necessario.
  2. Inumidire la pelle del topo con etanolo al 70%.
  3. Fare un'incisione del midline di 2 cm utilizzando un funzionamento forbici e pinzette chirurgiche per esporre la vena cava.
  4. Sacrificio di topi di transection della vena cava e l'aorta. Se necessario, inserire un ago di calibro 21 G nella vena cava sopra le vene renali per raccogliere il sangue prima del dissanguamento. In alternativa, raccogliere il sangue tramite la puntura di cuore seguendo protocolli standard.
  5. Utilizzare una forbice chirurgica per tagliare aperto la cavità addominale e rimuovere pelle/superiore muscolo, lo spostamento verso l'alto verso le costole.
  6. Utilizzare una forbice chirurgica per perforare il diaframma.
    Nota: Polmoni crollerà dal diaframma.
  7. Tagliare via la gabbia toracica utilizzando una forbice chirurgica per esporre il cuore ed i polmoni.
  8. Usando il forcipe, prendere una RNAsi-libera microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo in azoto liquido per riempire il tubo.
    Nota: Usare occhiali e guanti protettivi per gestire azoto liquido.
  9. Rimuovere i polmoni, inserirli nella RNAsi-libera 1,5 mL microcentrifuga riempito con azoto liquido per snap-congelare il tessuto e attendere alcuni secondi fino a quando il liquido evapora.
  10. Chiudere il coperchio del tubo e conservare il tessuto a-80 ° C fino all'utilizzo.

4. RNA preparazione

  1. Polverizzare tutto polmoni utilizzando un polverizzatore di tessuto in acciaio inox.
    Nota: Il polverizzatore di tessuto deve essere disposto in azoto liquido prima dell'uso. Dopo ogni utilizzo con soluzione di RNasi, pulire il polverizzatore.
  2. Dividere i polmoni polverizzati e inserire due provette da 1,5 mL (metà del polmone).
  3. Aggiungere 500 µ l di tiocianato di guanidinium per provetta e mescolare.  Omogeneizzare ogni campione utilizzando 18g, 21g e aghi 23 G, rispettivamente.
    Nota: I campioni possono essere addizionati con 5.6 x 108 copie di un piccolo RNA spike-in control (da una specie diversa) prima di procedere con l'estrazione.
  4. Aggiungere 500 µ l di etanolo per ogni campione e vortex per 15 s.
  5. Carico la miscela in una colonna di spin in una provetta e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.
  6. Per dnasi I trattamento (in colonna);
    1. Aggiungere 400 µ l di RNA Wash Buffer e centrifugare a 12.000 x g per 1 min.
    2. In un tubo di RNAsi-libera, aggiungere 5 µ l di dnasi I e 75 µ l di digestione del DNA: 1x buffer e mescolare. Aggiungere il mix direttamente alla matrice colonna.
    3. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  7. Aggiungere 400 µ l di soluzione di prelavaggio RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo e ripetere questo passaggio.
  8. Aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio di RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.
  9. Centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti rimuovere il tampone rimanenti. Trasferire la colonna in una provetta di RNAsi-libera.
  10. Per eluire il RNA, aggiungere 35 µ l di acqua privo di DNasi e RNasi direttamente alla matrice colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1,5 min.
  11. Misurare la concentrazione di RNA totale (260 nm) e purezza utilizzando uno spettrofotometro. Seguire le istruzioni per eseguire la quantificazione di RNA in un campione di 1,5 µ l aliquota. Spegnete lo strumento con acqua privo di DNasi e RNasi utilizzato per eluizione.
    Nota: Un rapporto di 260/280 di ~2.0 è generalmente accettato come "puro" per il RNA. Concentrazione di RNA tipica varia solitamente tra 750 e 2.500 ng / µ l.
  12. Conservare a-80 ° C.

5. miRNA Profiling

  1. Retrò-trascrivere piccoli RNA, uso 200 ng di RNA totale.
    1. Preparare la miscela di reazione d'inversione-trascrizione su ghiaccio (volume totale per reazione è di 20 µ l). Per ogni reazione, aggiungere 4 µ l di tampone, 2 µ l di 10 x mescolano nucleotidi, 2 µ l di trascrittasi inversa e 2 µ l di acqua RNAsi-libera: 5x. Mescolare tutti i componenti e aliquota in 600 µ l RNAsi-libera tubi di plastica (10 µ l di miscela per reazione).
      Nota: Il mix master di d'inversione-trascrizione contiene tutti i componenti necessari per la sintesi del cDNA del primo-filo tranne modello RNA.
      Nota: Quando si prepara il mix master, calcolare il volume in eccesso (10%).
    2. Aggiungere il modello di RNA (200 ng in 10 µ l) in ogni provetta contenente mix master d'inversione-trascrizione. Mix, centrifuga per 15 s a 1.000 x ge memorizzarli sul ghiaccio fino alla messa in termociclatore o blocco asciutto.
    3. Incubare per 60 min a 37 ° C.
    4. Incubare per 5 minuti a 95 ° C e mettere i tubi sul ghiaccio.
    5. Diluire il cDNA aggiungendo 200 µ l di acqua RNAsi-libera in ogni reazione di d'inversione-trascrizione di 20 µ l.
  2. Eseguire PCR in tempo reale utilizzando la risposta infiammatoria del Mouse e autoimmunità miRNA Array di PCR.
    1. Preparare una miscela di reazione (volume totale 1100 µ l): per ogni reazione, aggiungere 550 µ l di 2 x PCR mix master, 110 µ l di miscela primer universale: 10x, 340 µ l di acqua RNAsi-libera e µ l 340 del modello cDNA (diluito reazione dal punto 5.1.5).
    2. Aggiungere 10 µ l di miscela di reazione ad ogni pozzetto del quieto pre-caricato matrice PCR utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Sigillare il miRNA piastra PCR Array con pellicola adesiva ottico.
    4. Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente per rimuovere le bolle.
    5. Programmare il ciclatore in tempo reale, la fase di attivazione iniziale di PCR per 15 min a 95 ° C, 3-passo ciclismo contenente denaturazione per 15 s a 94 ° C, ricottura per 30 s a 55 ° C e l'estensione per 30 s a 70 ° C per 40 cicli di numero.
      Nota: Segui produttore ciclismo condizioni istruzioni per impostare il ciclatore in tempo reale. Eseguire il passaggio di curva di dissociazione incorporato nel software cycler in tempo reale.
    6. Eseguire analisi di dati.

6. analisi dei dati

  1. Estrarre valori Ct dal software real time PCR per ciascun campione in un software di analisi.
    Nota: Ct A valore di 34 è considerato come Cut-off. Se i campioni contengono spike-in controllo (ad esempio, cel-mir-39), normalizzare i valori di Ct nel Raccoglitore in controllo per ciascun campione. Potrebbero essere necessario impostare manualmente i valori di soglia. Valori basali vengono impostati automaticamente.
  2. Normalizzare i valori di Ct al Ct medio di sei comandi di pulizie di miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizzando la seguente equazione:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Per fold modificare calcoli, calcolare i valori di ΔΔCt utilizzando un campione specifico del controllo, utilizzando l'espressione relativa equazione12:
    espressione di miRNA relativa:
    2-essereCt, dove - ∆∆Ct =-[∆ CT test - controllo ∆ CT]
    Nota: Un cambiamento di piega di 200 è considerato come Cut-off.
  4. Esportare piega modificare i valori di espressione per eseguire analisi statistiche su R utilizzando il pacchetto limma Bioconductor8.
  5. Correggere per i confronti multipli usando il metodo Benjamini-Hochberg13.
    Nota:  Una copia dello script R è disponibile presso: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Analizzati dati e DataSet sono disponibili presso il Gene Expression Omnibus sotto il numero GSE111667, anche https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. analisi dei dati: Analisi funzionale Software

  1. Organizzare il dataset. Includono i miRNA con loro rapporti di ceppo rispettive espressioni e valori di p. Vedere la tabella 1 per la formattazione del set di dati specifico.
  2. Software di analisi funzionale aperta (versione 01-10).
  3. Caricare il set di dati utilizzando il seguente formato: formato di File: "formato flessibile", contiene intestazione di colonna: "Sì", selezionare il tipo di identificatore: "miRBase (maturo)", piattaforma di matrice utilizzato per esperimenti: scegliere la piattaforma di matrice.
    Nota: Accettati sono formati di file. txt (file di testo delimitato da tabulazione), xls (file excel) e diff (file cuffdiff).
  4. Selezionare "Dedurre Observations" e verificare che il gruppo sperimentale di etichettatura sia corretto.
  5. Vai a "Sintesi di Dataset" di rivedere l'importo totale dei miRNA mappati e non mappati.
  6. Fare clic sul pulsante "nuovo" nella parte superiore sinistra del programma. Selezionare "Nuovo MicroRNA destinazione filtro" e caricare un dataset di microRNA.
    1. Impostare origine: TarBase, ingegno esperti risultati, miRecords.
    2. Impostata la fiducia: sperimentalmente osservato o alta (predetto).
    3. Selezionare "Aggiungi colonne" di includere una varietà di informazioni biologiche sulle destinazioni quali specie, malattie, tessuti, percorsi e altro ancora.
    4. Per concentrarsi su obiettivi che hanno cambiato espressione nell'esperimento, selezionare "Aggiungi / Sostituisci mRNA dataset". Utilizzare "Accoppiamento di espressione" per individuare i microRNA con i livelli di espressione di uguali o diversi.
      Nota: L'analisi di filtro fornirà microRNA nomi e simboli, mRNA bersaglio, la fonte che descrive la relazione di destinazione e il livello di confidenza del rapporto previsto (Figura 2).
  7. Fare clic su "Aggiungi a My Pathway" per inviare il dataset filtrato ad una tela di percorso ed esplorare altre relazioni biologiche.
  8. Utilizzare Progettazione percorso per creare un modello di pubblicazione-qualità degli effetti di microRNA.
  9. Un'opzione alternativa consiste nel creare un'analisi di base.
    1. Per tipo di analisi di base, selezionare "Analisi dell'espressione".
    2. Per tipo di misura, selezionare "Expr rapporto Log".
    3. Riepilogo di filtro di analisi: considera solo molecole e/o relazioni dove: (specie = mouse) AND (fiducia = sperimentalmente osservati) AND (origini dati = "Ingegno esperto risultati", "Ingegno ExpertAssist risultati", "miRecords", "TarBase", o " TargetScan umani").
    4. Selezionare un limite di valore di p = 0,05.
    5. Eseguire l'analisi.
      Nota: La relazione comprenderà: vie canoniche, analisi di regolatori a Monte, malattie e funzioni, effetti di regolatore, reti, molecole e altro ancora.

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Risultati

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, present...

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Discussione

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una t...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l'assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi C57BL/6JThe Jackson Laboratory0006648 settimane
Acqua ultrapuraThermo Fisher Scientific10813012
Pipetta in plastica sterileFisher Scientific13-711-25Capacità: 1,7 mL
Vetrini per microscopio smerigliatoThermo Fisher Scientific2951TS
Microscopio otticoMicroscope WorldMW3-H510x e 20x obiettivo
Ketathesia- Ketamina HCl Iniezione USPHenry Schein Animal Health5585390 mg/kg. Farmaco controllato.
Xilazina Soluzione SterileLloyd Laboratories139-23610 mg/kg. Farmaco controllato.
EtanoloFisher ScientificBP2818100Diluire al 70% di etanolo con acqua.
Ago calibro 21 GBD Biosciences305165
SiringaFisher Scientific3296541 mL
Forbici operativeWorld Precision Instruments501221, 50461314 cm, affilato/smussato, curvo e 9 cm, dritto, fine
pinzettaPrecision Instruments504616
Spectrum  Frantumatori tissutali BessmanFisher Scientific08-418-1Capacità: da 10 a 50 mg
Provette per microfughe prive di RNasiThermo Fisher Scientific AM124001,5 mL
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596026
RNA Direct-zol MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
Kit miScript II RTQiagen218161
Risposta infiammatoria del topo & Autoimmunità miRNA PCR ArrayQiagenMIMM-105Z
Provette PCR a parete sottile, prive di DNasi, senza RNasiThermo Fisher ScientificAM12225per 20 μ Reazioni L
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R SoftwareThe R Foundationhttps://www.r-project.org/
Termociclatore o blocco di raffreddamento/riscaldamentoFornitore generale da laboratorio Microcentrifuga
Fornitore generale da laboratorio Cycler
in tempo reale Fornitoregenerale da laboratorio Pipettatore
multicanaleFornitore generale da laboratorio Tampone
di lavaggio RNAZymo ResearchR1003-3-4848 mL
tampone di digestione DNAZymo ResearchE1010-1-4mL
RNA tampone di prelavaggioZymo ResearchR1020-2-2525 mL
Analizzatore di ozono ultraviolettoTeledyne APIModello T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Regolatori di flusso di massaSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html
Kit a punta affilata World 4

Riferimenti

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