Tecniche riproduttive per il monitoraggio e il controllo ovarico negli anfibi

Sommario

Lo studio della biologia anfibia fornisce preziose informazioni sui processi riproduttivi, fisiologici, embrionali e di sviluppo che guidano organismi di molti gruppi tassonomici. Qui, presentiamo una guida completa su diverse metodologie che possono essere utilizzate per studiare il controllo ovarico e il monitoraggio negli anfibi.

Abstract

Il controllo e il monitoraggio ovarico negli anfibi richiedono un approccio multiforme. Ci sono diverse applicazioni che possono indurre con successo comportamenti riproduttivi e l'acquisizione di gameti ed embrioni per la ricerca fisiologica o molecolare. Gli anfibi contribuiscono a un quarto a un terzo della ricerca sui vertebrati, e l'interesse in questo contesto è il loro contributo alla conoscenza dei processi riproduttivi e dello sviluppo embrionale da parte della comunità scientifica. Tuttavia, la maggior parte di questa conoscenza è derivata da un piccolo numero di specie. Negli ultimi tempi, la decimazione degli anfibi in tutto il mondo ha richiesto un intervento crescente da parte degli ambientalisti. Il recupero e la garanzia in cattività che continuano ad emergere in risposta al rischio di estinzione rendono la ricerca e le applicazioni cliniche esistenti inestimabili per la sopravvivenza e la riproduzione degli anfibi tenuti sotto la cura umana. Il successo di qualsiasi popolazione in cattività si basa sulla sua salute e riproduzione e sulla capacità di sviluppare prole vitale che portano avanti la rappresentazione genetica più diversificata della loro specie. Per i ricercatori e i veterinari, la capacità di monitorare e controllare lo sviluppo e la salute delle ovaie è quindi imperativa. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare le diverse tecniche di riproduzione assistita che possono essere utilizzate per monitorare e, se del caso o necessario, controllare la funzione ovarica negli anfibi. Idealmente, eventuali problemi riproduttivi e di salute dovrebbero essere ridotti attraverso una corretta allevamento in cattività, ma, come per qualsiasi animale, i problemi di salute e patologie riproduttive sono inevitabili. Le tecniche non invasive includono valutazioni comportamentali, ispezione visiva e misurazioni palpazioni e morfometriche per il calcolo degli indici delle condizioni del corpo e degli ultrasuoni. Le tecniche invasive includono iniezioni ormonali, campionamento del sangue e chirurgia. Il controllo ovarico può essere esercitato in diversi modi a seconda dell'applicazione richiesta e delle specie di interesse.

Introduzione

Gli anfibi sono stati a lungo riconosciuti come importanti modelli biologici e medici da una vasta gamma di discipline di ricerca. Dati ottenuti studiando particolari specie come Xenopus laevis e X. tropicalis, la rana leopardo (le due pipibates (ex Rana) el'axolotl (Ambystoma mexicanum) sono stati applicati a un certo numero di altre specie di vertebrati, compresi gli esseri umani. Le tecniche veterinarie, allevamento e riproduttive assistite che sono emerse dallo studio di questi e di altri anfibi forniscono assistenza a coloro che hanno il compito di sviluppare cure, manutenzioni e sostenibilità di successo delle popolazioni più rare in cattività ^{1 : il} nome del ^{, 2 Il} nome del sistema ^{, 3} (COM del nome ^{, 4}.

L'interesse sta guadagnando per l'uso simultaneo di approcci basati sulla conservazione in ed ex situ per invertire la marea di estinzione per molti specie di anfibi a rischio^1,2. Questo articolo fornisce le metodologie attualmente disponibili per monitorare e controllare la funzione ovarica anfibia nelle specie modello di Anurans e Caudates. Inoltre, vengono presentate le tecniche esistenti per affrontare una patologia riproduttiva comune della ritenzione delle uova.

Come in molti gruppi tassonomici, il controllo ovarico anfibio comporta una serie di interazioni strettamente sincronizzate tra l'ambiente e la fisiologia. La temperatura e il fotoperiodo (noto come segnali vicini) sono decodificati dall'occhio e dal cervello dove vengono rapidamente convertiti in processi genetici, ormonali e circadiani (segnali finali)^3,4. I metodi per monitorare e controllare la funzione ovarica trattati in questo articolo includono tecniche invasive e non invasive. I requisiti di ricerca e di insegnamento del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) definiscono le tecniche non invasive come quelle che causeranno un minimo di dolore fisico o di disagio mentale e non richiedono farmaci antidolorifici⁵. Qui, le tecniche non invasive includono ispezione visiva e palpazione, osservazioni comportamentali, valutazioni morfometriche ed ultrasuoni. Al contrario, le tecniche di raccolta del sangue, somministrazione ormonale e chirurgia (ovariectomia e rimozione delle uova trattenute) sono classificate come invasive in quanto possono provocare un certo dolore o disagio e richiedono anestesia o terapia farmacologica post-procedurale.

Le tecniche di monitoraggio ovarico non invasivo possono essere facilmente incorporate nella routine di cura quotidiana per la maggior parte degli anfibi in cattività. A seconda della specie, la gravidità ovarica può spesso essere determinata da una semplice ispezione visiva (rana di vetro). In altri casi, la palpazione può indicare se una femmina è gravida. Sono disponibili vari indici delle condizioni del corpo (BCI) come peso, lunghezza dell'urostile del muso (SUL), lunghezza snout-vent (SVL) e indice di massa standard (SMI) per prevedere la presenza o l'assenza di uova^{4,6,7, 8,9}. Tuttavia, attenzione dovrebbe essere presa con l'interpretazione dei risultati in quanto la maggior parte non considera l'età, la forma del corpo o la composizione (ad esempio, l'acqua trattenuta contro la massa ovarica o grasso)⁶. Le diagnosi riproduttive definitive possono essere ottenute tramite ultrasuoni con conoscenze più approfondite acquisite per quanto riguarda lo sviluppo delle uova e la messa in scena del ciclo ovarico^4,7. L'ecografia fornisce anche un mezzo per confermare e monitorare le patologie riproduttive e le condizioni fisiologiche associate^4,8.

Oltre a fornire informazioni riguardanti lo stato di salute, il campionamento del sangue può essere utilizzato per misurare gli ormoni riproduttivi. Se l'obiettivo dell'ormone è l'obiettivo finale, è importante evitare influenze legate allo stress che possono confondere i dati di steroidi sistemici. Mentre uno strumento di monitoraggio potenzialmente potente, C'è ancora da uno studio che dimostra risposte endocrinologiche innate alla somministrazione di ormoni esogeni in qualsiasi specie di anfibia. Il sangue può essere tranquillamente prelevato da diversi siti; nelle rane questo include la vena addominale ventrale, il plesso linguale, la vena femorale e il cuore^9,10. In Caudates, il sangue viene raccolto dalla vena ventrale della coda. Il grado di invasività, la quantità di moderazione richiesta, la necessità di anestetico, la delicatezza dell'organo da prendere di mira e la dimensione dell'animale sono fattori da considerare quando si sceglie una tecnica di raccolta per il paziente anfibio. Questo articolo presenterà la tecnica di raccolta del sangue dalla vena mascellare facciale o muscolo-cutanea delle rane come originariamente descritto da Forzan et al.⁹.

Il controllo ovarico è specifico della specie e, in quanto tale, i protocolli ormonali devono essere testati e ottimizzati. Oltre alla stagionalità e all'ambiente ormonale circolante associato, il controllo ovarico può anche essere strettamente legato all'età, al tempo trascorso in cattività e all'esposizione alla somministrazione ripetuta degli ormoni, per la quale ci sono poche informazioni nella letteratura^{11 , 12} mila ^{, 13.}L'attuazione di terapie ormonali per suscitare comportamenti riproduttivi, produzione di gameti, maturazione e oviposizione è diventata un approccio ampiamente riportato per risolvere i problemi riproduttivi comuni associati alla cattività^{4, 8,14,15,16}. Poiché i meccanismi che controllano la riproduzione nei vertebrati sono altamente conservati, ci sono una serie di ormoni, neuropeptidi e farmaci disponibili in commercio utilizzati terapeuticamente in altri gruppi tassonomici che possono anche essere utilizzati in modo affidabile in un certo numero di specie anfibie (Tabella 1). Gonadotropina rilascio di ormone (GnRH) e gonadotropina cirionica umana (hCG) (o variazioni di esso, cioè, PMSG e eCG)^17,18, singolarmente o in combinazione, sono stati ampiamente utilizzati in cattività anfibia programmi di allevamento tra cui: il boreale delle Montagne Rocciose Meridionali (Anaxyrus boreas boreas)^4,19,20; il rospo, ducido gopher rana, Rana sevosa (Langhorne et al., inedito)⁷; il cane acquatico della costa del Golfo, Necturus beyeri²⁰; Rospo del Wyoming, Anaxyrus baxteri¹⁸; rana, Rana catesbiana²¹; il rospo americano, Anaxyrus americanus²²; la rana erba, Lymnodyaster tasmaniensis²³; il Coqui, Eleutherodactylus coqui²⁴; lo Xenopus, Xenopus laevis²⁵; il rospo del Gunther, Pseduophryne guentheri²⁶; la rana leopardo settentrionale, Lithobates pipiens; l'argentino corna-rana, Ceratophrys ornato; cornuto-rana, C. cranwelli; la rana terrestre americana, Odontophrynuus americanus²⁷; e la salamandra del fuoco (Salamandra)²²⁸. Ormoni steroidei, come il progesterone (P4), sono meno comunemente segnalati, ma hanno dimostrato una buona efficacia nel suscitare ovulazione e oviposizione in alcune specie di anurani^16,18,29. I Prostaglandins (in particolare prostaglandina 2-alfa (PGF_{2 )}) sono coinvolti nell'ovulazione insieme ai corticosteroidi^30,31,32,34 e raggiungono livelli elevati durante la fase ovulatoria³¹.

Negli studi in vitro, pgF_{2 è} un potente induttore di ovulazione³¹, mentre in vivo può indurre l'oviposizione di uova trattenute in Rana muscosa^4,30,32. Estratti pituitari sono anche efficaci induttori di ovulazione^15,16,34; tuttavia, le preoccupazioni relative alla biosicurezza e al potenziale di trasmissione della malattia sono spesso un deterrente per le colonie riproduttive in cattività quando si considera questo approccio³⁵.

L'ultima sezione di questo articolo descrive in dettaglio le procedure chirurgiche e fornisce approcci alternativi per espandere gli studi ovarici o aiutare con la risoluzione di patologie riproduttive. Le ovariectomie sono più comunemente eseguite negli anfibi per ottenere gli ovociti per la ricerca embrionale. Tuttavia, può anche fornire un rimedio per le uova trattenute quando un'altra opzione fallisce. Anche se questa procedura è invasiva, che richiede anestesia completa e incisioni per esporre le masse di uova, non richiede eutanasia. Inoltre, dopo l'ovariectomia parziale, gli animali possono fare un pieno recupero e continuare ad essere riproduttivamente attivi post-chirurgia^8,36.

I protocolli descritti di seguito delineano i metodi invasivi e non invasivi di controllo e monitoraggio ovarico negli Anurans e Caudate. Le specie specifiche scelte per illustrare le tecniche in anurans includono R. mucosa e X. laevis. Necturus maculosus, N. beyeri, N. alabamensise A. mexicanum comprendono la specie utilizzata per descrivere in modo simile le tecniche in Caudates.

Protocollo

Le procedure di salamandra sono state approvate dai protocolli del Comitato per la cura e l'uso istituzionale (IACUC) dello zoo di Cincinnati e 15-138. Tutte le procedure di rana e rospo sono state approvate dai protocolli di San Diego zoo globale (SD-G), Institutional Care and Use Committee (IACUC): 15-001, 16-005 e 18-003.

La cura e il trattamento degli animali è stato approvato dal Comitato Etico del Museo Nazionale di Storia Naturale (Parigi) (Museo Nazionale d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)), in conformità con le Linee guida istituzionali e nazionali (Commissione de Génie Génétique, Direzione Départementale des Servizi Vétérinaires, Direttiva dell'Unione europea 2010/63/UE, decisione dell'accordo n. C75-05-01-2 per la Convenzione europea per gli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri. Tutti i protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati con il numero di referenza 68-037.

1. Tecniche di monitoraggio ovarico non invasivo

1. Ispezione visiva e palpazione
   1. Tenere l'Anuran femmina in uno dei tre modi descritti di seguito.
      1. Fissare la rana o le zampe di rospo con l'anello e il mignolo, sostenendo il lato dorsale (addome) del corpo della rana con l'indice e il dito medio e il lato ventrale con il pollice (Figura 1A).
      2. Tenere la rana o il rospo nella mano dominante con un pollice sull'addome e il resto delle dita che fissano la parte posteriore dell'animale. Usando la mano non dominante per palpare l'addome dell'animale, sentire se c'è irregolarità subdermica (Figura 1B).
      3. Appoggiare l'addome della rana o del rospo sul palmo della mano, le braccia anteriori drappeggiavano sopra l'indice e un pollice sulla parte superiore della schiena.
   2. Poiché Caudates è di natura completamente acquatica, eseguire l'ispezione visiva con uno dei due metodi descritti di seguito.
      1. Spostare l'animale in un contenitore separato da 4 L contenente acqua del serbatoio. Tenere il contenitore (coperchio fissato) e brillare torcia sul lato inferiore per visualizzare la presenza / assenza di uova.
      2. Anestesizza in MS222 (0,5 g/L; Tricaineilfonato, memorizzato nel buffer con 0,5 M NaHCO₃). Dopo l'induzione, ruotare l'animale sulla schiena ed esaminare l'addome.
2. Valutazioni morfometriche
   1. Anuri
      NOTA: l'anestesia non è necessaria.
      1. Utilizzando le pinze, misurare l'animale dalla punta della bocca, lungo il centro del corpo alla punta della coda per ottenere SUL e SVL (Figura 2A, B).
      2. Tare un contenitore di plastica su scala di precisione digitale. Collocare l'animale in un contenitore di catrame e pesare (Figura 2C).
      3. Per gli animali più grandi, come le rane toro, o quando si ottengono pesi nel campo, utilizzare una scala appesa (Figura 2D).
      4. Come in molte specie di ananani, distinguere le femmine adulte R. muscosa dai maschi per le loro dimensioni più grandi e la mancanza di cuscinetti nuziali (pollice) sulle mani (Figura 3).
      5. Calcolare la condizione corporea, come valutazione di base della salute generale con la seguente formula:
         Indice di Fulton: K - massa e lunghezza³
         NOTA: L'indice di Fulton utilizza un equilibrio dimensionale di volume relativo alla massa e alla lunghezza in cui ³ è l'esponente di ridimensionamento che mette in relazione la massa e la lunghezza isometricamente.
   2. Caudate
      1. Scala di Tare con un sacchetto vuoto prima di posizionare l'animale non anestesizzato all'interno. Fare attenzione a non introdurre l'acqua in eccesso (Figura 2D) e agire rapidamente come animali secernono muco come risposta allo stress per essere trattenuto.
      2. Ottenere misure per adulti immobilizzando gli individui in posizione dritta nella parte inferiore di un sacchetto di plastica ri-sigillabile o in un contenitore di plastica separato che può ospitare pinze espanse.
      3. Misurare la lunghezza del corpo con pinze (Figura 2E).
      4. Misurare caudato dalla punta del muso alla punta della coda (SVL) per monitorare la crescita.
3. Osservazioni comportamentali
   1. Osservare fisicamente gli animali in tempo reale o utilizzare una videocamera per registrare il comportamento.
   2. Registrare le osservazioni degli animali classificare i comportamenti e costruire un etogramma (Figura 4).
   3. Classificare i comportamenti riproduttivi
      NOTA: La figura 4 esemplifica un tipo di comportamento riproduttivo osservato negli anurani.
4. ecografia
   NOTA: Il trasduttore ad ultrasuoni di scelta, in questo caso, 7,5 mHz lineare o un multi-frequenza (10-6 mHz) micro-convesso, è raccomandato per Necturus e una sonda a 10 MHz e gel solubile in acqua, senza sale per R. muscosa. L'esecuzione di ultrasuoni sulle salamandre può richiedere anestesia (vedi sezione 1.5 per le istruzioni).
   1. Anuri
      1. Eseguire ultrasuoni su R. muscosa utilizzando due persone (Figura 5A).
      2. Prima persona: Tenere l'animale con la mano dominante e applicare il gel solubile in acqua e senza sale all'addome dell'animale.
      3. Seconda persona (ultra-sonografo): Prendere la sonda da 10 MHz nella mano dominante e applicarla all'addome assicurandosi di fare un buon contatto tra la sonda e il gel.
      4. Scorrere verso l'interno da appena sotto la fossa del braccio verso il centro della linea mediana addominale dell'animale per visualizzare l'intera ovaia.
      5. Ultra-ecografo: Utilizzare la mano non dominante per congelare il telaio e catturare le immagini desiderate sull'ecografia.
      6. Classificare la fase del ciclo ovarico in base al sistema di classificazione stabilito per il genere⁴ (Tabella2, Figura 5B-F).
      7. Sciacquare qualsiasi gel fuori animale alla fine della procedura.
   2. Caudate
      1. Trasferire il Necturus non anestesizzato al contenitore rettangolare 4 L riempito con 2 L di acqua del serbatoio.
      2. Ridurre al minimo il movimento degli animali spegnendo le luci della stanza e/o la coppa di una mano sulla testa dell'animale.
      3. Posizionare il trasduttore a una distanza di 1-2 cm dalla parete del corpo.
      4. Individuare il cuore al livello della linea mediana ventrale agli arti anteriori e quindi spostare il trasduttore distally ed esaminare il tessuto ovarico⁷.
      5. Classificare le femmine in base al sistema di classificazione stabilito per il genere⁴ (Figura 6A,B,C).
      6. Ottenere misure accurate delle uova in fase di metà-fine gravid catturando immagini quando il corpo dell'animale è inclinato rispetto al trasduttore (cioè, non lineare, ma leggero arco; Figura 6B). In caso contrario, i follicoli sovrapposti rendono difficile distinguere le dimensioni dei singoli ovuli.
5. Induzione e recupero anestetici
   1. Anuri
      1. Anestesizza in MS222 (0,5 g/L; Tricaineilfonato tampone (0,5 M NaHCO₃) come descritto in precedenza.
      2. Utilizzare il riflesso di raddrizzamento come indicatore primario del grado in cui l'animale è diventato anetizzato. La completa perdita di riflesso dimostra uno stato di anestesia profonda.
      3. Rimuovere l'animale dall'anestesia a base di bagno d'acqua (MS-222) una volta perso il riflesso di radderamento.
      4. Mettere l'animale su un asciugamano bagnato (con acqua decorrata priva di anestetico).
      5. Assicurarsi di mantenere l'animale umido durante l'intera procedura chirurgica.
      6. Intubare piccoli anfibi con cateteri di gomma rossa, tubi non ammanettati o classici tubi endotracheali ammanettati senza gonfiare il polsino.
      7. Fornire un basso flusso di ossigeno (0,5-0,75 L/min) con 0,5-1% isoflurane.
      8. Fermare l'isoflurane dopo la procedura, ma mantenere il flusso di ossigeno per 1 minuto.
      9. Espatriare l'animale e sciacquare accuratamente l'animale con acqua declorato priva di anestetico per 2 minuti.
      10. Mettere l'animale in una quantità poco profonda di acqua decoratata o su un asciugamano bagnato.
      11. Valutare il recupero dell'animale tirando delicatamente su un arto posteriore per allungare. Qualsiasi contrazione rispondente dell'arto indica il riflesso di ritiro.
      12. Monitorare altri indicatori di recupero come le respirazioni gular (movimento della gola) e il riflesso di raddrizzamento.
      13. Si consideri l'anfibio recuperato quando tutti i riflessi sono tornati, e tassi di cuore e respirazione sono tornati ai valori pre-anestetici.
   2. Caudate
      1. Anestesizzare Necturus e Ambystoma in MS222 (0,5 g/L di metanotrico tricaino, tamponato con 0,5 M NaHCO₃, (MS222) in un serbatoio rettangolare da 4 L.
      2. Posizionare una pietra d'aria (1 pollice) e una pompa d'aria nel serbatoio e accenderla in un flusso costante per fornire un'adeguata ossigenazione.
      3. Quando la funzione dell'arto e il riflesso di raddrazione vengono persi, togliere l'animale dall'anestesia a base di bagno d'acqua (MS-222) e mettere l'animale su un asciugamano bagnato (con acqua de-clorato priva di anestetico).
      4. Mantenere la pelle e l'umidità branchiale con una bottiglia di spremere di acqua del serbatoio.
      5. Per recuperare l'animale, posizionarlo con cura lato ventrale verso il basso in un contenitore di plastica 4 L riempito con 2 L di acqua del serbatoio con una pietra d'aria.
         NOTA: Il recupero inizia con il lampo della branchia, seguito dalla capacità di muovere la coda e spingere in avanti e infine dal movimento funzionale degli arti.
      6. Riportare l'animale al suo serbatoio originale e monitorare da vicino sopra le prossime 24 h.
         NOTA: esistono altri metodi di anestesia per gli anfibi e questi sono descritti in Wright e Whitaker⁸.

2. Tecniche invasive di monitoraggio e controllo ovarico

NOTA: Questa procedura è stata adattata daForzàn et al.

1. Tenere la rana nella mano dominante e asciugare il lato di venipuntura del viso della rana con una salvietta sterile o una garza.
2. Asciugare il viso per evitare che il sangue si disperda troppo sulla pelle.
3. Inserire l'ago (26 G 1/2" e 27 G 1/2"), con la smussatura rivolta verso l'alto, attraverso la pelle dove la pelle sollevata intorno all'occhio e la cresta della mascella superiore si incontrano per formare il punto di un triangolo (contorno giallo) (Figura 7A) che accede al vena facialis vicino la vena orbitalis posteriore.
4. Forare la vena facciale sotto l'occhio destro e sopra la cresta della mandibola superiore, a partire da 1-2 mm indietro dalla linea mediana dell'occhio (Figura 7A).
   NOTA: Per le rane più piccole (sotto i 20 g), spostare il punto di inserimento più vicino a una posizione direttamente sotto la linea mediana dell'occhio.
5. Angolare il tubo microematocrit verso il basso per consentire la gravità per aiutare il flusso di sangue nel tubo. Il sangue dovrebbe scorrere immediatamente dopo la puntura (Figura 7B, C).
6. Al primo segno di flusso sanguigno, posizionare la punta del tubo di microematocrit presso il sito di puntura e raccogliere 1-2 tubi di microematocriti completi di sangue e posizionare i tubi in recipienti adatti per la raccolta (Figura 7B,C).
7. Se il sangue non scorre prontamente, o il volume è molto basso, spostare leggermente l'inserimento dell'ago o inserire l'ago nell'altro lato del viso.
8. Interrompere il sanguinamento premendo con fermezza la garza nel sito di foratura per almeno 20 s.
9. Lasciare la rana fuori dall'acqua per 10 minuti per confermare che il sito di puntura non riapre.
10. Utilizzare un nuovo ago e nuovi tubi microematocriti per ogni rana campionata.

3. Induzione ormonale

1. Preparazione dell'ormone
   1. Preparare le iniezioni di ormone immediatamente prima dell'uso per garantire il massimo effetto.
   2. Selezionare un ormone dalla selezione elencata nella Tabella 1.
   3. Determinare la concentrazione dell'ormone da iniemettere utilizzando un .L o mL/g di peso corporeo¹⁶.
   4. Diluire l'ormone in uno dei seguenti: acqua, fosfato tampolato salina (PBS), soluzione salina anfibio Ringer (SARS) o salino.
   5. Non superare un volume di iniezione di 200 gradi l per le rane del peso di 30-70 g e di 300 gradi l per le rane del peso di 80-110 g (osservazione personale)¹⁶.
   6. Per la corretta detenzione di un animale durante la somministrazione ormonale di qualsiasi animale compreso tra 10-100 g, utilizzare uno dei metodi appropriati per la detenzione descritti nella sezione 1.1.
2. Anuri
   1. Calcolare la concentrazione richiesta per individuo utilizzando un grammo per calcolo del peso corporeo (g/peso corporeo).
   2. Poco prima della somministrazione, ricostituire in un diluente sterile di scelta.
   3. Assicurarsi che non vengano lasciate bolle nella siringa prima dell'iniezione.
   4. Tenere l'animale saldamente nella mano non dominante e somministrare l'iniezione con la mano dominante.
   5. Somministrare l'iniezione secondo le specifiche dell'ormone. Le iniezioni più comuni negli ananurani sono sottocutanee, intraperitoneali o intra muscolari (Figura 8).
   6. Somministrare iniezioni di IP nella parte inferiore dell'addome o nella sezione inferiore del lato dorsale del corpo vicino alla gamba posteriore (Figura 9).
   7. Somministrare iniezioni intramuscolari preferibilmente nelle zampe posteriori.
3. Caudate (Necturus)
   1. Ricostituire l'ormone di scelta in acqua sterile secondo il grammo per metodo di peso corporeo descritto sopra.
   2. Nel caso di Necturus, utilizzare dosi di 1,7-2,3 g di peso corporeo GnRH/g.
   3. Rimuovere Necturus dalla camera anestetica e posizionare su una superficie di 45 gradi coperto di drappo chirurgico.
   4. Posizionare l'animale con la testa rivolta verso il basso.
   5. Avvicinarsi quadrante posteriore dell'addome (caudaldella gamba posteriore) ad un angolo di 15-20 gradi. Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa.
   6. Iniettare (IP) utilizzando una siringa di insulina e un ago da 27-30 G.
   7. Iniettare l'ormone utilizzando una siringa di insulina e 27-30 G ago.

4. Chirurgia

1. Preparazione chirurgica generale ed procedura
   1. Per mantenere le procedure asettiche, utilizzare tende di plastica sterili chiare per isolare il sito chirurgico. Ridurre l'evaporazione mantenendo umida la pelle circostante.
   2. Inumidire tutti i materiali che contatteranno la pelle dell'animale con acqua sterile. Fare incisione della pelle con un numero 15 o il numero 11 lama bisturi.
      NOTA: una combinazione di acciaio freddo, radiochirurgia o laser a diodo. L'emostasi nella procedura emorragica lieve può essere ottenuta tramite elettrocauter o laser a diodo.
   3. Utilizzare lance o applicatori con punta di cotone per consentire l'applicazione della pressione localizzata a piccoli vasi tenendo traccia della perdita di sangue.
   4. Utilizzare lance o applicatori con punta di cotone per gestire piccoli spazi confinati invece di quadrati di garza standard.
   5. Utilizzare microstrumenti, come strumenti oftalmologici, con punte sottili e piccole, quando si esegue un intervento chirurgico sugli animali di peso inferiore a 1 kg.
   6. Utilizzare retrattori in plastica e auto-contraenti (ad esempio, retrattore Lone Star) per adattarsi a diverse dimensioni di incisioni.
   7. Utilizzare i retrattili delle palpebre per ritrarre le incisioni coelomiche.
   8. Utilizzare la strumentazione di ingrandimento, se necessario, per eseguire un intervento chirurgico su pazienti più piccoli.
      NOTA: L'analgesia è necessaria con qualsiasi procedura chirurgica negli anfibi. La mancata somministrazione di un'adeguata analgesia durante l'intervento chirurgico è stata associata a un ritorno ritardato delle normali funzioni. Inoltre, l'analgesia potenzia gli effetti dei farmaci anestetici (Tabella 3)³⁴.
2. Anuri
   1. Una volta che X. laevis è stato anetizzato come descritto nel passaggio 1.5.1, posizionare l'animale nella recumbency dorsale (Figura 10A,C).
   2. Preparare il campo chirurgico asetically asciugando la garza umida sterile con la soluzione diluita povidone-iodino (1/10) sul sito per 10-15 s o 0.75% soluzione di clorhexidine sul sito chirurgico per almeno 10 min prima dell'intervento chirurgico³⁵.
   3. Fare un 3 mm incisione pelle paraparanso nel coelom medio (tra le spalle e la cloaca) con un colpo audace lasciando una pulita incisione utilizzando un n. 15 o no.
      NOTA: Si può usare un laser a diodo anche per le incisioni cutanee.
   4. Sollevare la membrana addominale, fare e incisione e sezionare con attenzione utilizzando un bisturi n. 15 o n. 11. (Figura 10B,D).
   5. Ritirare le incisioni coelomiche con retrattili delle palpebre (o qualsiasi attrezzatura appropriata).
   6. Accisa una porzione di massa di uova senza legare i vasi sanguigni.
   7. Per l'ovariectomia completa, cauterizzare i vasi sanguigni circostanti mediante elettrocauterio o diodo laser (Figura 11).
   8. Utilizzando la sutura monofilamento, chiudere l'incisione celiotomia con un modello di sutura interrotto ed eredificato.
3. Caudate
   1. Una volta A. mexicanum è stato anetizzato, posizionarlo nella recumbency laterale destra, con l'arto pelvico sinistro semplicemente posizionato contro la base della coda.
   2. Preparare il campo chirurgico asettibilmente mettendo garza umida sterile con soluzione diluita povidone-iodio (1:10) sul sito per 10-15 s. In alternativa, utilizzare garza sterile imbevuto di soluzione di clorhessia umida e posizionare sul sito chirurgico per almeno 10 min prima dell'intervento chirurgico (Figura 12A)^36,37 .
   3. Disegnare una linea tra la spalla e gli arti posteriori per dividere il corpo in tre parti uguali (Figura 12B).
   4. Fare il sito di incisione tra la seconda e la terza parte.
   5. Afferrare il muscolo sottostante ed elevare lontano dalle viscere coelomiche.
   6. Forzare delicatamente piccoli emostati attraverso la muscolatura coelomica e nella cavità coelomica.
   7. Ritirare le incisioni coelomiche con retrattori palpebrali (o qualsiasi materiale appropriato) (Figura 12C).
   8. Per l'ovariectomia completa, cauterizzare i vasi sanguigni circostanti mediante elettrocauterio o diodo laser (Figura 12D).
   9. Utilizzando la sutura monofilamento, chiudere l'incisione celiotomia con un modello di sutura interrotto ed eredificato.

Risultati

Morfometria e riproduzione

La visualizzazione dello stato riproduttivo femminile negli anfibi varia a seconda della specie. Il metodo più efficace è l'ecografia; tuttavia, alcune specie possono mostrare diversi gradi di trasparenza della loro pelle (Figura13A,B,C). L'ispezione visiva può spesso illustrare chiaramente le differenze tra una femmina gravida e quella non gravida quando la pelle è semi-traslucida come osservata in N. alabamensis e N. maculosus (Figura 13A, B); o traslucido come illustrato dalla rana vetro (Figura 13C). La colorazione della pelle maculata scura sull'addome di N. beyeri vieta questa valutazione da effettuare. In R. muscosa, la pelle non è traslucida ma si possono rilevare differenze evidenti tra femmine gravid rispetto a quelle che hanno recentemente oviposited perché la pelle è flaccida, e l'animale sembra più sottile (linea gialla) rispetto a un femminile gravid (linea blu) (Figura 13D). Con l'esperienza il gestore può familiarizzare con la differenza tra una grande femmina e una gravida, ma la conferma dello stadio gravido richiederà ultrasuoni. Gli indici di massa corporea negli anfibi possono essere calcolati utilizzando una serie di formule, ma la loro applicazione come strumento predittivo per la riproduzione è discutibile. Nel caso di R. muscosa, la correlazione tra l'indice di Fulton, la salute e lo stato riproduttivo rimane poco chiara.

Comportamento riproduttivo ed ecografia

I nostri risultati mostrano come caratterizzare i comportamenti riproduttivi in R. muscosa per la previsione dell'oviposizione (Figura 4). Diverse fasi che durano da poche ore a diverse settimane includono, corteggiamento dove un maschio insegue attivamente una femmina (Figura 4A), il maschio monta e fermamente si fermamente sporge sulla schiena della femmina, chiamato amplexus (Figura 4B). Una volta amplexed, la coppia può rimanere in amplexus per 1 – 5 settimane e la coppia visualizzerà altri comportamenti oltre a amplexus. Amplexus è un comportamento molto attivo che include il maschio che stringe la femmina in modo morbido di pompaggio (Figura 4C); la femmina in movimento e cominciando a visualizzare i comportamenti hand-stand a intermittenza (Figura 4D,E); e più vicino al tempo di oviposizione, la femmina, in un hand-stand, si appoggia su superfici che lei può attaccare le uova su di lui pompa vigorosamente il suo addome (in questo caso è possibile osservare anche la femmina sfregamento l'addome verso il basso da sotto il braccio si mette verso la cloaca. Questo può essere un modo meccanico con cui spingere le uova lungo gli ovidotti) (Figura 4F,G).

Questo studio illustra come gli ultrasuoni possono fornire informazioni con cui accertare lo stato riproduttivo nelle donne R. muscosa e Necturus. Quattro fasi di sviluppo sono rappresentate in R. muscosa (Figura 5C,D,E,F) e sono caratterizzate in modo simile in Necturus⁴ (Figura 6A,B,C). Inoltre, le uova residue possono non essere espulse portando alla ritenzione delle uova (Figura 5G, Figura 15A, B). La fase 1 mostra un'ovaia direttamente dopo l'oviposizione in cui i follicoli sono difficili da visualizzare (Figura 5C). Lo stadio 2 è rappresentato dalla comparsa di punti ecogenici (flecks bianchi) dispersi in tutta l'ovaia (Figura 5D). Lo stadio 2 e il 3 sono rappresentati da punti ecogenici più grandi e arrotondati con centri scuri che rappresentano follicoli da media a grandi (Figura 5E,F). Dal 2013 al 2017, necturus femminile in cattività sono state esaminate su base mensile ultrasonografia. Durante ogni esame agli individui è stato assegnato un punteggio di grado in base ai criteri riproduttivi stabiliti per il genere (Tabella 2). La percentuale di femmine che sviluppano nuove uova ogni anno erain media 88,2 x 3,01% (tabella 5). Mentre lo sviluppo delle uova era elevato, l'oviposizione non è stata garantita (Figura16). La maggior parte delle femmine che hanno subito l'oviposizione depositavano l'intero complemento di uova, mentre alcuni individui depositavano solo una frazione delle uova che si sviluppavano. Quelle femmine R. muscosa e Necturus con uova trattenute con concomitante con guadagno di liquidi nella cavità del corpo sono state allargate esternamente con macchie rosse sulla pelle coerenti con i vasi sanguigni scoppiati (Figura 14A,B ) . Il grado di ritenzione di liquidi potrebbe essere ulteriormente valutato tramite ultrasuoni (Figura15B). In entrambe le specie, le uova conservate hanno subito atresia o hanno assunto un aspetto più ecogenico (Figura 14C,D, Figura 15A).

Somministrazione ormonale

A seconda della profondità del tipo di iniezione l'angolo e la profondità dell'ago varierà. Per la maggior parte delle iniezioni la profondità dell'ago non deve essere più di 1 -2 mm di profondità quando si lavora con specie come R. muscosa, ma varierà nell'angolo di penetrazione. Le iniezioni di Prostaglandin (ip) hanno richiesto un inserimento intramuscolare (im) dell'ago angolato a 90 gradi, nella gamba posteriore di R. muscosa, mentre le iniezioni intra-peritoneali (ip), con una profondità simile alle iniezioni intramuscolari, sono state somministrate nell'area del cavità coelomica a una cavità coelomica a un 45 gradi (Figura10). La somministrazione di Anfiplex non ha avuto alcun effetto significativo nell'aumentare il numero di uova depositate da femmine trattate con ormoni rispetto ai controlli (P - 0,547), né vi sono state differenze nel numero di embrioni che si sono scissi (P - 0,673) o sono sopravvissuti al girino (P 0,629) (Tabella 4). In generale, la percentuale di donne ovipoiting è diminuita dall'80% nel 2011 al 28% nel 2014. Il numero di femmine che si sono oviposi nel 2015 è stato significativamente superiore a quello del 2013 (P - 0,0002), 2013 (P - 0,0001) e 2014 (P - 0,0026) ma non 2011 (P - 0,0885), riaffermando l'idea che le femmine di questa specie non possono riprodursi annualmente e che i protocolli ormonali richiedono di rifi nement. Per R. muscosa le femmine con segni di ritenzione di uova, le iniezioni intramuscolari di PGF₂ hanno avuto un tasso di successo del 60% nell'indurre l'espulsione delle uova degeneranti. Tuttavia, in una delle 5 femmine iniettate, il PGF_{2 non} era sufficiente a causare l'espulsione completa e alcune uova rimasero all'interno della femmina fino alla stagione riproduttiva successiva. Diciassette femmine di Necturus hanno ricevuto LHRH/(GnRH) e 13 hanno ricevuto una fasulla iniezione di acqua sterile per fungere da controllo (Tabella 5). In totale, sette necturus femminili (n : 4 alabamensis, n - 2 beyeri, n - 1 maculosus) sono passate a oviposi di undici frizioni complete che sono state attribuite sia agli individui Trattati da GnRH (n - 6) che al controllo (n ) . Tre femmine (n : 2 beyeri, n - 1 maculosus) ovipositeha cinque frizioni parziali (Figura 13). Questo fenomeno non sembra essere associato al trattamento ormonale esogeno in quanto tre femmine di controllo depositavano in modo simile frizioni parziali (Tabella 5). L'oviposizione si è verificata in un arco di tempo di 37 giorni (3/31-5/7) nel corso di cinque anni (Tabella 5). Non c'è stata alcuna differenza (P - 0,194) nei tassi di oviposizione tra LHRH/GnRH trattati (41 - 13,08%, intervallo 17-67%) e controllo (66,75 x 11,79%, intervallo 50-100%) Femmine. Le femmine trattate da LHRH/GnRH hanno depositato le uova in media 7,44 x 1,41 (gamma 3-13) giorni dopo l'iniezione. Data la natura completamente acquatica della specie e l'incapacità di trattenere manualmente senza anestesia, era necessario garantire un adeguato livello di sedazione prima di eseguire iniezioni ormonali IP (vedere la sezione 3.2 per le istruzioni sull'anestesia).

Raccolta del sangue, anestesia e chirurgia

La tecnica di campionamento del sangue in questo articolo è stata presa da Forzan et al. 2013¹⁰ e si è dimostrato un modo efficace per raccogliere il sangue da R. muscosa con minima invasività e stress. Utilizzando tubi microematocriti, è possibile raccogliere circa 35-45-l di plasma o siero per 70 - L di sangue intero (Figura 7). Il volume massimo di raccolta in R. muscosa era 1 tubo integrale microematocrito per 10 g di rana, fino a 4 tubi per rana per rane 40 g e più grandi. Questo è stato un volume di raccolta conservativa di 0,7 mL per 100 g, 70% della raccomandazione massima di 1,0 mL per 100 g (adattato da Allender e Fry, 2008)¹³.

Anestesia e chirurgia in anfibi sono raramente segnalati, ma è importante notare che le dosi e l'efficacia variano in modo specifico della specie. In Bombina orientalis, ad esempio, MS222 ha un effetto molto basso, anche con dosi elevate (1 g/L) mentre nei rospi boreali, Anaxyrus boreas boreas, 1 g/L è veloce (materia di minuti) e di lunga durata (3 h) (Calatayud, osservazione personale). In R. muscosa, l'anestesia richiede dosi segnalate per A. boreas boreas e ha effetti simili e tempi di recupero. Il digiuno anfibi prima dell'anestesia non è di solito richiesto in quanto la loro lassolla rimane strettamente chiusa anche in anestesia generale. Tuttavia, se ritenuto necessario, soprattutto se la procedura anestetica deve includere la chirurgia celomica, gli animali possono essere digiunati 24 h prima dell'anestesia.

Durante l'intervento chirurgico, il riflesso di raddrizzamento è l'indicatore primario che l'animale è diventato anetizzato. Il riflesso di raddordicamento è la capacità e il grado di facilità con cui un animale può tornare in posizione eretta dopo essere stato posizionato sulla schiena. La perdita del riflesso suggerisce uno stadio leggero dell'anestesia. Un piano chirurgico è indicato dalla perdita del riflesso di ritiro che include leggermente tirando l'arto per raddrizzarlo e l'animale non è più in grado di ritrarlo⁷. La chirurgia riproduttiva non ha ostacoli travolgenti e i pazienti anfibi guarisce prevalentemente bene tollerando la perdita di sangue più dei vertebrati superiori. La chirurgia dovrebbe procedere rapidamente, della durata di circa 15 minuti dall'inizio alla fine. I passaggi devono essere testati approssimativamente come segue: <1 minuto per l'incisione iniziale e <2 minuti per l'inserimento di celiotomia e retrattore, < 2-3 minuti per l'isolamento per ovaio e <1 minuto per la sutura o la cauterizzazione e la sutura cutanea della nave < 4 minuti. Il tempo totale di recupero dopo l'intervento chirurgico con protocolli MS222 sono di circa 45 minuti, ma questo può essere specifico della specie. In A. boreas boreas e R. muscosa tempi di recupero possono essere più lunghi, fino a 1 – 2 h. Quando si esegue un intervento chirurgico, occorre prestare attenzione per evitare di forare i polmoni, il tratto gastrointestinale o una vescica dilatata, e non danneggiare le ghiandole macroscopiche, i cuori linfatici e i vasi sanguigni, in particolare la vena medio-ventrale. A seconda della stagione, la presenza di grandi corpi grassi può rendere difficile la visualizzazione di altri organi. Una volta visibilmente sveglio, le risposte di un animale alla stimolazione degli arti, come la resistenza a un delicato stiramento di un arto posteriore o lampeggiante quando l'area intorno all'occhio viene stimolata (osservazione personale), sono classificate come risposte di ritiro. Il riflesso di raddrizzamento insieme ad altri indicatori di recupero tra cui, i riflessi di ritiro e movimenti gular, sono importanti indicatori di recupero.

					amministrazione
Nome comune	specie	ormone	procedura	Composto di priming	Dose di priming riportata	Numero di dosi di priming	Tempistica (hr prima della dose ovulatoria)	Composto/i somministrato per ovulazione/oviposizione finale	Dosi	referenza
Rospo portoricano crestato	Peltophryne lemure	GnRH & hCG	Ip	Hcg	1.5 IU/g	2 Il nome del sistema	hCG - 48	GnRH; hCG; GnRHa	0,2 g; 4 IU; 0,5 g di IU	Calatayud e altri inediti
Rana dalle zampe gialle di montagna	Rana muscosa	Anfiplex	Ip	GnRHa (des-Gly10, D- Ala6, Pro-NHEt9-GnRH)	0,4 g/m	1 : il nome del	24 Mi lasa' di	GnRH - MET	1 x 0,4 g/g	Calatayud et al., 2018
		PGF2o	Im	PGF2	5 ng/g	1 : il nome del	48 (di sistema)	PGF2	5 ng/g
Rospo boreale delle Montagne Rocciose meridionali	Anaxyrus boreas boreas	hCG, GnRH	Ip	Hcg	3.7 IU/g	2 Il nome del sistema	96, 24	hCG - GnRHa	13,5 IU/g : 0,4 g/g	Calatayud et al., 2015
Rana di cricket settentrionale	Crepitan Acris	Anfiplex	aggiunta all'acqua (10 mL)	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	GnRH - MET	0,17 g di z.	Snyder et al., 2012
Rana leopardo settentrionale	Lithobates pipiens	Anfiplex	Ip	nessuno	nessuno	0 (in vie	24 Mi lasa' di	GnRH - MET	1 x 0,4 g/g	Trudeau et al., 2010
Rana cornuta argentina	Ceratophyrs ornata	Anfiplex	Ip	nessuno	nessuno	0 (in vie	24 Mi lasa' di	GnRH - MET	1 x 0,4 g/g
Rana cornuta di Cranwell	Ceratofori cranwelli	Anfiplex	Ip	nessuno	nessuno	0 (in vie	24 Mi lasa' di	GnRH - MET	1 x 0,4 g/g
Rana macinata americana	Odontophrynus americanus	Anfiplex	Ip	nessuno	nessuno	0 (in vie	24 Mi lasa' di	GnRH - MET	1 x 0,4 g/g
Rana Gopher calatto	Rana sevosa	hCG, GnRH	Ip	Hcg	3.7 IU/g	2 Il nome del sistema	96 , 24	GnRH - hCG	1 x 0,4 g/g	Graham et al., 2018
Coqui comune	Eleutherodactylus coqui	Pesce, aviario, mammifero & GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH), hCG	M.b	mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg	nessuno	0 (in vie	Na	mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg	7,g, 33 g; 28 'g; 7,g, 20 g; 5, 10, 15, 20 g; 165 IU	Michael et al 2004
Rospo di Gunther	Pseudoficia guentheri	Gnrh		GnRHa	0,4 g/m	1 : il nome del	26 del sistema di	GnRHa con o senza primo	0,4 g/m	Silla 2010
Rana corroborea	Pseudophryne corroboree	Lucrin	M.b	Lucrin	1 g	1 : il nome del	26 del sistema di	Lucrin	5 g di g	Byrne & Silla, 2010
Rana Corroboree settentrionale	Pseudophryne pengilleyi	GnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH)	grazie	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	GnRHa	0,5 -2,0 g/g	Silla et al., 2017
Cane acquatico della costa del Golfo	Necturo beyeri	[des-Gly10, D- Ala6]-LhRH-RH etilelamide aceato sale idratare	Ip	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	Lhrh	100 g / 500 lL	Stoops et al., 2014
Rana campana meridionale / rana erba ringhiante	Litoria raniformis	des-Gly10, D- Ala6-[LHRH]	M.b	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	des-Gly10, D- Ala6-[LHRH]	50 g di g	Mann et al., 2010
Rospo di Fowler	Anaxyrus fowleri	GnRH, hCG, P4	Ip	Hcg	3.7 IU/g					Browne et al., 2006
Axolotl (salamandra messicana)	Ambystoma mexicanum	Ormoni stimolanti follici	Im	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	Fsh	400IU	Trottier e Armstrong, 1974
Rana artigliata africana	Xenopus laevis	hCG & P4	acqua aggiunta; Ip	PMSG, hCG						Marcec , 2016
Salamandra tigre	Ambyma tigrinum	hCG, LH
Rospo del Wyoming	Anaxyrus baxteri	hCG, GnRHa, P4	Ip	hCG - GnRHa	100 IU - 0,8 g	1 : il nome del	72 del 179	hCG - GnRHa	100 IU - 0,8 g	Browne et al., 2006
Rana leopardo settentrionale	Lithobates pipiens	Estratto pituitario (PE), P4, testosterone (T), corticosterone [C], Anfiplex, domperidone (D)	SC, IP	nessuno	nessuno	0 (in vie	Na	PE, PE, PE, PE,P4, PE-C; Anfiplex, GnRH - D	100 IU (LHRH) in 1 mL; PE 0,002 g/L; PE-0.01mg/50mL; PE-0,1mg/50mL; 0,4 g/g di 10 g/g;  0,4 g/g	Wright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Rana macinata	Lymnodynastes tasmeniensis	Estratti pituitari, hCG, GnRHa,	Ip	GnRHa	0,9-1,2 g/g	1 : il nome del	20 anni	PE; PE : hCG; GnRH	PE vol; PE vol - 100 IU hCG; GnRH (0,9-1,2 g/g)	Clulow et al., 2018
Rana campana verde e dorata	Litoia aurea	Gnrh	Ip	GnRHa	10 g	1 : il nome del	72 del 179	GnRHa	20 g di Euro	Clulow et al., 2018
Grande rana Sbarrata	Mixofifyeslatus fasciolatus	hCG e PMSG	M.b	PMSG, hCG	50 IU e 25 IU; 1x100 IU	2; 2 Il nome del sistema	PMSG-144 e 96;  hCG-24	Hcg	100IU	Clulow et al., 2012
Per altri protocolli ormonali e specie vedi Wright e Whitaker, 2001

Tabella 1: Specie di anfibi e alcuni degli ormoni esogeni testati su di loro come riportato nella letteratura. gonadotropina corionica umana (hCG); Gonadotropina rilascio-ormone (GnRH); Ormone Lutenizing -rilascio (LHRH); le lettere m, a e f rappresentano 'mammifero', 'aviaria' e 'pesce'; gonadotropina del mare incinta (PMSG); progesterone (P4); Ormone mitollo-stimolante FSH); estratto ipofisario (PE); testosterone (T); corticosterone (C). Gli antagonisti della dopamina elencati includono: domperidone (D); Pimozide (P); metoclopramide (MET). Anfiplex è il nome dato ad un composto composto composto da GnRH e Metoclopramide27. Lucrin è un agonista GnRH disponibile in commercio con il principio attivo è l'acetato di Leuprorelin. ^{4 DEL psu' , 7} (in questo stato ^{, 17} mi lato ^{, 18} mi lato ^{, 19} del 12 ^{, 20 anni , 26} del sistema di ^{, 27 mi} lapiùdel ^{, 38 Mi} lasa ^{, 39 mila: l'altro , 40} anni ( ^{, 41} del sistema ^{, 42} o più ^{, 43} (di cine) ^{, 44} (di sistema) ^{, 45 anni}

pendenza	Stato riproduttivo	descrizione
0 (in vie	Non-gravid	Non sono visibili uova.
1 : il nome del	Preazione precoce	Uova visibili (1-2 mm di dimensione) nessuna linea echogenica distinta associata all'uovo.
2 Il nome del sistema	Mid gravid	Uova di dimensioni 2-3 mm, distinte linee ecogeniche associate ad ogni uovo.
3 (COM del nome	Tardo gravid	Uova 4-5mm di dimensioni, linee ecogeniche ancora visibili, marcato aumento nell'aspetto anecoico dell'uovo.
4 DEL psu'	Uova conservate	Vari gradi di materiale echogenico presenti nella struttura interna delle uova, assumono forma amorfica. Alcuni possono diventare molto echogenico e associato con ritenzione di liquidi nella cavità del corpo.

Tabella 2: Sistema di classificazione utilizzato per segnare lo stato riproduttivo della femmina in cattività Necturus e Rana muscosa per ultrasonografia.

di droga	Dosaggio e Percorso	Commenti - riferimento
Buprenorphin	50 mg/kg (intracelomico)	Studio sperimentale in un tritonio orientale macchiato di rosso (Notophthalmus viridescens). Analgesia deve essere somministrato prima dell'intervento chirurgico. (Koeller, 2009)
Butorfanolo	1 – 10 mg/kg (IM o intracelomico)	Ci sono varie responsabilità specifiche. Si consiglia di iniziare da 1 mg/kg.
Butorfanolo	0,5 mg/L (bagno)	Studio sperimentale in un tritonio orientale macchiato di rosso (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanil	1 mg/kg	Analgesia > 4 h, antagonizzata da naltrexone (Stevens, 1997)
Meloxicam	Da 0,1 a 0,2 mg/kg (IM)	(Minter, 2011)

Tabella 3: Protocolli per analgesia negli anfibi.

	Rana muscosa
anno	2014	2015
No, ♀	18 mi lato	18 mi lato
Sviluppo delle uova	61%	94%
Controllo ♀	4 DEL psu'	6 È possibile:
♀ Anfiplex	4 DEL psu'	7 (in questo stato
Media giorno post Amphiplex a oviposit	10.5 (in questo dap.	10.9 (in questo da p: 9)
Tasso di oviposizione (Anfiplex)	22,20%	33,33%
Tasso di oviposizione (controllo)	22,20%	38,88%

Tabella 4: Confronto dei parametri riproduttivi tra trattati con anfiplex rispetto al controllo della femmina in cattività Rana muscosa nel 2014 e nel 2015.

Necturo sp.
anno	1 : il nome del	2 Il nome del sistema	3 (COM del nome	4 DEL psu'	5 Del numero 3(
No, ♀	6 o più di 6 anni	7 (in questo stato	7 anni di su 7	7 anni di su 7	7 anni di su 7
Sviluppo delle uova	83%	100%	86%	86%	86%
♀ di LHRH	3 (COM del nome	5 Del numero 3(	3 (COM del nome	6 È possibile:	0 (in vie
Controllo ♀	2 Il nome del sistema	2 Il nome del sistema	3 (COM del nome	0 (in vie	6 È possibile:
Giorno dopo LHRH a Oviposit	5 Del numero 3(	7 (in questo stato	5,5 (intervallo 3 - 8)	13 del sistema	non pertinente
Tasso di Oviposition (LHRH)	60%	20%	67%	17%	non pertinente
Tasso di oviposizione (controllo)	50%	50%	100%	non pertinente	67%
N.1 ♀ nessun sviluppo di uova

Tabella 5: Un confronto dei parametri riproduttivi tra LHRH (GnRH) -trattati e controllo (acqua sterile) femmina in cattività Necturo da tre specie in un periodo di tempo di 5 anni (2012-2017).

Figura 1: Tre metodi per tenere in mano una rana. (A) Procedura 1. (B) Procedura 2. (C) Procedura 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valutazioni morfometriche. (A, B) SVL/SUL (C, D). peso, in R. muscosa e D. Necturus. (E). Misura delle dimensioni con pinze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il dimorfismo sessuale si distingue per le pastiglie nuptial sui maschi R. muscosa adulti rispetto alle femmine. (A) Femmina (B) Maschio. Il pannello inferiore mostra la lunghezza del maschio rispetto alla femmina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratterizzare i comportamenti riproduttivi che portano all'oviposizione in R. muscosa (A) corteggiamento. (B) Amplexus. (C) Maschio che spremi femminile mentre in amplexus. (D, E) Femmina amplexata in un hand-stand. (F, G) Contrazioni addominali e oviposizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Ultrasuoni eseguiti su R. muscosa A-B con stato riproduttivo secondo lo stadio di sviluppo⁴. (A, B) Esecuzione di ultrasuoni su Rana muscosa. (C) Grado 0. (D) Grado 1. (E) Grado 2. (F) Grado 3. (G) Grado 4 (uova ovulate e trattenute) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagini ad ultrasuoni di Necturus. (A) Grado 1. (B) Grado 2. (C) Uova di grado 3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Raccolta del sangue in R. muscosa. (A) Raccolta di sangue perforando la vena orbitalis posteriore la vena facciale appena sopra la mascella al centro dell'orbita. (B, C) Il sangue viene rilasciato sulla superficie della pelle e viene raccolto con un tubo capillare eparanato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Metodi di iniezione negli anfibi. A seconda della profondità del tipo di iniezione l'angolo e la profondità dell'ago varierà. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Iniezione ormonale in R. muscosa. Induzione di oviposizione per trattamento ormonale nelle femmine Rana muscosa iniettate con anfiplex intra-peritonealmente. Le ovaie si trovano nella cavità coelomica Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Preparazione prima dell'intervento. (A) Preparazione apettitica dell'area chirurgica mediante soluzione diluita povidone-iodino (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Pulire l'incisione del bisturi in un'incisione cutanea a diodo laser Onopus o, (C), l'incisione a diodo laser, Lithobates catesbeianus. (D) Evitare di danneggiare la venina medio-ventrale, Trachycephalus resinifictrix. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Ovariectomia in Xenopus laevis. (A) Esporre e spostare grandi corpi grassi per scoprire la massa di uova. (B) Accise una porzione di massa di uova senza legare i vasi sanguigni. (C) Cauterizzare i vasi sanguigni circostanti mediante elettrocauterio per una completa ovariectomia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Preparazione pre-chirurgica e ovariectomia in A. mexicanum. (A) Garza sterile imbevuta di, soluzione di clorhessia dello 0,75% applicata al sito chirurgico (B). Una linea tra la spalla e gli arti posteriori divide l'animale in tre parti uguali e la macchia blu segna il sito sull'incisione. (C) Ritirare le incisioni coelomiche con retrattili delle palpebre. (D) Per una completa ovariectomia, cauterizzare i vasi sanguigni circostanti mediante elettrocautismo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13: Valutazione visiva delle fasi riproduttive. (A, B) Valutazioni visive dello stadio riproduttivo attraverso la pelle semi-traslucida, Necturus. (C) Pelle traslucida, Hyalinobatrachium (rana di vetro). (D) Valutazione visiva di R. muscosa prima (giusta, linea blu) e dopo l'oviposizione (sinistra - linea gialla). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 14: Ritenzione di uova. (A, B) Rana muscosa femmina con grave caso di ritenzione di uova. (C) L'ecografia mostra vecchie uova degeneranti, uova (in alto) e uova più grandi (pannello centrale e inferiore) ovulate e intrappolate nel coelom. (D) Uova trattenute recuperate mediante rimozione manuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 15: Immagini ad ultrasuoni di uova trattenute in Necturus che (A) sono diventate ecogeniche nell'aspetto (cerchio) e sono state associate alla ritenzione di liquidi (B) nella cavità del corpo (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 16: Percentuale di necturus femminile in cattività che oviposite aveva frizioni complete o parziali (2013-2017) rispetto a quelle che non oviposi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La movimentazione diretta, l'osservazione visiva e le misure morfometriche forniscono tecniche non invasive e sono i primi criteri di valutazione per determinare la fase riproduttiva femminile. Tuttavia, questo studio mostra che le ovaie gravide non possono sempre essere identificate in modo affidabile dalla palpazione. A seconda della specie, le ovaie gravide possono talvolta essere rilevate visivamente attraverso la pelle semi-traslucida (Figura 13A, B) o completamente traslucida sul lato ventrale dell'animale ( Figura13C). Le femmine che hanno completato l'oviposizione possono mostrare ovvi cambiamenti al loro aspetto rispetto alle femmine gravide (ad esempio, pelle sciolta e perdita fino al 30% della loro massa corporea, Figura 13D). Durante l'allevamento, maschi e femmine mostreranno alcuni comportamenti che forniscono informazioni sulla vicinanza all'ovulazione e all'oviposizione. Nel caso di R. muscosa indicazioni che una femmina è vicino alla oviposizione iniziano con la femmina che entra tribune.

L'applicazione della tecnologia a ultrasuoni agli anurani e caudate consente la diagnosi di presenza o assenza di uova e se l'oviposizione è stata associata al rilascio completo o parziale di uova sviluppate. Pertanto, questo metodo fornisce una valutazione più completa e accurata dello stato riproduttivo senza limitarsi a determinare lo stato gravido/non gravid attraverso una tecnica di visualizzazione che varia in base alla trasparenza della pelle addominale o alla coerenza epidermica tra le diverse specie di anfibi. Gli ultrasuoni possono essere eseguiti con relativa facilità e con poca sollecitazione per gli animali (Figura5 e Figura 13) e possono essere utilizzati per caratterizzare i cicli riproduttivi e per determinare lo stato riproduttivo⁴. È fondamentale acquisire familiarità con la specie; tuttavia, questo studio ha mostrato che Necturus e R. muscosa condividono segni di sviluppo comuni nei loro modelli riproduttivi che consentono una classificazione simile della fase riproduttiva (Figura 5). Attraverso questa tecnologia è ora dimostrato che lo sviluppo delle uova è ad alto contenuto in cattività Necturus e R. muscosa e che entrambe queste specie seguono un modello stagionale. Anche se le ragioni di questi fenomeni sono sconosciute e richiedono ulteriori indagini, senza l'uso di ultrasuoni, diverse aree di disfunzione ovarica, come la ritenzione di uova e l'oviposizione parziale, sarebbero passate inosservate. Le future applicazioni di questa tecnica saranno utilizzate per determinare se le femmine debbano essere selezionate per l'allevamento in un dato anno e se l'oviposizione sia completa.

Un protocollo di raccolta del sangue, come quello presentato in R. muscosa, che è sia efficace e provoca il disagio minimo per l'animale, è ottimale per studiare i profili ormonali in anurani in cattività e selvatici (Calatayud, inedito). Ad oggi, non esistono informazioni riguardanti i profili ormonali annuali di R. muscosa in cattività e, quindi, nessuna conoscenza su come gli ormoni influenzano la loro salute e riproduzione. Inoltre, con la prova che le femmine di questa specie potrebbero non essere allevatrici annuali, la profilazione ormonale sarà un altro metodo per tracciare i cicli ovarici. Insieme agli ultrasuoni, l'analisi ormonale può portare a una migliore previsione di ciò che le femmine saranno pronte per l'oviposizione. Inoltre, nell'ultimo anno, sono stati documentati due casi di intersessuali nella popolazione in cattività di R. muscosa. Inoltre, lo sviluppo delle pastiglie è stato notato su alcune delle femmine fondatrici più anziane. Motivi per questo sono attualmente in fase di indagine, ma i risultati iniziali suggeriscono che può riguardare i cambiamenti nei livelli di testosterone (Calatayud, inedito). Discernere i cicli ormonali nelle femmine di età diverse ci aiuterà a capire perché le femmine possono sviluppare caratteristiche sessuali secondarie associate agli uomini e se questo è prevedibile in una popolazione che invecchia.

La terapia ormonale esogena è stata utilizzata per superare le disfunzioni riproduttive frequentemente riscontrate negli anfibi in cattività. Tuttavia, per entrambe le popolazioni di R. muscosa e Necturus in questo studio, non sono state rilevate differenze significative nell'oviposizione tra le femmine trattate con ormoni e di controllo in un periodo di tempo di 2 e 5 anni, rispettivamente. Questo può indicare che il protocollo di somministrazione ormonale, dosi, priming e combinazione di ormone utilizzato non era adeguato per la specie. Un'analisi più approfondita delle singole storie riproduttive femminili suggerisce che R. muscosa potrebbe non sperimentare l'allevamento annuale, il che potrebbe anche spiegare la mancanza di effetto ormonale osservato nelle femmine trattate. Poiché una certa percentuale di femmine ha saltato costantemente l'allevamento ogni anno, comprendere la storia naturale della specie può aiutare a determinare se c'è bisogno di ormoni esogeni e quando possono essere più efficaci. Le procedure descritte in questo articolo possono essere applicate a diverse specie, (Tabella 1) e sono per gli anurani che vanno da 5 g a 150 g; animali più grandi possono richiedere siringhe e aghi diversi. La posizione dell'iniezione varia con alcuni ormoni che richiedono iniezione intramuscolare, intra-peritoneale, sottocutanea o intradermica (Figura 7).

La chirurgia ai fini dell'ovariectomia è un metodo comune utilizzato in varie specie di anfibi per ottenere gli ovociti per gli studi embrionali. L'ovariectomia può anche essere indicata per il controllo della popolazione e problemi medici come la ritenzione delle uova. Nel caso di ovariectomie parziali in cui, la raccolta degli ovociti viene eseguita per scopi di ricerca, la chirurgia deve garantire che l'animale rimanga riproduttivo. L'amministrazione del PGF_{2 '} ha mostrato una certa promessa nel risolvere la ritenzione di uova in R. muscosafemminile . In diversi individui, il PGF_{2' ha} suscitato la completa deposizione di uova precedentemente conservate, ma in altri si è verificata solo una deposizione parziale che richiedeva una rimozione manuale per rimuovere tutte le uova. Mentre la PGF_{2 può} servire come alternativa alla chirurgia per la ritenzione di uova in R. muscosa, la sua capacità di porre rimedio a condizioni patologiche simili in altri anfibi richiederà la convalida specifica della specie. Quando l'intervento chirurgico è richiesto per il paziente anurano o caudato, è necessario garantire un adeguato piano di anestesia prima che vengano effettuate incisioni. Sono necessarie capacità di osservazione astute per valutare e monitorare le risposte di induzione e recupero normative, come delineato in questo studio per ciascuno dei taxa. Una volta che si ha familiarità con l'anatomia specifica, un approccio chirurgico appropriato, l'emostasi, la manipolazione delicata dei tessuti e un'adeguata gestione postoperatoria, gli interventi chirurgici riproduttivi non pongono ostacoli travolgenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GE logiq Book XP e sonda 8C-RS 4e10 MHz GE Medical Systems	GE medical systems	GE logiq Book XP	Ultrasound
Aloka 500 7,5mHz lineare o IBEX multi-frequenza (10-6mHz) micro-convesso	GE medical systems	8C-RS (10 MHz)	Sonda ecografica
BD monouso U-100 siringa da insulina (ago da 28-29 G)	Mettler Electronics Corp CA	Sonigel	Ultrasound gel (solubile in acqua, senza sale)
Ormone
Ormone di rilascio delle gonadotropine	BACHEM	4012028	sinonimo: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetato abbreviazione: GnRH
Ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante	BACHEM, Sigma-Aldrich	4033013;         L1898	sinonimo: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sale acetato; [D-Ala6}-LHRH acetato sale idrato abbreviazione: LHRH
Gonadotropina corionica umana	BACHEM, Sigma-Aldrich	4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10	sinonimo: Gonadotropina corionica-β (109-145)(109-119); Coriogonina, HCG (2.500UI, 5.000UI, 10.000UI) abbreviazione:
hCG Prostaglandina 2&alfa;	Sigma-Aldrich	P40424;	sinonimo: (5Z,9&alfa;,11&alfa;,13E,15S)-9,11,15-Triidrossiprosta-5,13-acido dienoico tris sale, PGF2&alfa; &meno; Tris; abbreviazione: PGF2α
Ormone follicolo-stimolante	Sigma-Aldrich	F4021, F8174<	strong>sinonimo: suino, sheep abbreviazione:
FSH Progesterone	Sigma-Aldrich	46665;           P7556	sinonimo di Vetranal; P4 solubile in acqua abbreviazione: P4
Estratto ipofisario	na		sinonimo: Controlla i documenti per la derivazione delle specie di anfibi abbreviazione: PE
Siero di cavalla incinta Gonadotropina	Prospec;             Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich	HOR-272;       493-10; 9002-70-4	sinonimo: Siero di cavalla gravida Gonadotropina abbreviazione: PMSG
Metaclopromide	Sigma-Aldrich	M0763	sinonimo: 4-Amino-5-cloro-N-[2-(dietilammino)etil]-2-metossibenzamide, Metossicloroprocainamide abbreviazione: MET
Lucrin	BACHEM; Sigma-Aldrich	4033014;     L0399	sinonimo: Acetato di leuprorelina abbreviazione: Lucrin
Lutalyse	Pfizer		sinonimo: PGF2&alfa; - Dinoprost trometamina abbreviazione: Lut
Pimozide	Sigma-Aldrich	P1793	sinonimo: 1-[1-[4,4-bis(4-fluorofenil)butil]-4-piperidinil]-1,3-diidro-2H-benzimidazolo-2-one abbreviazione: PZ
Amphiplex	vedi sopra		sinonimo: Ormone di rilascio delle gonadotropine + metoclopramide abbreviazione: GnRH + MET
Ovopel	Ovopel	na	sinonimo: GnRHa + antagonista del recettore della dopamina (somministrato 1 pellet/kg) abbreviazione: Ovo
Ovaprim	Pentair ecosistemi acquatici	Ova10	sinonimo: Gonadotropina di salmone + domperidone abbreviazione: Ovulo
Domperidone	Sigma-Aldrich	D122	sinonimo: 4-(5-cloro-2-osso-1-benzimidazolinil)-1-[3-(2-ossobormidazolil)propil]piperidina abbreviazione: DOM