L'obiettivo del presente studio è di dimostrare la tecnica immunostaining e visualizzazione di intero-monta come un metodo ideale per l'imaging 3D della componente cellulare e architettura del tessuto adiposo.
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Articolo metodologico
Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuto adiposo è un organo metabolico importante con alta plasticità ed è sensible a reagire agli stimoli ambientali e stato nutrizionale. Come tale, le varie tecniche sono state sviluppate per studiare la morfologia e la biologia del tessuto adiposo. Tuttavia, metodi di visualizzazione convenzionale sono limitati a studiare il tessuto nelle sezioni 2D, non riuscendo a catturare l'architettura 3D dell'intero organo. Qui presentiamo intero-monta la macchiatura, un metodo di immunohistochemistry che conserva intatto il tessuto adiposo morfologia con passaggi di elaborazione minima. Quindi, le strutture di adipociti e altri componenti cellulari sono mantenute senza distorsione, ottenendo la visualizzazione 3D più rappresentativo del tessuto. Inoltre, intero-monta la macchiatura combinabile con metodi di analisi di lignaggio per determinare le decisioni di destino delle cellule. Tuttavia, questa tecnica ha alcune limitazioni a fornire informazioni accurate per quanto riguarda le parti più profonde del tessuto adiposo. Per ovviare a questa limitazione, intero-monta la macchiatura possa essere ulteriormente combinata con tessuto tecniche per rimuovere l'opacità del tessuto e consentire la visualizzazione completa dell'intero tessuto adiposo anatomia usando microscopia fluorescente luce-foglio di compensazione. Di conseguenza, una maggiore risoluzione e più accurata rappresentazione delle strutture di tessuto adiposo può essere catturati con la combinazione di queste tecniche.
Introduzione
Tessuto adiposo è un organo essenziale per la conservazione di energia ed è caratterizzato da dinamiche di rimodellamento e quasi illimitata espansione1. Oltre l'omeostasi energetica, tessuto adiposo inoltre svolge un ruolo essenziale nella secrezione dell'ormone di adipochine oltre 50 di modulare la funzione metabolica del corpo intero2. Tessuto adiposo ha una diversa architettura composta da vari tipi cellulari tra cui adipocytes maturi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e di cellule progenitrici del adipocyte3. Recenti studi hanno dimostrato che l'obesità e altre disfunzioni....
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di cura animale del centro per Phenogenomics (TCP) conformi agli standard del Consiglio canadese su Animal Care. Topi sono stati mantenuti su cicli di luce/buio di 12 h e forniti con libero accesso all'acqua e cibo. 7 mese vecchio topo maschio C57BL/6J sono stati usati nell'esperimento colorazione intero-monta.
Nota: Sezioni 1 e 2 sono in ordine cronologico, con la sezione 3 è un passaggio facoltativo subito dopo la sezione 1. Sezione 4 possono essere eseguite per analizzare la densità di dimensione e dei vasi sanguigni del adipocyte dopo il completamento della sezion....
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Risultati
A causa della fragilità del tessuto adiposo, metodi che coinvolgono più fasi di lavorazione e sezionamento possono condurre allo sfregio del tessuto adiposo morfologia3 (Figura 1A). Tuttavia, l'intero-monta la macchiatura può preservare la morfologia degli adipociti, assicurando la corretta interpretazione dei risultati (Figura 1B).
Sovra-fissazione del tessuto adiposo conduce ad autofluorescenza fissativo-indo.......
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Discussione
Anche se le tecniche convenzionali come l'istologia e donatrici offrono benefici per osservando struttura intracellulare, intero-monta la macchiatura offre una prospettiva diversa nella ricerca del tessuto adiposo, che consente la visualizzazione in 3D del cellulare architettura del tessuto minimamente trasformato.
Per eseguire correttamente la macchiatura intero-monta, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Depositi di differenti del tessuto adiposo possono produrr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) del Canada, pilota e Grant di studio di fattibilità di Banting e Best diabete centro (PPMI), il fondo iniziale di SickKids a H-K. S., Medical Research Center programma (2015R1A5A2009124) attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro progettando di J-R.K.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 anticorpo primario | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tirosina idrossilasi) anticorpo primario | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI colorante | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R microscopio confocale | Nikon | ||
| Ultramicroscopio I | LaVision BioTec | Microscopio fluorescente con immagine a foglio di luce | |
| Alexa Fluor anticorpi secondari | Jackson ImmunoResearch | Lunghezze d'onda 488, 594 e 647 utilizzate | |
| Ratto purificato Anti-Topo CD16/CD32 | BioSciences 553141 | ||
| Diclorometano | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzil-etere | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Metanolo | Fisher Chemical | A452-1 | |
| Perossido di idrogeno al 30% | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Eparina | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Kit lectina I, fluoresceina etichettato | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium con DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldeide (PFA) | |||
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Siero animale (capra, asino) |
Riferimenti
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflamma....
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Ristampe e permessi
