Articolo metodologico

Valutazione dell'interazione tra la proteina di complemento C1q e l'acido chialuronico nella promozione dell'adesione cellulare

DOI:

10.3791/58688

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15 giugno 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il componente complementare C1q è una molecola pro-infiammatoria altamente espressa nel microambiente tissutale che può interagire con la matrice extracellulare. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all'acido ialuronico influisce sull'adesione cellulare.

Abstract

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È stato sempre più dimostrato che il microambiente tumorale svolge un ruolo attivo nella crescita della neoplasia e nella metastasi. Attraverso diversi percorsi, le cellule tumorali possono reclutare in modo efficiente le cellule stromali, immunitarie ed endoteliali secernendo fattori stimolatori, chemiochine e citochine. A loro volta, queste cellule possono alterare le proprietà di segnalazione del microambiente rilasciando segnali di promozione della crescita, metaboliti e componenti di matrice extracellulare per sostenere l'elevata proliferazione e la competenza metastatica. In questo contesto, identifichiamo che il componente complementare C1q, altamente espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, interagendo con l'acido ialuronico della matrice extracellulare, influenza fortemente il comportamento delle cellule primarie isolate dal tumore umano Esemplari. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all'acido ialuronico (HA) influisce sull'adesione delle cellule tumorali, il cui fatto è il fatto che le proprietà biologiche dei componenti chiave della matrice extracellulare (in questo caso ha) possono essere modellate da segnali bioattivi verso il tumore progresso.

Introduzione

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Il microambiente tumorale (TME) influenza lo sviluppo e la progressione del cancro poiché può fornire una nicchia permissiva per la sopravvivenza cellulare, la crescita e l'invasione. L'identificazione di nuovi attori chiave nel TME può essere utile per la scoperta di nuovi strumenti molecolari per la terapia mirata. Il TME comprende una rete complessa e dinamica di cellule non maligne, come cellule endoteliali, fibroblaste e cellule del sistema immunitario, incorporate nei componenti della matrice extracellulare circostante (ECM), tra cui collageni, laminoin, fibronectine, proteoglicani e ialuronani. Sia le cellule tumorali che non tumorali sintetizzano e secernonno componenti ECM insieme a citochine, chemiochine, fattori di crescita ed enzimi di rimodellamento infiammatorio e a matrice che nel complesso alterano le proprietà fisiche, chimiche e di segnalazione di TME. Tra questi costituenti, l'acido ialuronico (HA) è emerso per esercitare un ruolo cruciale nella biologia del tumore. Nonostante la sua semplice composizione chimica, HA, insieme alle sue molecole leganti HA (ialadherine), può modulare l'angiogenesi, la reattività del sistema immunitario e il rimodellamento ECM in modo di dimensioni e concentrazionedipendente 1.

Il sistema di complemento a complemento (C) fa anche parte del TME locale, che ha recentemente ricevuto una crescente attenzione. Il sistema C comprende una serie di proteine solubili e legate alla membrana coinvolte nella prima linea di difesa contro non autocellule, elementi ospiti indesiderati e agenti patogeni. Funzionalmente, la C collega i bracci a due etsuori dei sistemi innati e adattativi per promuovere l'uccisione diretta delle cellule o il montaggio di una risposta infiammatoria2. L'attivazione del tumore può sopprimere la crescita del tumore, distruggendo le cellule tumorali o inibendo la loro escrescenza, ma è diventato sempre più chiaro che può possedere un'attività di promozione del tumore sostenendo l'infiammazione cronica, promuovendo l'istituzione di un milieu immunosoppressivo, inducendo l'angiogenesi e attivando le vie di segnalazione legate al cancro3. In questo contesto, C1q, la prima molecola di riconoscimento del percorso classico del sistema C è emersa per esercitare importanti funzioni nel microambiente tumorale indipendentemente dall'attivazione C4. C1q è stato dimostrato di essere espresso localmente da una serie di tumori maligni umani, dove può favorire l'adesione delle cellule tumorali, la migrazione e la proliferazione oltre all'angiogenesi e metastasi5. È interessante notare che C1q interagisce con un importante costituente dell'ECM come l'HA.

Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare le cellule tumorali primarie dalla massa tumorale. Inoltre, abbiamo creato la matrice, che può stimolare il microambiente tumorale, in particolare l'interazione tra C1q e acido ialuronico ad alto peso molecolare. C1q legato all'HA è stato in grado di indurre l'adesione delle cellule tumorali.

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Protocollo

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Campioni di tessuti da pazienti sono stati raccolti dopo il consenso informato dopo l'approvazione delle considerazioni etiche da parte del Consiglio Istituzionale dell'Ospedale Universitario di Trieste, Italia.

1. Isolamento e coltura delle cellule tumorali (giorno 1)

  1. Isolare le cellule del mesotelioma umano da campioni solidi MPM. Tritare finemente il tessuto con una fresa per ottenere frammenti di circa 2-3 mm2 di dimensioni e incubare in 5 mL di soluzione di digestione composta da Soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) integrata con 0,5 mM Ca2 '/Mg2, 0,5% trypsin e 50 g/mL DNase I, pernottamento a 4 gradi centigradi.
  2. Isolamento e coltura delle cellule tumorali (Giorno 2)
    1. Dopo una notte di incubazione, mettere il tessuto digerito per 30 min in un'incubatrice a 37 gradi con agitazione delicata.
    2. Sostituire la soluzione di digestione alla centrifugazione (250 x g) con 3 mg/mL di collagenae di tipo 1 disciolta in 5 mL di Medium 199 con HBSS e incubare ulteriormente per 30 min a 37 sfaldamenti con agitazione delicata.
    3. Bloccare la reazione ezimatica aggiungendo il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS). Risospendere le cellule con molta attenzione con un pipet da 5 mL per garantire che la maggior parte delle cellule venga rilasciata dal tessuto. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro porosdi 100 m.
    4. Semina le cellule in un pallone da 12,5 cme le promulga a 37 gradi centigradi con cellule endoteliali medie umane prive di siero (HESF), con 10% FBS e completate con EGF (10 ng/mL), FGF di base (20 ng/mL) e 1% penicillina- streptomica.
      NOTA: Sostituire con un supporto fresco ogni 2-3 giorni.

2. Rivestimento HA (giorno 1)

  1. Risospendere l'HA ad alto peso molecolare (1,5 kDa) in acqua a doppia distillazione alla concentrazione di 1 mg/mL6.
  2. Soluzione di stock HA diluita a 50 g/mL nel tampone di carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) con tubi delicati.
  3. Coprire la piastra di 96 pozzetti con 100 litri di soluzione diluita per brodo HA per una notte a 4 gradi centigradi.
    NOTA: L'acido ialuronico era un dono gentile del professor Ivan Donati, Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste7.

3. Rivestimento C1q (giorno 2)

  1. Dopo una notte di incubazione, aspirare il vuoto ai pozzi trattati e lavare la piastra da 96 pozzetti con 100 Gradi l di PBS (dPBS) di Dulbecco per pozzo.
  2. Lasciare che C1q (25 g/mL o concentrazioni diverse per gli esperimenti di risposta alla dose) o BSA (come controllo negativo) si leghino alla plastica immobilizzata-HA incubando queste proteine ad una concentrazione di 25 g/mL in 100 gradi l di dPBS - 0,5% BSA e 0,7 mM Ca2 . Quindi incubare per una notte a 4 gradi centigradi.
  3. Aspirare i pozzi e lavare la piastra da 96 pozzetti con 100 gradi/pozzetto di dPBS.

4. Etichettatura delle celle con FAST DiI

  1. Risospendere 1 x 105 cellule tumorali in 500 - L di dPBS contenenti 10 g/mL del tintura fluorescente FAST DiI. Incubare per 15 min a 37 s in un'incubatrice 5% v/v CO2 per l'etichettatura, mescolando manualmente dopo intervalli di 5 min.
    1. Per rimuovere l'eccesso di FAST DiI, aggiungere 10 mL di dPBS, pipette delicatamente su e giù, e centrifugare a 250 x g per 7 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo libero di siero endoteliale umano contenente 0.1% BSA (HESF - 0.1% BSA).

5. Adezione cellulare su matrici HA/C1q (Giorno 1)

  1. I pozzi a vuoto aspirano i pozzi rivestiti con le diverse matrici (i pozzi sono stati rivestiti al punto 3.2).
  2. Distribuire 100 l delle sospensioni per celle etichettate nei pozze rivestite e incubare la piastra per 35 min a 37 gradi centigradi nell'incubatore 5% v/v CO 2.
  3. Rimuovere le cellule non aderenti aspirando il super-aderente. Lavare una volta con dPBS contenente lo 0,5% di BSA, 0,7 mM Ca2 e 0,7 mM Mg2.
  4. Eseguire il lyse le celle aderenti aggiungendo 200 l/podi di 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 x 0,1% v/v SDS e leggere immediatamente la piastra di 96 pozzeconto con un lettore di fluorescenza (544 nm, emissione 590 nm) utilizzando una curva di calibrazione generata attraverso la lisi di un numero crescente di etichette etichettate Cellule.

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Risultati

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L'HA è un polisaccago ad alto peso molecolare caricato negativamente, costituito da unità ripetute (1-4)-D-glucuronic acid-((1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disaccharide units (1B)7. Il verificarsi del legame di HA sulla piastra 96-well così come l'efficienza della sua immobilizzazione sono stati testati sfruttando ha biotinylated (bio-HA). Diverse concentrazioni di Bio-HA, che vanno da 10 g/mL a 1 mg/mL, sono state ri-sospese in 100 mM di...

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Discussione

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Descriviamo un metodo semplice per studiare come il componente complementare C1q, interagendo con l'acido ialuronico, è in grado di modulare il comportamento delle cellule primarie isolate dai tessuti tumorali umani. Sia l'HA che il C1q sono abbondantemente presenti nel microambiente tissutale sia in condizioni fisiologiche che patologiche, partecipando a diversi processi biologici cellulari. Per esempio, C1q ha dimostrato di essere presente nel microambiente della placenta dove favorisce l'invasione extravillous tropobl...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Ivan Donati per aver fornito ha, Leonardo Amadio, Gabriella 'ito (Dipartimento di Ginecologia di IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia) e Andrea Romano (Unità Operativa Clinica di Anatomia e Istologia Patologica, Ospedale Cattinara, Trieste, Italia ) per la raccolta dei campioni di tessuto. Ringraziamo anche Nicolò Morosini per l'aiuto nella preparazione video e Alex Coppola, la voce. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Istituto per la salute materna e infantile, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Italia (RC20/16) e della Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100&sottile; µ m filtro poroBD Falcon352360
Soluzione di amfotericina B (fungizone)Sigma-Aldrich 1397-89-3
Scienze immunologicheFGF di baseGRF-15595
Cloruro di calcioSigma-Aldrich C-4901
Collagenasi di tipo IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-glucosioSigma-Aldrich 50-99-7
DNase I Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich60-00-4
EGFImmunological SciencesGRF-10544
FAST DiISonde molecolari, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Siero fetale bovinoGibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronectinRoche11051407001
Pallone per colture cellulariCorning430639sterile e ventilata
Sigma-Aldrich G1397-10ML
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBBS) Sigma-Aldrich H6648Integrato con EDTA, glucosio, penicillina-streptamicina, gentamicina e fungizone
Acido ialuronico ad alto peso molecolareGentile dono del Prof. Ivan Donati
Siero endoteliale umano senza terreno Gibco,  Thermo Fisher Scientific11111-044Integrato con EGF (5  ng/mL), FGF basico (10  ng/mL), e  1% di penicillina... streptomicina (Sigma-Aldrich)
Cloruro di magnesioCarlo Erba13446-18-9
Medium 199 con Hank' s saleSigma-Aldrich M7653
Penicillina-StreptomicinaSigma-Aldrich P0781
Microscopia time-lapse Nikon Sistema di imaging BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
TripsinaSigma-AldrichT4674
Soluzione di gentamicina

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

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Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

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