Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

Summary

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di codifica (mRNA) e non codificanti (ncRNA) globina ridotta RNA-seq librerie da un campione di sangue intero singolo.

Abstract

L'avvento di sempre più potenti e innovative tecniche di sequenziamento di generazione successiva ha aperto nuove strade nella capacità di esaminare l'espressione genica sottostanti relazionato ai processi biologici di interesse. Queste innovazioni non solo permettono ai ricercatori di osservare l'espressione delle sequenze di mRNA che codificano per geni che funzione cellulare di effetto, ma le molecole di RNA (ncRNA) non codificanti che rimangono non tradotte, ma ancora hanno anche funzioni di regolamentazione. Anche se i ricercatori hanno la possibilità di osservare l'espressione di mRNA e di ncRNA, era consuetudine per uno studio di concentrarsi su uno o l'altro. Tuttavia, quando gli studi sono interessati nell'espressione di mRNA e di ncRNA, molte volte usano campioni separati per esaminare o codifica o non-codificazione RNAs a causa della differenza nelle preparazioni di biblioteca. Questo può portare alla necessità di più campioni che può aumentare il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. Inoltre, può causare i ricercatori a decidere di preparare i campioni per sola analisi, solitamente il mRNA, limitando il numero di domande biologiche che possono essere studiate. Tuttavia, ncRNAs estendersi su più classi con ruoli regolatori che espressione di mRNA di effetto. Perché ncRNA sono importanti per i processi biologici fondamentali e disordine di questi processi in durante l'infezione, possono, pertanto, fare obiettivi attraenti per terapeutica. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo modificato per la generazione mRNA e non codificanti RNA librerie di espressione, tra cui RNA virale, da un singolo campione di sangue intero. Ottimizzazione del presente protocollo, migliorato purezza RNA, aumentata di legatura per recupero di RNAs metilato e omesso selezione di dimensioni, per consentire la cattura di altre specie di RNA.

Introduction

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come un potente strumento per lo studio dei cambiamenti che si verificano a livello genomico di organismi biologici. Preparazione del campione per i metodi di NGS può essere variata a seconda del microrganismo, tipo di tessuto, e soprattutto le domande i ricercatori sono desiderosi di indirizzo. Molti studi sono rivolti a NGS come mezzo per studiare le differenze nell'espressione genica tra gli Stati come individui sani e malati^1,2,3,4. Il sequenziamento di prendere posto su una base di inte....

Protocol

Protocolli degli animali sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC).

1. raccolta di sangue suina campioni

1. Prelevare campioni di sangue in provette di RNA. Raccogliere ~2.5 mL o più, se più grandi tubi di raccolta sono disponibili.

2. lavorazione del sangue suina campioni

1. Centrifugare le provette di sangue a 5.020 x g per 10 min a temperatura ambiente (15-25 ° C). Se l'elaborazione congelato campioni Incubare la provetta a temperatura ambiente per un minimo di 2 h prima della centrifugazione.

Results

I campioni rappresentativi nel nostro studio sono la globina e campioni di sangue intero di ribo-vuotati. Il risultato rappresentativo del protocollo è costituito da un esempio di libreria impoverito della globina con un numero di integrità di RNA (RIN) sopra 7 (Figura 1a) e rapporti di concentrazione di 260/280 nm pari o superiore a 2 (Figura 1b e c 1). Convalida dei risultati del campione è sta.......

Discussion

Il primo passo fondamentale nel protocollo che rendeva ottimizzato inclusa la procedura di svuotamento della globina aggiunto, che ha permesso di ottenere letture di qualità da campioni di sangue intero. Una delle più grandi limitazioni sull'utilizzo di sangue intero in studi di sequenziamento sono il numero elevato di letture nel campione che mappa alle molecole della globina e ridurre le letture che potrebbero mappe ad altre molecole di interesse¹⁸. Pertanto, nell'ottimizzare il protocollo per i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette PAXgene	PreAnalytix	762165
Acqua di Biologia Molecolare	ThermoFisher	10977-015
mirVana miRNA Kit di isolamento	ThermoFisher	AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit	QIAGEN	74204
100% Etanolo	Decon Labs, Inc.	2716
Provette a parete sottile da 0,2 mL	ThermoFisher	98010540
Provette prive di RNasi/DNasi da 1,5 mL	Qualsiasi fornitore
Veriti Termociclatore a 96 pozzetti	ThermoFisher	4375786R
Riduzione della globina Oligo (α 1)	Qualsiasi fornitore		Sequenza GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Riduzione della globina Oligo (α 2)	Qualsiasi fornitore		Sequenza TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Riduzione della globina Oligo (β 1)	Qualsiasi fornitore		Sequenza AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG
GT Riduzione della globina Oligo (β 2)	Qualsiasi fornitore		Sequenza GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Ibridazione
, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100-KCl
	Millipore Sigma	60142-100ML-F
10X RNasi H Tampone
-Tris-HCl, pH 7.6	Fisher Scientific	BP1757-100
-DTT	ThermoFisher	Y00147
-MgCl2	Promega	A351B
-Acqua di Biologia Molecolare	ThermoFisher	10977-015
RNasi H	ThermoFisher	AM2292
SUPERase-IN	ThermoFisher	AM2694	Inibitore della RNASI
EDTA	Millipore Sigma	E7889
Microcentrifuga	Qualsiasi fornitore
2100 Strumento BioAnalyzer per elettroforesi	Agilent Technologies	G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
Agilent DNA ad alta sensibilità  Kit	Agilent Technologies	5067-4626
Kit di preparazione della libreria di RNA totale a filamenti TruSeq con Ribo-Zero	Illumina	RS-122-2201	Kit di mRNA; Set umano/topo/ratto A  (48 campioni, 12 indici)
Guida alla preparazione del campione di RNA totale a filamento TruSeq	Illumina		Disponibile on-line
RNAClean XP Beads	BeckmanCoulter	A63987
AMPure XP Beads	BeckmanCoulter	A63880
MicroAmp Striscia ottica a 8 provette	ThermoFisher	N8010580	provette a parete sottile da 0,2 ml
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap	ThermoFisher	N801-0535
RNasi/DNasi - serbatoi di reagenti liberi Qualsiasi	fornitore
Trascrittasi inversa SuperScript II	ThermoFisher	18064-014
MicroAmp Piastre ottiche a 96 pozzetti	ThermoFisher	N8010560	Questi sono stati utilizzati al posto delle piastre da 3 ml secondo necessità
Pellicola adesiva ottica MicroAmp	ThermoFisher	4311971
NEBNext Multiplex Set di preparazione della libreria di piccoli RNA per Illumina (Set 1)	piccoli RNA	New England Biolabs	E73005
Set di preparazione della libreria di piccoli RNA multiplex NEBNext per Illumina (Set 2)	Kit per piccoli RNA New England Biolabs	E75805
Kit di purificazione PCR QIAQuick QIAGEN		28104
96S Piastra super magnetica	ALPAQUA	A001322