Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Sommario

Questo protocollo descrive il manuale procedura per isolare singoli neuroni fluorescente contrassegnati seguiti in vitro basati su trascrizione di mRNA amplificazione per la sequenza di RNA di alta profondità unicellulare di ordinamento.

Abstract

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) è ormai uno strumento ampiamente implementato per diluire l'espressione genica. Piattaforme di RNA-sequenziamento unicellulare commercialmente disponibili elaborano tutti gli input cellule indiscriminatamente. A volte, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono usata a Monte per isolare una popolazione specificamente con etichetta di interesse. Una limitazione di FACS è la necessità di un numero elevato di celle di input con frazioni significativamente con etichetta, che è pratico per la raccolta e profilatura popolazioni rare o scarsamente etichettati neurone dal cervello del topo. Qui, descriviamo un metodo per raccogliere manualmente sparse fluorescente etichettati singoli neuroni da appena dissociato del tessuto di cervello di topo. Questo processo consente per l'acquisizione di neuroni con etichetta singola con elevata purezza e successiva integrazione con protocollo in vitro basati su trascrizione amplificazione che mantiene rapporti di trascrizione endogena. Descriviamo un metodo di amplificazione lineare doppia che utilizza identificatori univoci molecola (UNMIS) per generare singoli mRNA conteggi. Due turni di risultati di amplificazione in un elevato grado di rilevazione del gene al singola cella.

Introduzione

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) ha trasformato la trascrittomica studi. Mentre su larga scala singola cellula RNAseq può essere eseguita utilizzando una varietà di tecniche, come le goccioline^1,2, microfluidica³, nanogrids⁴e micropozzetti⁵, maggior parte dei metodi non possono ordinare tipi di cella definita che esprimono codificato geneticamente fluorofori. Per isolare una popolazione di selezionare la cella, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono spesso usata con etichettate celle in una cella singola mo....

Protocollo

Tutte le procedure compreso gli oggetti degli animali sono state approvate da IACUC al Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manuale l'ordinamento dei neuroni di topo fluorescente contrassegnati

1. Tirare il vetro microcapillari (Vedi Tabella materiali) per 10 – 15 µm di diametro uscita mediante un apposito estrattore del capillare con le seguenti impostazioni: calore: 508, pull: vuoto, vel: ora vuoto,: vuoto.
2. Collegare il tubo di 120 – 150 cm flessibile in silicone (~0.8 mm diametro interno) per una siringa filtro 0,2 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana e una valvola bidirezion....

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, GABAergici neuroni erano manualmente ordinati (Figura 1) e RNA è stato amplificato, poi trasformato in una libreria di cDNA (Figura 2) ed ordinato a elevata profondità⁸. I prodotti amplificati di RNA (aRNA) ha variato fra 200 – 4.000 bp in dimensioni, con una distribuzione di picco leggermente di sopra di 500 bp (Figura 3A). L.......

Discussione

Il manuale di protocollo di ordinamento è adatto per un supervisione sequenziamento di RNA del neurone popolazioni che sono sia scarsamente etichettati nel cervello di topi o rappresentano una popolazione di cellule rari che altrimenti non è fattibile per studiare mediante cella di alto-rendimento corrente metodi di ordinamento e di amplificazione. Cellule sottoposte a FACS solitamente subiscono pressioni di linea guaina e campione nella gamma di psi ~ 9 – 14, a seconda delle dimensioni dell'ugello e desiderato tassi di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Inibitore ribonucleasi ricombinante	Thermo Fisher	Cat# 10777019
tampone di frammentazione dell'RNA	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Fosfatasi antartica	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide chinasi	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligasi2, troncato	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp perline magnetiche	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect selezione dimensione perline magnetiche	Thermo Fisher	Cat # B23317
DL-AP5	Tocris	Cat # 0105
CNQX	Tocris	Cat # 1045
TTX	Tocris	Cat # 1078
Proteasi da Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat # P5147
Messaggio Amp II kit	Thermo Fisher	Cat # AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalizzatore RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalizzatore Chip DNA ad alta sensibilità	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalizzatore 2100	Agilent
Microscopio di dissezione con fluorescenza e illuminazione a campo chiaro con ottica DIC. (Modello Leica MZ-16F).	Leica	Modello MZ-16F
Microcapillare in vetro: tubi capillari in borosilicato 500/conf. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, parete= 0,21 mm, lunghezza= 150 mm.	Warner instruments	Modello GC100-15, Ordine# 30-0017
Estrattore per pipette capillari	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Unità di raffreddamento tissutale Vibratome	Thermo Microm	CU 65