Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

Summary

Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.

Abstract

Per simulare l'infezione da Cryptococcus, l'ameba, che è il predatore naturale delle cellule criptococcali nell'ambiente, può essere utilizzato come modello per i macrofagi. Questo organismo predatorio, simile ai macrofagi, utilizza la fagocitosi per uccidere le cellule interiorizzate. Con l'aiuto di un microscopio a scansione laser confocale, vengono catturate immagini che raffigurano momenti interattivi tra cellule criptococcali e ameba. La potenza di risoluzione del microscopio elettronico aiuta anche a rivelare il dettaglio ultrastrutturale delle cellule criptococcali quando intrappolate all'interno del vacuole alimentare ameba. Poiché la fagocitosi è un processo continuo, i dati quantitativi vengono quindi integrati nell'analisi per spiegare cosa accade nel momento in cui un'immagine viene acquisita. Per essere specifici, le unità di fluorescenza relativa vengono lette al fine di quantificare l'efficienza dell'ameba nell'internalizzare le cellule criptococcali. A questo scopo, le cellule criptococcali sono macchiate con un coloranti che le fa fluorescenza una volta intrappolate all'interno dell'ambiente acido del vacuole alimentare. Se usate insieme, le informazioni raccolte attraverso tali tecniche possono fornire informazioni critiche per aiutare a trarre conclusioni sul comportamento e sul destino delle cellule quando vengono interiorizzate da ameba e, eventualmente, da altre cellule fagocitiche.

Introduction

I microbi si sono evoluti nel tempo per occupare e prosperare in diverse nicchie ecologiche come i confini fisici aperti del suolo e dell'acqua, tra gli altri¹. In queste nicchie, i microbi spesso si impegnano nella competizione diretta per risorse limitate; importante, per i nutrienti che usano per sostenere la loro crescita o lo spazio, che hanno bisogno di ospitare la popolazione in espansione^2,3. In alcuni casi, alcuni organismi olozoici come l'ameba possono anche precedere le cellule criptococcali come un modo per estrarre sostanze nutritive dalla loro biomassa⁴

Protocol

I neoforman di Cryptococcus e alcuni ceppi di Acanthamoeba castellanii sono considerati patogeni di livello di biosicurezza-2 (BSL-2); pertanto, i ricercatori devono prendere le dovute precauzioni quando lavorano con questi organismi. Ad esempio, il personale di laboratorio deve disporre di attrezzature di formazione e protezione personale specifiche (PPE) come camici da laboratorio, guanti e protezione degli occhi. Un armadio di sicurezza biologica (livello 2) deve essere utilizzato per le procedure che possono causare l'infezione¹⁴.

1. Coltivazione e standardizzazione delle cellule fungine (modifica....

Results

I microbi sono organismi microscopici che non possono essere percepiti ad occhio nudo. Tuttavia, il loro impatto può provocare malattie clinicamente evidenti osservabili, come le infezioni cutanee. Quando si studiano alcuni aspetti dei microbi, che vanno dalla loro morfologia, sottoprodotti e interazioni, essere in grado di fornire prove pittoriche e video è della massima importanza.

Per prima cosa abbiamo cercato di visualizzar.......

Discussion

Nel documento, diverse tecniche sono state impiegate con successo per rivelare il possibile risultato che può sorgere quando l'ameba interagisce con le cellule criptococcali. Inoltre, eravamo interessati a mostrare gli effetti degli acidi grassi 3-idrossici sul risultato delle interazioni Cryptococcus-amoeba.

La prima tecnica utilizzata è stata la microscopia confocale, che ha reso le immagini fisse. Il principale inconveniente di questa tecnica è stato che ci ha fornito solo informaz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabiciclo-[2.2.2]-ottano	Sigma-Aldrich	D27802-1.5-mL
provetta di plastica	Thermo Fisher Scientific	69715-15-mL
Provetta da centrifuga	Thermo Fisher Scientific
7252018-50-mL Provetta da centrifuga	Thermo Fisher Scientific Vetrino	camera a	1132017-8
pozzetti	Thermo Fisher Scientific		1109650-Acetone
	Merck
SAAR1022040LC-Amoeba ceppo	ATCCOgrave;	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCOgrave;	712TM	Ameba medium
Piastra per microtitolazione nera a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific		152089-Centrifuga
	Hermle	-	-
Cloroformio	Sigma-Aldrich	C2432-Microscopio
confocale	Nikon	Nikon TE 2000-Resina
epossidica:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221 resina	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-dimetilamminoetanolo)	[4] ALS	[4] R1067-Isotiocianato
fluoresceina	Sigma-Aldrich	F4274-Acido
formico	Sigma-Aldrich	489441-Fluoroskan
Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Lettore di micropiastre
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-Glutaraldeide
	ALS	R1009	-
Emocitometro	Boeco	-	-
Citrato di piombo	ALS	R1209-Spettrometro
massa per cromatografia liquida	Thermo Fisher	Scientific-Metanolo
	Sigma-Aldrich	R 34.860-Agitatore
orbitale	Lasec	-	-
Tetrossido di osmio	ALS	R1015-pHrodo
Zymosan verde A BioParticles	Life Technologies	P35365	Questo è il colorante sensibile al pH
Soluzione tampone fisiologica	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Agitatore
rotante	Labcon	-	-
Tampone fosfato di sodio:
[1] ortofosfato di idrogeno disodico diidrato	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] sodio di-idrogeno ortofosfato diidrato	[2] Merck	[2] 106345
Microscopio elettronico a trasmissione	Philips	Philips EM 100	-
Blu di tripano	Sigma-Aldrich	T8154-Ultramicrotome
	Leica	EM UC7-Acetato
uranile	ALS	R1260A-Essiccatore
sottovuoto	Lasec	-	-
Fiala	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec	239210-YPD
agar	Sigma-Aldrich	Y-1500	-