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Articolo metodologico

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

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DOI:

10.3791/58698

⸱

22 giugno 2019

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

In questo articolo

Sommario

Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.

Abstract

Per simulare l'infezione da Cryptococcus, l'ameba, che è il predatore naturale delle cellule criptococcali nell'ambiente, può essere utilizzato come modello per i macrofagi. Questo organismo predatorio, simile ai macrofagi, utilizza la fagocitosi per uccidere le cellule interiorizzate. Con l'aiuto di un microscopio a scansione laser confocale, vengono catturate immagini che raffigurano momenti interattivi tra cellule criptococcali e ameba. La potenza di risoluzione del microscopio elettronico aiuta anche a rivelare il dettaglio ultrastrutturale delle cellule criptococcali quando intrappolate all'interno del vacuole alimentare ameba. Poiché la fagocitosi è un processo continuo, i dati quantitativi vengono quindi integrati nell'analisi per spiegare cosa accade nel momento in cui un'immagine viene acquisita. Per essere specifici, le unità di fluorescenza relativa vengono lette al fine di quantificare l'efficienza dell'ameba nell'internalizzare le cellule criptococcali. A questo scopo, le cellule criptococcali sono macchiate con un coloranti che le fa fluorescenza una volta intrappolate all'interno dell'ambiente acido del vacuole alimentare. Se usate insieme, le informazioni raccolte attraverso tali tecniche possono fornire informazioni critiche per aiutare a trarre conclusioni sul comportamento e sul destino delle cellule quando vengono interiorizzate da ameba e, eventualmente, da altre cellule fagocitiche.

Introduzione

I microbi si sono evoluti nel tempo per occupare e prosperare in diverse nicchie ecologiche come i confini fisici aperti del suolo e dell'acqua, tra gli altri1. In queste nicchie, i microbi spesso si impegnano nella competizione diretta per risorse limitate; importante, per i nutrienti che usano per sostenere la loro crescita o lo spazio, che hanno bisogno di ospitare la popolazione in espansione2,3. In alcuni casi, alcuni organismi olozoici come l'ameba possono anche precedere le cellule criptococcali come un modo per estrarre sostanze nutritive dalla loro biomassa4,5. A sua volta, questo permette a tali organismi di stabilire il dominio territoriale attraverso il controllo del numero di popolazione della sua preda. A causa di questa pressione predatoria, alcune prede possono essere selezionate per produrre fattori microbici, come la capsula criptococcale6, per riconciliare gli effetti negativi della pressione. Tuttavia, come conseguenza involontaria di questa pressione, alcuni microbi acquisiscono fattori che permettono loro di attraversare la barriera delle specie e cercare nuove nicchie per colonizzare7, come gli spazi confinati del corpo umano che sono ricchi di sostanze nutritive e hanno l'ideale Condizioni. Quest'ultimo può spiegare come un microbo terrestre come Cryptococcus (C.) i neoforman possono trasformarsi per diventare patogeni.

A tal fine, è importante studiare il contatto iniziale che le cellule criptococcali possono avere con ameba e come questo può selezionarli per diventare patogeni. Più specificamente, Questo può dare indizi su come le cellule criptococcali si comportano quando agito su macrofagi durante l'infezione. È per questo motivo che l'ameba è stata scelta come modello per i macrofagi qui, in quanto è relativamente economico e facile mantenere una cultura dell'ameba in un laboratorio8. Di interesse era anche quello di esaminare come i metaboliti secondari criptococcali viz. 3-idrossici acidi grassi9,10 influenzano l'interazione tra amebe e cellule criptococcali.

Un modo semplice per percepire l'interazione tra ameba e la sua preda ad occhio nudo è quello di creare un prato utilizzando la sua preda sulla superficie di un piatto di agar e avvistare l'ameba. La visualizzazione di placche o zone chiare sulla piastra di agar raffigura aree in cui l'ameba può essersi nutrita della sua preda. Tuttavia, a questo macro livello, si nota solo l'esito del processo e il processo di fagocitosi è meccanizzato non può essere osservato. Pertanto, per apprezzare il processo da cellula a cellula, ci sono diversi metodi microscopici che possono essere utilizzati11,12. Ad esempio, un microscopio invertito con una camera di incubazione può essere utilizzato per registrare video di eventi tra una cellula fagocitica e il suo obiettivo13. Purtroppo, a causa del costo di un microscopio con una funzionalità time-lapse, non è sempre possibile per i laboratori acquistare un tale microscopio, soprattutto nelle impostazioni di scarso spazio.

Per aggirare la limitazione di cui sopra, questo studio presenta un disegno esplorativo sequenziale che valuta l'interazione di C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . In primo luogo, viene utilizzato un metodo qualitativo che precede un metodo quantitativo. Le immagini fisse vengono catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito, così come un microscopio elettronico di trasmissione per rappresentare le interazioni ameba-Cryptococcus. Questo è stato seguito dalla quantificazione della fluorescenza utilizzando un lettore di lamiere per stimare l'efficienza dell'ameba per internalizzare le cellule criptococcali. Quando si riconciliano i risultati di questi metodi durante la fase di interpretazione dei dati, ciò può rivelare anche tutte le informazioni critiche come l'utilizzo di un video time-lapse di fagocitosi.

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Protocollo

I neoforman di Cryptococcus e alcuni ceppi di Acanthamoeba castellanii sono considerati patogeni di livello di biosicurezza-2 (BSL-2); pertanto, i ricercatori devono prendere le dovute precauzioni quando lavorano con questi organismi. Ad esempio, il personale di laboratorio deve disporre di attrezzature di formazione e protezione personale specifiche (PPE) come camici da laboratorio, guanti e protezione degli occhi. Un armadio di sicurezza biologica (livello 2) deve essere utilizzato per le procedure che possono causare l'infezione14.

1. Coltivazione e standardizzazione delle cellule fungine (modificata da Madu et al. 15 )

  1. Streak fuori i ceppi fungini di prova (cioè, C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046) da colture stock (non più vecchie di 9 mesi) su piastre di lievito-peptone-dextrose (YPD). Le informazioni sugli ingredienti di YPD agar sono riportate nella Tabella 1.
    NOTA: C. neoformans UOFS Y-1378 ha dimostrato di produrre acidi grassi 3-idrossidi, mentre C. neoformans LMPE 046 non produce acidi grassi 3-idrossisci. Fare riferimento al file supplementare 1 per informazioni su come viene determinata la presenza di queste molecole.
  2. Incubare le piastre di agar per 48 h a 30 .
    NOTA: Una piastra può essere conservata per un massimo di 2 mesi a 4 gradi centigradi prima di poter essere scartata o utilizzata per fare una coltura stock16.
  3. Raschiare un loop di cellule criptococcali(C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046) dalla piastra di 48 h-old e inoculate in un pallone connico da 250 mL contenente 100 mL del brodo YNB (6,7 g/L) chimicamente definito integrato con il 4% ( w/v) glucosio. Le informazioni sugli ingredienti del brodo YNB sono riportate nella tabella 2.
  4. Incubare i flaconi a 30 gradi centigradi per 24 h mentre si agita a 160 giri/min su uno shaker rotativo.
  5. Dopo un periodo di incubazione di 24 h, contare le cellule fungine utilizzando un emocitometro e regolare il numero di cellulare a 1 x 106 cellule / mL con PBS a pH 7.4.
    NOTA: l'inoculum Di C. neoformans preparato UOFS Y-1378 è stato utilizzato nei passaggi 3.1 e 3.2, mentre C. neoformans LMPE 046 inoculum è stato utilizzato solo nel passaggio 3.2.

2. Coltivazione e standardizzazione delle cellule di ameba (modificate da Madu et al. 15 )

  1. Scongelare una cultura stock di Acanthamoeba castellanii e portarla a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Amoeba è stata preparata sulla base dei protocolli modificati di Axelsson-Olsson et al.8 e Schuster17.
  2. Pipetta 1 mL della coltura scongelata e inocularla in un tubo centrifuga tollente da 50 mL contenente 15 mL di MEDIA ATCC 712. Le informazioni sugli ingredienti medi di ATCC 712 sono riportate nella tabella 3.
  3. Agitare delicatamente e immediatamente centrifugare per 5 min a 400 x g e 30 gradi centigradi.
  4. Aspirare il super-attuoso.
  5. Risospendere le cellule in 15 mL del mezzo ATCC 712 e incubare il tubo a 30 gradi centigradi per 14 giorni.
    NOTA: Controllare periodicamente le cellule, utilizzando un semplice microscopio luminoso, per determinare se sono in uno stato di trofozoite. Una volta che sono in uno stato di trofozoite, iniziare una nuova cultura.
  6. Pipetta 1 mL da una coltura che mostra le cellule in uno stato di trofozoite e usarlo per inoculare un tubo di centrifugatura sterile 50 mL contenente 15 mL di fresco, sterile ATCC medio 712.
  7. Incubare il tubo a 30 gradi centigradi per 1 settimana mentre si agita a 160 giri/min su uno shaker rotante.
  8. Dopo una settimana, contare le cellule amebe utilizzando un emocitometro e regolare il numero di cellulare a 1 x 107 cellule / mL con fresco, sterile ATCC medio 712.
  9. Esegui un saggio di fattibilità utilizzando una macchia blu trypan come descritto da Strober18. Procedere ulteriormente con le culture che mostrano almeno l'80% di fattibilità.

3. Colorazione fluorescenza delle cellule per studiare la fagocitosi (modificata da Madu et al. 15 )

  1. Raccolta di dati qualitativi attraverso l'uso del microscopio a fluorescenza
    NOTA: Esegui questo test con Acanthamoeba castellanii e C. neoformans UOFS Y-1378.
    1. Distribuisci una sospensione di 200 gradi di amebe standardizzate (1 x 107 cellule/mL nel mezzo ATCC 712) in pozze di scorrimento aderente e incuba per 2 h a 30 gradi per le cellule per aderire alla superficie.
    2. Mentre le cellule di ameba si stanno assediando per aderire, macchiare le cellule standardizzate C. neoformans UOFS Y-1378 che sono state regolate a 1 x 106 cellule / mL (in 999 l di PBS) con 1 l of fluorescein isothiocyanate in un tubo di plastica da 1,5 mL.
      NOTA: Preparare la macchia sciogliendo 1 mg di isotoniocianato da fluoresceina in 1 mL di acetone.
    3. Agitare delicatamente le cellule C. neoformans UOFS Y-1378 su uno shaker orbitale fissato a 50 rpm per 2 h a RT e al buio.
    4. Dopo 2 h, centrifugare a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pelletare le cellule.
    5. Aspirare il supernatante per rimuovere il PBS con la macchia.
    6. Aggiungere 1 mL di PBS al tubo per lavare il pellet cellulare. Lavare le cellule pipettando delicatamente.
    7. Centrifugare le cellule a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
    8. Risospendere le cellule lavate in 1 mL di PBS.
    9. Distribuisci una sospensione di 200 gradi delle cellule colorate C. neoformans UOFS Y-1378 in pozzi da camera contenenti le cellule di ameba non colorate.
    10. Incubare la co-cultura preparata a 30 gradi centigradi per un ulteriore periodo di 2 ore.
      NOTA: La co-cultura può essere incubata per diversi punti temporali per soddisfare lo scopo dell'esperimento.
    11. Alla fine del periodo di co-incubazione, aspirare il contenuto dei pozzi.
    12. Aggiungere 300 l di PBS ai pozze per lavare i pozze da camera e rimuovere eventuali celle cocoltivate non legate. Fatelo con un dolce pipettaggio. Aspirare il contenuto dei pozzi. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
    13. Preparare la soluzione di glutaraldeide 3% aggiungendo 3 mL di glutaraldeide a 97 mL di acqua distillata.
    14. Fissare le cellule co-coltivate aggiungendo 250 luna di soluzione del 3% ai pozze della camera e incubando per 1 h.
    15. Aspirare il fissativo e lavare i pozzi della camera come dettagliato dal passaggio 3.1.13.
    16. Smontare i pozze da camera utilizzando uno strumento che è stato fornito con i vetrini della camera.
    17. Aggiungere una goccia del composto anti-dissolvenza, 1,4-diazabicyclo-[2.2.2]-octane alla diapositiva per evitare lo sbiancamento automatico. Coprire con un coperchio e sigillare i lati con uno smalto per evitare l'evaporazione.
    18. Visualizza le cellule co-coltivate usando l'obiettivo 100x (con olio) di un microscopio a scansione laser confocale.
      NOTA: È importante scattare foto in campo luminoso e fluorescenza per visualizzare l'interazione tra ameba e cellule criptococcali. Ove possibile, la fluorescenza può essere sovraimposta alle immagini a campo luminoso. Le cellule di ameba hanno in genere dimensioni maggiori (cioè 45-60 m), e le cellule trofozoite hanno una forma irregolare. Le cellule criptococcio hanno un diametro di 5-10 m e hanno una forma da globose a ovoide. Quando sono esposte a un laser, è possibile che le cellule amebe instaine possano emettere auto-fluorescenza. Fare riferimento a Beisker e Dolbeare19 e Clancy e Cauller20 per i metodi per ridurre l'autofluorescenza.
  2. Acquisizione di dati quantitativi tramite l'uso del lettore di lastre a fluorescenza
    NOTA: Eseguire questo test con Acanthamoeba castellanii e C. neoformans UOFS Y-1378 o C. neoformans LMPE 046.
    1. Eroga una sospensione da 100 litri di amebe standardizzata (regolata a 1 x 107 cellule/mL nel mezzo ATCC 712) in una piastra nera aderente 96 well microtiter.
    2. Incubare la piastra per 2 h a 30 s per consentire alle cellule di ameba di aderire alla superficie.
    3. Mentre le cellule di ameba si stanno assediando per aderire, macchiare le cellule standardizzate C. neoformans UOFS Y-1378 che sono state regolate a 1 x 106 cellule / mL (in 999 l l di PBS) con 1 l of pHrodo Green zemosan A BioParticles in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml. Macchie C. neoformans LMPE 046 cellule e in un tubo separato.
      NOTA: Il coloranti, a differenza del FITC, macchia selettivamente le cellule che sono intrappolate all'interno dell'ambiente acido di una cellula fagocitica21,22. Per questa tecnica, è importante mantenere le cellule criptocococcali in un mezzo con un pH neutro (PBS) e un'ameba in un mezzo con un pH neutro (ATCC medium 712). Un mezzo con un ambiente acido si tradurrà in una lettura falsa positiva delle unità di fluorescenza relative, il che implica che un maggior numero di criptococcali sono stati internalizzati.
    4. Agitare delicatamente le cellule criptococcali su uno shaker orbitale fissato a 50 rpm per 2 h a RT e al buio.
    5. Dopo 2 h, centrificare il tubo di microcentrifuga a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pelletare le cellule. Aspirare il supernatante per rimuovere PBS con la macchia.
    6. Aggiungere 1 mL di PBS al tubo per lavare le cellule pellete. Lavare le cellule con una leggera pipettatura.
    7. Centrifugare le cellule a 960 x g per 5 min a 30 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta.
    8. Risospendere il pellet delle cellule lavate in 1 mL di PBS.
    9. Distribuisci una sospensione di 100 gradi di sospensione delle cellule criptococcali macchiate in pozzi contenenti cellule ameba non colorate.
    10. Incubare la co-cultura preparata a 30 gradi centigradi per un ulteriore periodo di 2 ore.
      NOTA: La co-cultura può essere incubata per diversi tempi per soddisfare lo scopo dell'esperimento.
    11. Alla fine del periodo di co-incubazione, misurare la fluorescenza su un lettore di microplacino. Convertire i segnali logaritmici in unità di fluorescenza relative.
      NOTA: l'eccitazione del tinri è a 492 nm e l'emissione è a 538 nm. Consulta Beisker e Dolbeare19 e Clancy e Cauller20 per metodi per ridurre l'autofluorescenza.

4. Uso della microscopia elettronica a trasmissione per studiare la fagocitosi (modificato da van Wyk e Wingfield 23 )

  1. Aggiungere una sospensione di 5 mL di amebae (regolata a 1 x 107 celle / mL in ATCC medio 712) a un tubo di centrifuga di 15 mL e consentire loro di accontentarsi di 30 min a 30 .
  2. Aggiungere una sospensione di 5 mL delle cellule UOFS Y-1378 di C. neoformans (regolate a 1 x 106 cellule/ mL in PBS) allo stesso tubo centrifuga che contiene 5 mL di cellule amebe standardizzate.
  3. Lasciare il tubo riposare per 2 h a 30 gradi centigradi.
  4. Centrifugare il tubo a 640 x g per 3 min a 30 gradi centigradi per pellet aree reflue le cellule co-coltivate. Aspirare il super-attuoso. Non lavare le cellule cocoltivate.
  5. Fissare le cellule co-coltivate rispendendo il pellet in 3 mL di 1,0 M (pH - 7,0) di sodio bufferizzato 3% glutaraldeide per 3 h.
  6. Centrifugare il tubo a 1.120 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pellet aree celle co-coltivate. Aspirare il super-attuoso.
  7. Aggiungere 5 mL di tampone di fosfato al tubo centrifuga per lavare le cellule pellete. Lavare con delicatamente il contenuto del tubo per 20 s.
  8. Centrifugare il tubo a 1.120 x g per 5 min a 30 gradi centigradi per pellet aree celle co-coltivate.
  9. Ripetere i passaggi da 4.8 a 4.10. Aspirare il super-attuoso.
  10. Fissare nuovamente le cellule co-coltivate risuspendendo il pellet in 3 mL di 1,0 M (pH - 7,0) di fosforo bufferizzato 1% tetrossido di osmio per 1,5 h.
  11. Rimuovere il fissativo (osmio tetrossido) lavando le cellule co-coltivate in modo simile alla rimozione del 3% di glutaraldeide.
  12. Disidratare il materiale TEM (noto anche come cellule co-coltivate) in un acetoneserie di grado del 30%, 50%, 70%, 95% e due cambi del 100% per 15 min ciascuno, rispettivamente. Per farlo, aggiungere 3 mL della soluzione di acetone alle celle pellete e lasciarlo riposare per 15 min. Quindi, centrifugare a 200 x g per 10 min a RT Scartare il supernatante e aggiungere la più alta percentuale della soluzione di acetone.
  13. Preparare la resina epossidica della normale consistenza secondo il protocollo di Spur24.
    NOTA: la resina epossidica viene utilizzata per la sezionamento.
  14. Incorporare il materiale TEM nella resina epossidica appena preparata. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura.
    1. Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata a un tubo contenente il materiale TEM risospeso in 3 mL di soluzione 100% di acetone. Lasciare riposare il tubo per 1 ora.
    2. Centrifugare il tubo a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirare la soluzione epossidica-acetone.
    3. Aggiungere 6 mL della resina esinae appena preparata al pellet nel tubo. Lasciare riposare il tubo per 1 ora.
    4. Centrifuga a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirate tutta la soluzione epossidica-acetone.
    5. Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata al tubo. Lasciare riposare il tubo per 8 ore.
    6. Centrifuga a 200 x g per 10 min a 30 gradi centigradi. Aspirati tutta la soluzione epossidica
    7. Aggiungere 3 mL della resina epossidica appena preparata al tubo. Conservare il materiale TEM nella soluzione epossidica durante la notte in un desiccatore sottovuoto.
      AVVISO: La resina epossidica è un materiale radioattivo. Utilizzare PPE per gestire la resina epossidica. La resina epossidica deve essere maneggiata anche in un cofano di fumi. I ricercatori devono seguire le norme di sicurezza per lo scarto di tale materiale come specificato da ogni paese25.
  15. Polimerizzare il materiale TEM per 8 h a 70 gradi centigradi.
  16. Sull'ultramicrotome, tagliare piccole sezioni di circa 0,1 mm x 0,1 mm e 60 nm di spessore dal materiale epossidico-incorporato con un coltello in vetro montato. Assemblare sezioni su una griglia e posizionare le griglie in una scatola portante del campione TEM prima di colorare.
  17. Macchia le sezioni con una goccia del 6% di acetato di uranilo per 10 min al buio. Assicurarsi che le sezioni siano completamente coperte.
    NOTA: Ricostituire la macchia (6 g) in 100 mL di acqua distillata.
    AVVISO: L'acetato di urane è un materiale radioattivo. Utilizzare PPE per gestire l'acetato di uranilo. L'acetato di uranilo deve essere maneggiato anche in una cappa di fumi. I ricercatori devono seguire le norme di sicurezza per lo scarto di tale materiale come specificato da ogni paese25.
  18. Risciacquare le sezioni immergendole cinque volte in un becher contenente 100 mL di acqua distillata.
    NOTA: L'acqua distillata deve essere smaltita di conseguenza in quanto contiene tracce di acetato di uranilo.
  19. Macchiare la sezione con una goccia di citrato di piombo per 10 min al buio. Assicurarsi che le sezioni siano completamente coperte.
    NOTA: il citrato di piombo deve essere preparato secondo il protocollo da Reynold26.
  20. Risciacquare le sezioni immergendole cinque volte in un becher contenente 100 mL di acqua distillata.
  21. Assemblare singolarmente le griglie con sezioni colorate su una scatola portacampioni TEM.
  22. Visualizzare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione.

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Risultati

I microbi sono organismi microscopici che non possono essere percepiti ad occhio nudo. Tuttavia, il loro impatto può provocare malattie clinicamente evidenti osservabili, come le infezioni cutanee. Quando si studiano alcuni aspetti dei microbi, che vanno dalla loro morfologia, sottoprodotti e interazioni, essere in grado di fornire prove pittoriche e video è della massima importanza.

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Discussione

Nel documento, diverse tecniche sono state impiegate con successo per rivelare il possibile risultato che può sorgere quando l'ameba interagisce con le cellule criptococcali. Inoltre, eravamo interessati a mostrare gli effetti degli acidi grassi 3-idrossici sul risultato delle interazioni Cryptococcus-amoeba.

La prima tecnica utilizzata è stata la microscopia confocale, che ha reso le immagini fisse. Il principale inconveniente di questa tecnica è stato che ci ha fornito solo informaz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Research Foundation of South Africa (numero di sovvenzione: UID 87903) e dell'Università dello Stato Libero. Siamo anche grati ai servizi e all'assistenza offerti da Pieter van Wyk e Hanlie Grobler durante i nostri studi di microscopia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,4-Diazabiciclo-[2.2.2]-ottanoSigma-AldrichD27802-1.5-mL
provetta di plastica Thermo Fisher Scientific69715-15-mL
Provetta da centrifuga Thermo Fisher Scientific
7252018-50-mL Provetta da centrifuga Thermo Fisher Scientific Vetrinocamera a1132017-8
pozzettiThermo Fisher Scientific1109650-Acetone
Merck
SAAR1022040LC-Amoeba ceppoATCCOgrave; 30234TM-
ATCC medium 712ATCCOgrave; 712TMAmeba medium
Piastra per microtitolazione nera a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific152089-Centrifuga
Hermle--
CloroformioSigma-AldrichC2432-Microscopio
confocaleNikonNikon TE 2000-Resina
epossidica:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221 resina[3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimetilamminoetanolo)[4] ALS [4] R1067-Isotiocianato
fluoresceinaSigma-AldrichF4274-Acido
formicoSigma-Aldrich489441-Fluoroskan
Ascent FLThermo Fisher Scientific374-91038CLettore di micropiastre
GlucosioSigma-AldrichG8270-Glutaraldeide
ALSR1009-
EmocitometroBoeco--
Citrato di piomboALSR1209-Spettrometro
massa per cromatografia liquidaThermo FisherScientific-Metanolo
Sigma-AldrichR 34.860-Agitatore
orbitaleLasec --
Tetrossido di osmioALSR1015-pHrodo
Zymosan verde A BioParticlesLife TechnologiesP35365Questo è il colorante sensibile al pH
Soluzione tampone fisiologicaSigma-AldrichP4417-50TAB-Agitatore
rotanteLabcon--
Tampone fosfato di sodio:
[1] ortofosfato di idrogeno disodico diidrato [1] Merck[1] 106580-
[2] sodio di-idrogeno ortofosfato diidrato[2] Merck [2] 106345
Microscopio elettronico a trasmissionePhilipsPhilips EM 100 -
Blu di tripano Sigma-AldrichT8154-Ultramicrotome
LeicaEM UC7-Acetato
uranileALSR1260A-Essiccatore
sottovuotoLasec --
FialaSigma-Aldrich29651-U-YNB
Lasec 239210-YPD
agarSigma-AldrichY-1500-
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Riferimenti

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