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Articolo metodologico

Un saggio di trasporto Rhodopsin dall'analisi di Imaging ad alto contenuto

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DOI:

10.3791/58703

⸱

16 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un'analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d'onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.

Abstract

Rodopsina misfolding di proteine mutazioni portano a morte dei fotorecettori asta che si manifesta come pigmentosa dominante autosomal di retinite (RP), una progressiva accecante malattia che manca di un trattamento efficace. Supponiamo che la citotossicità del mutante misfolded rodopsina possa essere alleviata stabilizzando farmacologicamente la proteina mutante rodopsina. La mutazione di P23H, tra le altre mutazioni di rodopsina di classe II, codifica per una proteina mutante di rodopsina strutturalmente instabile che viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER), considerando che la rodopsina wild-type viene trasportata alla membrana plasmatica in mammiferi cellule. Precedentemente abbiamo effettuato una schermata di alto-rendimento basata su luminescenza (HTS) ed abbiamo identificato un gruppo di chaperoni farmacologici che hanno salvato il trasporto della rodopsina P23H da ER alla membrana plasmatica. Qui, utilizzando un metodo di immunostaining seguito da un'analisi di imaging ad alto contenuto, abbiamo quantificato la quantità di proteina mutante rodopsina in tutta la cella e sulla membrana plasmatica. Questo metodo è informativo ed efficace per identificare i veri successi da falsi positivi dopo HTS Inoltre, l'analisi di immagine ad alto contenuto permesso di quantificare i parametri multipli da un singolo esperimento per valutare le proprietà farmacologiche di ogni composto. Usando questa analisi, abbiamo analizzato l'effetto di 11 diversi composti verso sei mutanti di rodopsina RP associati, ottenendo un profilo farmacologico 2-D per una comprensione quantitativa e qualitativa circa la stabilità strutturale di questi mutanti di rodopsina e l'efficacia di diversi composti verso questi mutanti.

Introduzione

Misfolding proteico è coinvolto nella distrofia muscolare, degenerazioni neurale, come pure malattie accecante, compresa la retinite pigmentosa (RP)1. RP è una degenerazione retinica ereditaria e progressiva associata a mutazioni in oltre 60 geni che influenzano la funzione e omeostasi dei fotoricettori dell'asta o l'epitelio pigmentato retinico (RPEs)2,3. Nessun trattamento efficace è attualmente disponibile per RP. Le mutazioni di rhodopsin rappresentano circa il 25-30% di autosomica dominante (ad) casi RP. Tra le mutazioni più di 150 del rhodopsin 4 i (Human Gene mutazione Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), le mutazioni di classe II causano l'instabilità strutturale della proteina rhodopsin che contribuisce alla morte dei fotorecettori rod e visione perdita5,6,7,8. Il P23H è la mutazione più frequente di rodopsina in Nord America, che è anche un tipico esempio della classe II rodopsina mutazioni9,10. A causa della sua intrinseca instabilità strutturale, la rodopsina misfolded viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER) in cellule di mammifero, considerando che la rodopsina wild-type si trova sulla membrana plasmatica5. La rodopsina misfolded P23H Mostre mutante dominante citotossicità negativa che non è dovuto l'aploinsufficienza, ma è relativo all'attivazione di ER associati via di degradazione proteica e l'organizzazione del segmento esterno asta interrotta. Per alleviare stress cellulare di asta del fotoricettore, una strategia è quello di stabilizzare la piegatura nativo della rodopsina mutante usando un chaperone farmacologico.

Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo effettuato un basati su cellule di schermo di alto-rendimento (intasamento)11,12,13 usando un'analisi di complementazione frammento di β-galattosidasi per quantificare il mutante di rodopsina P23H trasportato sul plasma membrana. Il protocollo semplice e robusto di questo test HTS permesso di esplorare le attività di circa 79.000 piccole molecole per ogni schermo. Tuttavia, poiché questo test HTS legge segnali di luminescenza, falsi positivi, tra cui gli inibitori β-gallone, composti colorati o citotossici sono inclusi nella lista di colpo in attesa di essere identificato da un'analisi secondaria.

Il tradizionale immunostaining e metodi di formazione immagine di fluorescenza sono stati utilizzati per anni per studiare il trasporto di rodopsina in cellule di mammiferi5,14,15,16. Tuttavia, questi metodi convenzionali non possono essere utilizzati per quantificare gli effetti farmacologici di più di 10 composti verso trasporto rodopsina, perché un'analisi di imaging affidabile richiede un gran numero di immagini scattate in una condizione altamente coerenza, che è non modificabile dai metodi convenzionali di formazione immagine. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo di imaging ad alto contenuto di immunostaining basato come un'analisi secondaria per quantificare il trasporto su superficie delle cellule di rodopsina misfolded mutanti11,13,17. Per assegnare un'etichetta rodopsina sulla membrana plasmatica, abbiamo saltato il passo di permeabilizzazione della membrana cellulare e immunostained i mutanti di rodopsina da un monoclonale anti-rodopsina (B6-30), riconoscendo l'epitopo del N-terminale della rodopsina sul lato extracellulare della cella membrana18. Per visualizzare la rodopsina mutante in tutta la cella, abbiamo fuso rodopsina con la proteina di fluorescenza di Venus. La quantificazione delle intensità di fluorescenza in canali diversi di fluorescenza, siamo in grado di ottenere parametri multipli da un singolo esperimento tra cui l'intensità totale rodopsina in tutta la cella, sulla superficie delle cellule e il rapporto di fluorescenza di rodopsina sulla superficie delle cellule che in tutta la cella. Applicare questo metodo per stabile di cellule che esprimono un totale di sei mutanti misfolded rodopsina, possiamo generare un profilo farmacologico della più piccola molecola chaperoni verso questi mutanti. In questo protocollo, tutte le celle sono immunostained in una piastra 384 pozzetti e imaging utilizzando un sistema di imaging automatizzato in una condizione di imaging altamente coerenza. Un'analisi delle immagini viene eseguita in ciascun pozzetto, contenente immagini di più di 600 cellule per ridurre la variazione a causa dell'eterogeneità delle cellule con diversi livelli di espressione della proteina e della forma delle cellule. Il flusso di lavoro del presente protocollo è riassunto nella Figura 1. Il vantaggio di questo metodo è che otteniamo immagini ad alta risoluzione, nonché multi-parametro quantificazioni dall'analisi basata su immagini. In generale, questo protocollo può essere modificato e per quantificare il trasporto di qualsiasi proteina di membrana misfolded di interesse.

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Protocollo

Nota: Il rodopsina trasporto dosaggio.

1. preparazione e coltura di cellule

  1. Rilanciare la crioconservazione U2OS stabile cellule che esprimono la wild-type (WT) o proteine di fusione di rodopsina-Venus topo mutante. Scongelare le cellule a 37 ° C fino a quando solo i cristalli di ghiaccio piccolo sono partiti nel flaconcino.
    Nota: Le celle di U2OS vengono utilizzate in questo protocollo, perché c'è nessuna linea di cellule fotorecettrici disponibile per gli studi in vitro e la biosintesi pre-ciliare della rodopsina è regolata dai simili meccanismi molecolari in cellule di mammifero. Inoltre, le cellule di U2OS fissare saldamente alla parte inferiore della piastra e hanno grandi corpi cellulari, quindi sono ideali per il dosaggio di trasporto rodopsina. Sette U2OS stabile le cellule che esprimono il WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L rodopsina mutanti sono utilizzati qui come esempio per mostrare la qualità e l'affidabilità del test. Cellule stabili che esprimono altri mutanti di rhodopsin o altre proteine di membrana possono essere usate, secondo l'obiettivo del test. Stabile cellule esprimenti rodopsina umana possono essere usate per questo test, se disponibile. La rodopsina del mouse è stata usata qui perché mouse e proteine rodopsina umana condividano omologia di 95%, e i composti identificati da questo test sarà testata in vivo utilizzando un modello di topo adRP portando la rodopsina P23H mutazione8. Le cellule stabili sono state generate come descritto in precedenza19. Il WT e trascrizioni di rodopsina mutante sono state quantificate da q-PCR e i cloni di cellule stabili che esprimono livelli simili di WT e trascrizioni di rodopsina mutante sono stati selezionati per questo test. L'espressione di proteine rodopsina è stata confermata da immunoblot e immunostaining. Il passaggio di cellule usato per questo test dovrebbe essere inferiore a 20.
  2. Trasferire ogni riga delle cellule in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di terreno di coltura (alto glucosio Dulbecco modificato dell'Aquila medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 5 µ g/mL Plasmocin).
  3. Centrifugare la provetta a 200 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di medium di crescita cellulare per ogni linea cellulare. Trasferire ogni linea di sospensione cellulare in un piatto di coltura del tessuto di 60 mm e incubare a 37 ° C con 5% CO2.
  4. Sottocultura le cellule quando il piatto di coltura del tessuto raggiunge 90% confluenza come descritto nel riferimento12.

2. cellule alle 5.000 cellule per pozzetto di semina

Nota: Eseguire le procedure seguenti in un cappuccio di coltura del tessuto.

  1. Trattare la lamina con poli-lisina.
    1. Un giorno prima della semina delle cellule, trattare un muro nero e deselezionare piastra 384 pozzetti inferiore con 20 µ l/pozzetto di soluzione di poli-lisina per 30 min.
    2. Aspirare il liquido e lasciare asciugare per 1 h. rimettere il coperchio piatto tutti i pozzetti e memorizzare la piastra a 4 ° C durante la notte per la semina delle cellule.
  2. Preparare la sospensione cellulare.
    1. Fino al 90% confluenza della coltura in ogni linea cellulare in crescita medio in un piatto di coltura del tessuto di 100 mm.
    2. Lavare ogni piatto con tamponato fosfato salino (PBS) e staccare le cellule con 1 mL di 0.05% tripsina a 37 ° C.
    3. Risospendere ogni linea di cellule in 10 mL di medium di analisi (alto-glucosio DMEM con 10% FBS, 100 unità/mL di penicillina e streptomicina 100 μg/mL).
    4. Contare le celle e diluire ogni riga di celle per 1,25 x 105 cellule/mL con il medium di analisi.
  3. Le cellule del seme.
    1. Utilizzare una pipetta elettronica multicanale o un dispenser automatizzati reagente per dispensare 40 µ l/pozzetto della sospensione delle cellule a tre colonne per ogni linea cellulare e colonne 1-21 di riempimento della piastra 384 pozzetti (Figura 2).
    2. Aggiungere 40 µ l/pozzetto di U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) alle colonne 22-23 e 40 µ l/pozzetto di U2OS (Rhodopsin-Venus) alla colonna 24, come controlli.
    3. Centrifugare la piastra a 300 x g per 30 s per far cadere tutte le batterie sul fondo della piastra 384 pozzetti.
      Nota: Evitare urti alla piastra dopo la semina delle cellule. In caso contrario, le cellule saranno schiacciate in un angolo di ciascun pozzetto e la piastra non sarà adatta per l'imaging ad alto contenuto.
    4. Incubare la piastra 384 pozzetti a 37 ° C con 5% CO2 per 3 h per le cellule da fissare alla parte inferiore della piastra.

3. il trattamento delle cellule con composti

  1. Generare una mappa di piastra con condizioni di trattamento come mostrato nella Figura 2.
  2. Preparare 300 µ l di 5 x allestimenti da fino a 15 composti in una piastra a 96 pozzetti.
    1. Diluire 1 a 15 di cps con il medium di analisi per cinque volte di loro concentrazioni finali nei pozzetti A1 a G2 del 96-pozzo piastra (Figura 2A). Aggiungere 300 µ l di medium di analisi ben H2.
      Nota: La concentrazione finale di ciascun composto è utilizzata alla concentrazione più efficace per il salvataggio il trasporto della rodopsina P23H da HTS12,13.
    2. Aggiungere 100 µ l per pozzetto di 2% di dimetilsolfossido (DMSO) e 25 µM 9 -cis-retinale che vengono diluiti in medium di analisi alle colonne 11 e 12, rispettivamente. Aggiungere 9 -cis-retinico in penombra.
  3. Aggiungere 10 µ l di 5 x funzionamento soluzioni alla piastra 384 pozzetti coltivati con le cellule (Figura 2B).
    1. Utilizzare una pipetta elettronica multi-canale per aggiungere composti 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 a riga A, C, E, G, I, K, M e O da colonne 1 a 21 (Figura 2). Aggiungere composti 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e M a righe B, D, F, H, J, L, N e P da 1 a 21 di colonne.
    2. Aggiungere 10 µ l di 2% DMSO alle colonne 22 e 24. Aggiungere 10 µ l per pozzetto di 25 µM 9 -cis-retinico a colonna 23.
      Nota: DMSO è usato come un controllo del veicolo perché tutti i composti sono inizialmente dissolto in DMSO come scorte. Colonna 22 contenente DMSO trattato cellule esprimendo il P23H rodopsina viene utilizzato come il controllo di 0%. 9 -Cis-retiniche cellule trattate esprimendo la rodopsina P23H viene utilizzato come il controllo al 100%.
  4. Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola e incubare la piastra a 37 ° C per 24 h.

4. Immunostaining senza permeabilizzazione della membrana a macchiare Rhodopsin proteine sulla superficie delle cellule.

Nota: Evitare qualsiasi detergente nel processo intero immunostaining per mantenere intatta la membrana cellulare.

  1. Preparare 4% paraformaldeide (PFA) diluendo il 16% PFA con PBS in un rapporto di 1:4 volume in una cappa chimica. Trasferire il 4% PFA in un serbatoio di reagente.
  2. Prendere la piastra 384 pozzetti in una stanza buia con luce fioca rosso. Usare un aspiratore 8 canali collegato ad un recipiente di raccolta vuoto per aspirare delicatamente il mezzo. Utilizzare una pipetta elettronica multicanale per aggiungere 20 µ l di preparate 4% PFA per l'intera piastra 384 pozzetti e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per evitare il distacco delle cellule, sempre scegliere le punte dell'aspiratore stesso lato di ciascun pozzetto durante le aspirazioni. Non toccare l'area inferiore centrale di ciascun pozzetto. Quando si scattano immagini, selezionare i campi da evitare la regione toccata dall'aspiratore. Più di 10 min di incubazioni prolungate, coprire la piastra 384 pozzetti con il suo coperchio per evitare l'evaporazione.
    Nota: Le cellule sono fissate in una stanza buia per evitare photobleaching della isorhodopsin rigenerato che influenzerà il risultato del controllo 100%. Dopo la fissazione, la piastra 384 pozzetti può essere stipulata sotto luce normale.
  3. Utilizzare un aspiratore 8 canali per aspirare il PFA in ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta elettronica multi-canale per aggiungere 50 μL per pozzetto di PBS. Ripetere altre due volte per eseguire tre lavaggi con PBS.
    Attenzione: I rifiuti liquido contenente PFA sono raccolto in una bottiglia con un massimo di ed è essere smaltiti come rifiuti chimici pericolosi dopo l'esperimento.
  4. Bloccare le cellule con l'aggiunta di 20 µ l di siero di capra del 5% per l'intera piastra 384 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Aspirare il siero di 5% capra e aggiungere 15 µ l di 20 µ g mL-1 B6-30 anti-rodopsina anticorpo nel siero di capra 1% a riga A per O. aggiungere 15 µ l di siero di capra 1% alla riga P per il gruppo di controllo solo anticorpo secondario.
  6. Incubare la piastra 384 pozzetti a temperatura ambiente per 90 min o a 4 ° C durante la notte. Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola per evitare photobleaching di fluorophores.
  7. Lavare la piastra 3 volte con 50 µ l per pozzetto di PBS.
  8. Aspirare la PBS e aggiungere 15 µ l di anticorpo IgG anti-topo di 5 µ g mL-1 Cy3-coniugati. Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 1 h o a 4 ° C durante la notte.
  9. Lavare la piastra 3 volte con 50 µ l per pozzetto di PBS. Aggiungere 50 µ l di PBS contenente 1 µ g mL-1 Hoechst 33342 a macchiare i nuclei a temperatura ambiente per 15 min.
  10. Sigillare la piastra 384 pozzetti con una pellicola trasparente prima di formazione immagine. Coprire la piastra 384 pozzetti con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per fino ad una settimana, se le immagini sono prese immediatamente.

5.. di imaging

Nota: Questa procedura di imaging ad alto contenuto è adattata per il sistema di imaging elencato nella Tabella di materiale. Le procedure possono essere diverse se utilizza altri sistemi di imaging ad alto contenuto.

  1. Rimuovere il coperchio e inserire la piastra 384 pozzetti il riproduttore d'immagini ad alto contenuto con A1 posizionato nell'angolo sinistro superiore della piastra.
  2. Aprire il software di acquisizione immagini per impostare i parametri di acquisizione immagine.
    1. Aprire la finestra di Setup di acquisizione di piastra e creare nuova impostazione o caricare un file di installazione esistente.
    2. Selezionare l'obiettivo 20x e impostare Pixelbinning come 2, quindi la dimensione in pixel calibrato è 0,80 x 0,80 µm. impostare le linee di scansione come 2.000 e la dimensione dell'immagine (W x H) come 1.000 x 1.000 pixel (800,00 x 800.00 µm) per ogni sito.
    3. Selezionare il tipo di piastra da essere imaged. Utilizzare le informazioni fornite dal fabbricante della piastra 384 pozzetti per riempire le dimensioni del piatto.
    4. Selezionare i pozzetti siano imaged per la piastra 384 pozzetti.
    5. Selezionare quattro siti essere imaged per pozzetto. Evitare il lato del bene toccato dalle punte di aspirazione.
    6. Selezionare laser di eccitazione come 405, 488 e 561 nm. Selezionare i filtri di emissione per canali DAPI, FITC e Texas Red. Ottimizzare la potenza del laser e guadagni di ogni canale per assicurare la luminosità delle immagini scattate dai pozzetti di controllo positivo sono inferiore alla soglia di saturazione.
    7. Selezionare il pozzetto a altro attivo per l'autofocus. Selezionare il primo pozzo acquisito come l'iniziale bene per trovare i campioni. Impostare sito autofocus su tutti i siti.
    8. Selezionare quattro medie per riga per ogni canale. Ottimizzare il valore di Z-offset per ogni canale.
    9. Test 2-3 pozzi diagonale agli angoli della piastra ben 384 per assicurarsi che le immagini sono sul fuoco per tutti i pozzetti testati, immagini da tutti i siti per pozzetto hanno cellule con più di 40% confluenza e intensità di fluorescenza di tutti i canali sono circa la metà saturi nel 100% pozzetti di controllo.
    10. Salvare il metodo di acquisizione immagine.
  3. Eseguire l'intera piastra. Guarda l'imager fino al termine della cattura delle immagini dalla prima colonna della piastra per controllare la qualità dell'immagine prima di lasciare il dispositivo di imaging. Estrarre la piastra 384 pozzetti e conservare a 4 ° C per un uso futuro.
    Nota: A seconda del numero di siti selezionati per bene e i canali di presa, ci vogliono 40 min a 3 h alla fine una piastra 384 pozzetti di imaging.

6. image Analysis.

  1. Estrarre i dati di immagine utilizzando un software di analisi di immagine ad alto contenuto. Selezionare uno dei pozzetti di controllo al 100% (colonna 23) per impostare i parametri.
  2. Selezionare la Lunghezza multi-d'onda cella segnando come metodo di analisi e iniziare a configurare le impostazioni.
    1. Definire i nuclei utilizzando immagini dal canale DAPI. Anteprima per assicurarsi che le forme di nuclei definiti nel selezionato bene si adatta bene con le immagini di nuclei.
    2. Definire la forma della cella nel canale FITC dove rodopsina-Venus è imaged.
    3. Definire le aree di macchia superficie cellulare rodopsina nel canale Texas Red.
    4. Prova l'algoritmo corrente in 5 pozzi per determinare se le impostazioni sono ottimizzate. Salvare le impostazioni e chiudere la finestra di configurazione .
  3. Eseguire tutti i pozzi con il metodo di analisi ottimizzata.
  4. Numero oggetto di esportazione come numero di cellule intatte. Esportare l' Intensità media del canale FITC come intensità di Rhodopsin-Venus (Venus Rhodopsin INT). Esportare l' Intensità media del canale Texas Red come intensità di rodopsina sulla superficie delle cellule (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule).
  5. Aprire i dati esportati in un software di foglio di calcolo. Dividere l'intensità di rodopsina sulla superficie delle cellule per il rodopsina-Venus INT come rapporto MEM totale. Calcolare la Z'-fattori per ogni parametro valutare la qualità di analisi. Z′ = 1−3X (STDcontrollo 100%+STD0% controllo) / | Intende ilcontrollo al 100%−Mean0% controllo|.
    Nota: Un Z'-fattore superiore a 0 indica un dosaggio moderato sufficiente per uno schermo ad alto contenuto e un Z' fattore compreso tra 0,5 e 1 suggerisce un eccezionale test richiesto per un alto-rendimento schermo20,21.
  6. Utilizzare il software di foglio di calcolo per generare una mappa di calore di due colori per ogni parametro. Organizzare il nome di linee cellulari sull'asse x e i composti sull'asse y.

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Risultati

Abbiamo caratterizzato il trasporto di rodopsina con tre parametri: l'intensità della rodopsina-Venus in tutta la cella (Rhodopsin-Venus INT.), l'intensità di immunostaining del rhodopsin sulla membrana plasmatica (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule) ed il rapporto di rodopsina macchia sulla superficie delle cellule per intensità di rodopsina-Venus in tutta la cella (rapporto tra MEM-totale). Un risultato rappresentativo del dosaggio trasporto rodopsina è mostrato in

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Discussione

Qui, abbiamo mostrato un test di imaging ad alto contenuto utilizzato per la caratterizzazione di colpi identificati da un HTS L'automazione solo coinvolti in questi protocolli è il dispositivo di imaging ad alto contenuto. Il immunostaining e formazione immagine di fluorescenza del rhodopsin sono stati utilizzati comunemente per caratterizzare la localizzazione di rodopsina5,14,15,16. Tuttavia...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Si ringraziano il Dr. Mark E. Schurdak e Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute per fornire il dispositivo di imaging ad alto contenuto e corsi di formazione iniziale. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) ha generosamente condiviso la 1D4 e anticorpi anti-rodopsina B630. Il plasmide contenente il cDNA di mouse rodopsina-Venus costrutto è stato condiviso da Dr. Nevin Lambert (Università di Augusta). Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto nazionale di sovvenzione di salute EY024992 a YC e P30EY008098 da grant Università di Pittsburgh Vision Research Core.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule U2OS (rodopsina-Venere)NANA Cellule stabili generate da cellule U2OS
Cellule U2OS (T4R-rodopsina-Venere)NANACellule stabili generate da cellule U2OS Cellule U2OS
(P23H-rodopsina-Venere)NANA Cellule stabili generate da cellule U2OS Cellule U2OS
(P53R-rodopsina-Venere)NANACellule stabili generate da cellule U2OS
Cellule U2OS (C110Y-rodopsina-Venere)NANA Cellule stabili generate da cellule U2OS
Cellule U2OS (D190N-rodopsina-Venere)NANA Cellule stabili generate da cellule U2OS
Cellule U2OS (P267L-rodopsina-Venere)NANA Cellule stabili generate da cellule U2OS
DMEM ad alto glucosioGenesee Scientific25-500Con L-Glutammina, sodio piruvato
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16140071Inactivated
PlasmocinInvivoGenant-mptMycoplasma elimination reagent
Penicillina-Streptomicina (100X)Gibco15140122100X soluzioni antibiotiche concentrate per prevenire la contaminazione batterica delle colture cellulari
Tripsina-EDTAGenesee Scientific25-5100,25%, 1mM EDTA in HBSS senza calcio e magnesio
Soluzione di poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707-50MLMol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari
CellCarrier-384 Ultra MicropiastrePerkinElmer6057300Micropiastre trattate con coltura tissutale a 384 pozzetti con pareti nere e fondo olefinico ciclico otticamente trasparente per l'imaging di cellule in analisi
ad alto contenutoPiastra sterile a 96 pozzettiEppendorf30730119Coltura tissutale trattata con coperchio a fondo piatto, sterile, priva di pirogeni rilevabili, Rnasi, DNasi e DNA. Fosfato non citotossico
tamponato con salina (PBS)InvitrogenAM962510 x tampone PBS, pH 7,4
DMSOSigma-AldrichD4540>99,5%, coltura cellulare testata
9-cis-retinalSigma-AldrichR5754
Composti testatiSelleckchem/Life Chemicals/NA sintetizzato su misuraI composti sono stati acquistati da fornitori diversi o sintetizzato su misura
B6-30 anticorpo anti-rodopsinaNovusNBP2-25160Regalo dal Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-coniugato capra anti-topo anticorpo secondarioJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc115-165-146
16% paraformaldeideThermo Fisher Scientific28908Senza metanolo
10% normale siero di capraThermo Fisher Scientific50062ZTampone di blocco
Hoechst 33342, TrihydrochInvitrogenH3570Soluzione di colorazione nucleare
Imager ad alto contenutoMolecular DevicesImageXpressImageXpress® Sistema di imaging ad alto contenuto micro confocale
Software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpressMolecular DevicesMetaXpressSoftware per l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto contenuto
Pipetta multicanale (0,5-10 &; L)Rainin17013802Pipetta manuale a 8 canali, 0,5-10 &; L
Pipetta multicanale (0,5-10cRainin17013805Pipetta manuale a 8 canali, 20-200 &; L
Pipetta elettronica multicanale (10-200 μ L)Thermo Scientific14-3879-56BTPipetta elettronica multicanale per operazioni di pipettaggio di micropiastre a 96 e 384 pozzetti
Serbatoio reagente da 50 mlGenesee Scientific28-125Riserva di reagenti per dispensazione di pippte multicanale
Aspiratore a 8 canaliABC ScientificEV503Adattatore in acciaio inossidabile a 8 canali per l'aspirazione di liquidi da piastre a 96 o 384 pozzetti
Excel software per fogli di calcoloMicrosoftExcel2016Il software per fogli di calcolo per l'analisi dei dati e la generazione di mappe di calore
Origin2018 Software per l'analisi scientifica dei dati e la graficaOriginLabOrigin2018Il software di analisi dei dati per la generazione delle curve dose-risposta

Riferimenti

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
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