Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un'analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d'onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.
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Articolo metodologico
Un saggio di trasporto Rhodopsin dall'analisi di Imaging ad alto contenuto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rodopsina misfolding di proteine mutazioni portano a morte dei fotorecettori asta che si manifesta come pigmentosa dominante autosomal di retinite (RP), una progressiva accecante malattia che manca di un trattamento efficace. Supponiamo che la citotossicità del mutante misfolded rodopsina possa essere alleviata stabilizzando farmacologicamente la proteina mutante rodopsina. La mutazione di P23H, tra le altre mutazioni di rodopsina di classe II, codifica per una proteina mutante di rodopsina strutturalmente instabile che viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER), considerando che la rodopsina wild-type viene trasportata alla membrana plasmatica in mammiferi cellule. Precedentemente abbiamo effettuato una schermata di alto-rendimento basata su luminescenza (HTS) ed abbiamo identificato un gruppo di chaperoni farmacologici che hanno salvato il trasporto della rodopsina P23H da ER alla membrana plasmatica. Qui, utilizzando un metodo di immunostaining seguito da un'analisi di imaging ad alto contenuto, abbiamo quantificato la quantità di proteina mutante rodopsina in tutta la cella e sulla membrana plasmatica. Questo metodo è informativo ed efficace per identificare i veri successi da falsi positivi dopo HTS Inoltre, l'analisi di immagine ad alto contenuto permesso di quantificare i parametri multipli da un singolo esperimento per valutare le proprietà farmacologiche di ogni composto. Usando questa analisi, abbiamo analizzato l'effetto di 11 diversi composti verso sei mutanti di rodopsina RP associati, ottenendo un profilo farmacologico 2-D per una comprensione quantitativa e qualitativa circa la stabilità strutturale di questi mutanti di rodopsina e l'efficacia di diversi composti verso questi mutanti.
Introduzione
Misfolding proteico è coinvolto nella distrofia muscolare, degenerazioni neurale, come pure malattie accecante, compresa la retinite pigmentosa (RP)1. RP è una degenerazione retinica ereditaria e progressiva associata a mutazioni in oltre 60 geni che influenzano la funzione e omeostasi dei fotoricettori dell'asta o l'epitelio pigmentato retinico (RPEs)2,3. Nessun trattamento efficace è attualmente disponibile per RP. Le mutazioni di rhodopsin rappresentano circa il 25-30% di autosomica dominante (ad) casi RP. Tra le mutazioni più di 150 del rhodopsin ....
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Protocollo
Nota: Il rodopsina trasporto dosaggio.
1. preparazione e coltura di cellule
- Rilanciare la crioconservazione U2OS stabile cellule che esprimono la wild-type (WT) o proteine di fusione di rodopsina-Venus topo mutante. Scongelare le cellule a 37 ° C fino a quando solo i cristalli di ghiaccio piccolo sono partiti nel flaconcino.
Nota: Le celle di U2OS vengono utilizzate in questo protocollo, perché c'è nessuna linea di cellule fotorecettrici disponibile per gli studi in vitro e la biosintesi pre-ciliare della rodopsina è regolata dai simili meccanismi molecolari in cellule di mammifero. Inoltre, le cellule....
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Risultati
Abbiamo caratterizzato il trasporto di rodopsina con tre parametri: l'intensità della rodopsina-Venus in tutta la cella (Rhodopsin-Venus INT.), l'intensità di immunostaining del rhodopsin sulla membrana plasmatica (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule) ed il rapporto di rodopsina macchia sulla superficie delle cellule per intensità di rodopsina-Venus in tutta la cella (rapporto tra MEM-totale). Un risultato rappresentativo del dosaggio trasporto rodopsina è mostrato in
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Discussione
Qui, abbiamo mostrato un test di imaging ad alto contenuto utilizzato per la caratterizzazione di colpi identificati da un HTS L'automazione solo coinvolti in questi protocolli è il dispositivo di imaging ad alto contenuto. Il immunostaining e formazione immagine di fluorescenza del rhodopsin sono stati utilizzati comunemente per caratterizzare la localizzazione di rodopsina5,14,15,16. Tuttavia.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Si ringraziano il Dr. Mark E. Schurdak e Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute per fornire il dispositivo di imaging ad alto contenuto e corsi di formazione iniziale. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) ha generosamente condiviso la 1D4 e anticorpi anti-rodopsina B630. Il plasmide contenente il cDNA di mouse rodopsina-Venus costrutto è stato condiviso da Dr. Nevin Lambert (Università di Augusta). Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto nazionale di sovvenzione di salute EY024992 a YC e P30EY008098 da grant Università di Pittsburgh Vision Research Core.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule U2OS (rodopsina-Venere) | NA | NA Cellule stabili generate da cellule U2OS | |
| Cellule U2OS (T4R-rodopsina-Venere) | NA | NA | Cellule stabili generate da cellule U2OS Cellule U2OS |
| (P23H-rodopsina-Venere) | NA | NA Cellule stabili generate da cellule U2OS Cellule U2OS | |
| (P53R-rodopsina-Venere) | NA | NA | Cellule stabili generate da cellule U2OS |
| Cellule U2OS (C110Y-rodopsina-Venere) | NA | NA Cellule stabili generate da cellule U2OS | |
| Cellule U2OS (D190N-rodopsina-Venere) | NA | NA Cellule stabili generate da cellule U2OS | |
| Cellule U2OS (P267L-rodopsina-Venere) | NA | NA Cellule stabili generate da cellule U2OS | |
| DMEM ad alto glucosio | Genesee Scientific | 25-500 | Con L-Glutammina, sodio piruvato |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 16140071 | Inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillina-Streptomicina (100X) | Gibco | 15140122 | 100X soluzioni antibiotiche concentrate per prevenire la contaminazione batterica delle colture cellulari |
| Tripsina-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0,25%, 1mM EDTA in HBSS senza calcio e magnesio |
| Soluzione di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari |
| CellCarrier-384 Ultra Micropiastre | PerkinElmer | 6057300 | Micropiastre trattate con coltura tissutale a 384 pozzetti con pareti nere e fondo olefinico ciclico otticamente trasparente per l'imaging di cellule in analisi |
| ad alto contenutoPiastra sterile a 96 pozzetti | Eppendorf | 30730119 | Coltura tissutale trattata con coperchio a fondo piatto, sterile, priva di pirogeni rilevabili, Rnasi, DNasi e DNA. Fosfato non citotossico |
| tamponato con salina (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x tampone PBS, pH 7,4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99,5%, coltura cellulare testata |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Composti testati | Selleckchem/Life Chemicals/NA sintetizzato su misura | I composti sono stati acquistati da fornitori diversi o sintetizzato su misura | |
| B6-30 anticorpo anti-rodopsina | Novus | NBP2-25160 | Regalo dal Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-coniugato capra anti-topo anticorpo secondario | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldeide | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Senza metanolo |
| 10% normale siero di capra | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Tampone di blocco |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Soluzione di colorazione nucleare |
| Imager ad alto contenuto | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Sistema di imaging ad alto contenuto micro confocale |
| Software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpress | Molecular Devices | MetaXpress | Software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto contenuto |
| Pipetta multicanale (0,5-10 &; L) | Rainin | 17013802 | Pipetta manuale a 8 canali, 0,5-10 &; L |
| Pipetta multicanale (0,5-10c | Rainin | 17013805 | Pipetta manuale a 8 canali, 20-200 &; L |
| Pipetta elettronica multicanale (10-200 μ L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Pipetta elettronica multicanale per operazioni di pipettaggio di micropiastre a 96 e 384 pozzetti |
| Serbatoio reagente da 50 ml | Genesee Scientific | 28-125 | Riserva di reagenti per dispensazione di pippte multicanale |
| Aspiratore a 8 canali | ABC Scientific | EV503 | Adattatore in acciaio inossidabile a 8 canali per l'aspirazione di liquidi da piastre a 96 o 384 pozzetti |
| Excel software per fogli di calcolo | Microsoft | Excel2016 | Il software per fogli di calcolo per l'analisi dei dati e la generazione di mappe di calore |
| Origin2018 Software per l'analisi scientifica dei dati e la grafica | OriginLab | Origin2018 | Il software di analisi dei dati per la generazione delle curve dose-risposta |
Riferimenti
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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Ristampe e permessi
