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Articolo metodologico

Stabilire linee di cellule che Overexpressing DR3 per valutare la risposta apoptotica di anti-mitotico Therapeutics

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DOI:

10.3791/58705

⸱

11 gennaio 2019

 ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, 2Department of Radiology, University of California, San Francisco, 3Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Stabilire una linea di cellulari stabili che overexpressing un gene di interesse per lo studio di funzione del gene può essere fatto da stabili transfezione-picking singoli cloni dopo trasfezione loro tramite infezione retrovirale. Qui indichiamo che linee di cellule HT29-DR3 generate in questo modo delucidare i meccanismi da cui la morte recettore 3 (DR3) contribuisce all'apoptosi indotta da antimitotici.

Abstract

Studiare la funzione di un gene di interesse può essere realizzato manipolando il suo livello di espressione, ad esempio diminuendo sua espressione con linee cellulari atterramento o aumentando la sua espressione con sovraespressione di cellula. Trasfezione transiente e stabile sono due metodi che vengono spesso utilizzati per l'espressione genica esogeno. Trasfezione transiente è utile solo per espressione a breve termine, mentre transfezione stabile consente di geni esogeni essere integrato nel genoma della cellula ospite dove sarà continuamente espresso. Di conseguenza, la transfezione stabile è solitamente utilizzata per la ricerca nella regolazione genica a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo semplice per generare una linea stabile delle cellule che overexpressing taggati death receptor 3 (DR3) per esplorare DR3 funzione. Abbiamo scelto singoli cloni dopo un'infezione retrovirale per mantenere l'omogeneità e la purezza delle linee cellulari stabili. Le linee cellulari stabili generate utilizzando questo protocollo rendono le cellule HT29 DR3-carenti sensibile ai farmaci antimitotici, ricostituendo così la risposta apoptotica in cellule HT29. Inoltre, il tag di bandiera il DR3 compensa l'indisponibilità di buona DR3 anticorpo e facilita lo studio biochimico del meccanismo molecolare attraverso il quale gli agenti antimitotici inducono apoptosi.

Introduzione

Espressione del gene eterologo è spesso impiegato per studiare la funzione dei geni di interesse. Due metodi, trasfezione transiente e stabile, sono impiegati prevalentemente nelle cellule e biologia molecolare per inserire un segmento di DNA o RNA in un host cella1,2. Transitoriamente transfected DNA o RNA può essere trasmessa alle cellule figlie, quindi l'alterazione genetica possa essere conservato solo per un breve periodo di tempo. D'altra parte, in modo stabile transfected le cellule, geni esogeni sono integrati nel genoma della cellula ospite, sostenere la sua espressione nella linea cellulare. Così, la transfezione stabile è un metodo che è solitamente riservato per la ricerca sulla regolazione genica a lungo termine. La linea cellulare stabile possa essere trapiantata anche come xenotrapianti in modelli murini per in vivo studiano3. Transfezione stabile può essere diviso in due categorie: virale e nonviral. Rispetto alla transfezione nonviral, infezione virale può trasferire geni in una più ampia varietà di cellule umane con una più alta efficienza4,5,6,7. Inoltre, una linea cellulare stabile da un singolo clone offre il vantaggio di omogeneità e purezza clonale.

Divisione e crescita incontrollata delle cellule sono le caratteristiche più distintive di cancro. Nelle regolazioni cliniche, agenti antimitotici sono trattamenti primari per molti tipi di tumori8. Tuttavia, alcune limitazioni significative degli agenti antimitotici non possono essere ignorati. In primo luogo, questi chemioterapie possono anche uccidere le cellule normali insieme con le cellule cancerose indesiderate e, quindi, possono provocare gravi effetti collaterali8. In secondo luogo, antitubulin farmaci non sono efficaci contro tutti i tipi di tumori, nonostante il espressione ubiquitaria di tubulina in un'ampia varietà di tessuti diversi come una proteina del citoscheletro9,10. Non è chiaro perché antitubulin agenti hanno mostrato promettente efficacia contro ovarico, polmone e cancri ematologici nel trattamento clinico, ma non nel rene, colon o tumori pancreatici11. Infine, anche i pazienti con lo stesso tipo di tumore possono rispondere gli antimitotici diversamente in modo imprevedibile. Ci può essere una molecola effettore chiave che colpisce la sensibilità di diversi pazienti agli agenti antimitotici, conseguente i diversi risultati visti nel trattamento clinico12. Così, la potenziale sensibilità differenziale dei pazienti al trattamento antimitotiche dovrebbe tener conto al fine di ottimizzare gli interventi terapeutici13.

Una schermata di biblioteca di alto-rendimento intero genoma siRNA ha dimostrato che DR3 atterramento potrebbe rendere sensibili cellule resistenti ai farmaci antimitotici, implicando un ruolo nell'apoptosi indotta da chemioterapia14DR3. Come un membro della superfamiglia del recettore (TNFR) di fattore di necrosi tumorale, DR3 è stato segnalato per mediare apoptosi delle cellule in vari sistemi15,16,17,18. Così, abbiamo deciso di stabilire linee cellulari stabili che overexpressing DR3 per studiare i meccanismi molecolari da cui farmaci antimitotici inducono apoptosi. Un modello di cella appropriata per studiare DR3 sovraespressione può essere fornito dalla linea cellulare di cancro umano del colon HT29, che è stato trovato per essere DR3-carenti. Inoltre, nella clinica, tumori del colon sono insensibili ai farmaci antimitotico19.

In questo articolo, descriviamo un metodo che consente la generazione di una linea cellulare stabile HT29-DR3 attraverso infezione retrovirale. Più ulteriormente indichiamo come convalidare l'espressione DR3 in queste cellule mediante western blotting e come valutare la sensibilità agli agenti antimitotici utilizzando un'analisi di attuabilità delle cellule e l'osservazione morfologica. Le cellule sono amplificate da singoli cloni e, pertanto, hanno il vantaggio di un background genetico omogeneo. Inoltre, il tag di bandiera il DR3 ammessi per la visualizzazione dei cellulari DR3 da microscopia e analisi di interazione della proteina e di espressione genica mediante approcci biochimici. Inoltre, le cellule possono essere xenotrapiantate nei topi per analizzare ulteriormente la progressione del tumore in risposta a antimitotici in vivo14.

Il sistema di cellule HT29-DR3 presentato qui offerto uno strumento efficace per lo studio dei meccanismi molecolari di come antimitotici kill cancro cellule14. Poiché la sovraespressione e atterramento di cellula è strumenti comuni per lo studio della funzione del gene, questo protocollo può essere adattato facilmente ad altri geni di interesse o di altre linee cellulari e, quindi, trasformato in un approccio ampiamente utilizzato.

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Protocollo

Siete pregati di notare che tutti gli esperimenti del mouse descritti qui sono stati approvati e in accordo con l'istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università di Tsinghua.

1. generazione di linee cellulari di DR3 sovraespressione

  1. Costruire il plasmide per espressione DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandiera) con l'inserimento di cDNA integrale DR3 con 3 x bandiera al C-terminale in vettore retrovirale pMXs-IRES-Consciousness presso i siti di restrizione di BamHI/XhoI.
  2. Crescere le cellule Plat-A in piastre da 60 mm con 4 mL di terreno dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM). Il giorno successivo, quando le cellule raggiungono la confluenza di 80% - 90%, le cellule con 2 μg di plasmide pMXs-IRES-DR3-bandiera del transfect usando il reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) secondo il manuale del produttore20.
  3. Dopo 72 h, raccogliere il surnatante filtrato il supporto utilizzando un filtro sterile di 0,45 μm e mantenere la sospensione virale al buio a 4 ° C.
  4. Crescere le cellule HT29 in DMEM in un piatto di 60 mm e incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
  5. Il giorno successivo, quando le cellule raggiungono la confluenza di 30-50%, infettare le cellule con 2 mL di sospensione virale in presenza di 8 μg di 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per millilitro di sospensione virale. Dopo 4-6 h di incubazione a 37 ° C, aspirare la sospensione virale, aggiungere 4 mL di DMEM fresco e riporre la piastra nell'incubatore.
  6. Scartare i media da un postinfection di 24 h i piatti e lavare accuratamente le cellule con 2 mL di PBS preriscaldata. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA alle cellule e incubare a 37 ° C per 3 min.
  7. Dopo aver osservato con un microscopio a ingrandimento 10x che la maggior parte delle cellule hanno staccato, interrompere il trypsinization con 2 mL di DMEM completo contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA).
  8. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di DMEM. Miscelare bene pipettando delicatamente su e giù. Diluire le cellule da fattori di 30, 100 e 300. Seme le cellule in piastre da 150 mm con 20 mL di DMEM contenente 1 µ g/mL Consciousness. Incubare a incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per ~ 1-2 settimane.
  9. Durante questo periodo, osservare le colonie ogni giorno con un microscopio invertito a 10 ingrandimenti. Contrassegnare le colonie ben isolate nella parte inferiore del piatto quando il diametro di Colonia è di circa 1-2 mm.
  10. Il mezzo di aspirare e lavare le cellule con 3 mL di PBS preriscaldata. Aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA in un piatto di 60 mm. Utilizzare pinze sterili per ritirare in autoclave sterile clonazione cilindri e metterli nel piatto 60 mm. Pick up i cilindri contenenti tripsina-EDTA e metterli delicatamente sopra le colonie contrassegnate. Assicurarsi che ogni cilindro clonazione solo contiene una Colonia ed evitare la contaminazione con le colonie vicine.
  11. Riporre la piastra nell'incubatore per 3 minuti.
  12. Dopo 3 min, controllare le cellule al microscopio a ingrandimento 10x per vedere se hanno staccato. Quando le cellule hanno innalzato, aggiungere 70 μL di terreno di coltura per ogni cilindro per inattivare la tripsina. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta di 200 μL. Assicurarsi di non spostare il cilindro durante questo processo.
  13. Trasferire la sospensione cellulare da ogni colonia a due piastre 24 pozzetti contenente 1 mL di DMEM per pozzetto. Aggiungere 30 μL della sospensione di cellule per pozzetto in lamiera A e 70 μL nei corrispondenti pozzetti nella piastra B. Label le piastre correttamente e metterli torna nell'incubatrice.

2. la verifica della linea cellulare sovraespressione DR3

  1. Quando le cellule nella piastra B sono al 90% confluenza, rimuovere il supporto e lavate accuratamente le cellule con 1 mL di PBS. Completamente rimuovere PBS e lisare le cellule con 50 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE: 1x. Trasferire i lisati cellulari dalla piastra a 24 pozzetti per provette da 1,5 mL e portare a ebollizione i campioni per 10 min a 100 ° C.
  2. Funzionare i campioni su 10% sodio dodecil solfato (SDS) gel a una tensione costante di 80 V per 15 min e, quindi, a 120 V per 1 h.
  3. Trasferire la proteina ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) di trasferimento bagnato a una corrente costante di 400 mA per 2 h.
  4. Testare l'espressione DR3 in diversi cloni con anticorpo anti-FLAG, utilizzando le cellule HT29 di selvaggio-tipo come controllo negativo (Figura 1). Diluire l'anticorpo primario di un fattore pari a 5.000 in 5% latte scremato che è dissolto in TBST (soluzione fisiologica tamponata contenente 0.1% Tween-20). Incubare la membrana con l'anticorpo di bandiera a 4 ° C durante la notte.
  5. Lavare la membrana con TBST scuotendolo su un agitatore che decoloring a 200 giri al RT. Refresh TBST ogni 5 minuti per un totale di tempo di 15 minuti di lavaggio.
  6. Incubare la membrana con anticorpo secondario anti-topo diluito di un fattore pari a 10.000 in 5% latte scremato a 4 ° C per 5-6 h.
  7. Lavare la membrana come descritto al punto 2.5.
  8. Rilevare l'espressione di bandiera usando il substrato occidentale chemiluminescenza (ECL) e la membrana con un sistema di documentazione del gel di immagine (Vedi Tabella materiali). Identificare i cloni che esprimono DR3 come i cloni positivi.
  9. Trasferire i cloni in piastra A che corrispondono ai cloni positivi nella piastra B per una piastra a 6 pozzetti e continuano ad amplificare le cellule fino a coltivarle in piatti di 10 cm. Rendere gli stock congelati delle cellule crescente da cloni positivi e conservarli a-80 ° C per un uso futuro.

3. valutazione della risposta apoptotica delle cellule agli agenti antimitotici

Nota: Diazonamide è una nuova classe di prodotto naturale marino che ha notevole attività nell'inibire la crescita della cellula tumorale, che rispecchia altri agenti destabilizzanti di tubulina21. Tuttavia, la sua modalità di azione rimane poco chiaro. Per testare la risposta cellulare delle cellule agli agenti antimitotici, paclitaxel e diazonamide sono stati usati per trattare cellule HT29 wild-type e cellule HT29-DR3. Le droghe erano disciolto in dimetilsolfossido (DMSO) a fare scorte di 10 mM e, quindi, ulteriormente diluite a concentrazioni differenti: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM e 10.000 nM in DMSO.

  1. Raccogliere le cellule HT29 e HT29-DR3 di trypsinization. Misurare la densità delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatico. Allora, seed le cellule in 12-pozzetti di piastre in DMEM ad una densità di 3 x 104 cellule per pozzetto. Il giorno successivo, aggiungere 10 nM diazonamide e utilizzare 1% DMSO come controllo negativo. Dopo 48 h di trattamento, immagine le cellule con un microscopio a ingrandimento 10x (Figura 2).
  2. Seme HT29 e HT29-DR3 cellule in piastre da 96 pozzetti in DMEM ad una densità di 3 x 103 cellule per pozzetto e consentire loro di crescere durante la notte a 37 ° C. Quindi, aggiungere le concentrazioni di diazonamide dose-escalation di 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM e 100 nM in ciascun pozzetto, usando 1% DMSO come controllo negativo.
  3. Dopo 48 h di trattamento, misurare la vitalità cellulare utilizzando un kit di test di vitalità cellulare basata su luminescenza secondo il manuale del produttore.
    1. Togliere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatrice e lasciate riposare a temperatura ambiente per circa 30 min. Quindi, aggiungere 50 µ l di reagenti in ciascun pozzetto, agitare la piastra a temperatura ambiente per 2 min per lisare le cellule e incubare la piastra a temperatura ambiente per un altro 10 min determinare la luminescenza di ciascun pozzetto usando un lettore di micropiastre (Figura 3).
      Nota: L'attuabilità delle cellule rappresenta l'intensità di luminescenza relativa di ogni bene a quello del controllo trattati bene con 1% DMSO.
  4. Utilizzare topi nudi di BALB/c sei-settimana-vecchio femminili per un in vivo Studio14.
    Nota: I topi sono stati mantenuti in condizioni da organismi patogeni specifiche.
    1. Tripsinizzano delle cellule HT29 e HT29-DR3 e, quindi, arrestare il trypsinization utilizzando DMEM preriscaldato a 37 ° C. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL e centrifugare le cellule a 1.000 giri/min per 10 min a RT. scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo DMEM senza FBS. Centrifugare le cellule nuovamente e risospendere il pellet cellulare in PBS.
    2. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatico e diluire le cellule ad una concentrazione di 2,5 x 107 cellule/mL con PBS. Generare i tumori attraverso un'iniezione sottocutanea di 200 μL della sospensione delle cellule HT29 o HT29-DR3 nel fianco di destra di ogni mouse (5 x 106 cellule/topo)22.
    3. Misurare il volume del tumore (TV) utilizzando pinze ogni 2 d dopo il trapianto. Calcolare la TV utilizzando la seguente formula: TV = 1 / 2L x l x P (qui, w: larghezza di tumore, l: lunghezza del tumore). Quando il volume medio del tumore raggiunge circa 100 mm3, randomizzare i topi nel controllo o gruppo trattato (n = 6 per gruppo) e avviare il trattamento.
    4. Preparare la soluzione di paclitaxel come segue. In primo luogo, sciogliere paclitaxel completamente in etanolo al 5% del volume totale e, quindi, aggiungere il 5% del volume finale di polyoxyl 35 idrogenato olio di ricino. Infine, compongono il restante 90% del volume con D5W (Destrosio 5% in acqua, pH 7.4).
    5. Iniettare il paclitaxel per via endovenosa ad una dose di 20 mg/kg 3 volte alla settimana per due settimane. Misurare il volume e corpo peso del tumore 3 x una settimana14. Terminare l'esperimento ed eutanasia degli animali, se il peso corporeo diminuisce del 20% o il volume del tumore raggiunge circa 2.000 mm3.

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Risultati

Caratterizzazione di cellule HT29 che esprimono stabilmente DR3 è illustrata nella Figura 1. I cloni esprimono vari livelli di DR3, mentre le cellule wild-type, che servono come controllo negativo, non mostrano espressione genica esogeno. Qui indichiamo solo cinque cloni, tra cui clonare 1 e 5 express il massimo livello di DR3. Abbiamo scelto clone 1 e 5 per i seguenti esperimenti.

La morfologia del...

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Discussione

In questo manoscritto, descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili HT29-DR3. Le cellule HT29-DR3 forniscono un modello per studiare i meccanismi molecolari da cui DR3 contribuisce all'apoptosi indotta da agenti antimitotici. Questo approccio è versatile e ripetibile. Per garantire il successo della procedura, è necessario considerare quattro passaggi chiave del protocollo. In primo luogo, al fine di produrre un alto abbastanza titolo del virus, si consiglia di eseguire la transfezione del DNA quando le cel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni 53110000117 (di G.W.) e 043222019 (per X.W.) presso la Tsinghua University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMInvitrogenC11965500BTIntegrato con il 10% di FBS e l'1% di Penicilina/Streptomicina
Saggio di vitalità cellulare luminescentePromegaG7571
PaclitaxelSelleckS1150
pMXs-IRES-BlasicidinCell BiolabsRTV-016
Dimetil solfossidoSigmaD2650
PBSInvitrogenC14190500BT
Tripsina-EDTA (0,25%)Invitrogen25200056
1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametilene polimethobromideSanta Cruzsc-134220
  Reagente di trasfezionePromegaE2311
Anticorpo secondario anti-topoJackson ImmumoResearch115-035-166
anticorpo anti-FlagLinea cellulare SigmaF-3165
HT29 Linea cellulareATCCHTB-38
plat-A Linea cellulareCell BiolabsRV-102
PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Cilindro di clonazioneSigmaC1059
Lettore multimodale per imaging cellulare BiotekBTCYT3MV
CKX53 Microscopio invertitoOlympusCKX53
Piastre per colture cellulari a 12 pozzettiNest712001
piastre per colture cellulari da 60 mmNest705001
provette da centrifuga da 15 mLNest
0,22 μ m filtro sterilMilliporeSLGP033RB
Centrifuga 5810 REppendorf5810000327
96 pozzetti Micropiastra in polistirene bianco Corning3903
Western ECL SubstratoBIO-RAD1705060
ImageQuant LAS 4000GE HealthcareImageQuant LAS 4000 
Agitatore decolorante HINOTECHTS-2000A
BlasticidinaInvivoGenant-bl-1
Contatore cellulare automatizzatoBIO-RADTC 20
Opti-MEM I Siero ridotto MediumThermo Fisher31985070
601052

Riferimenti

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