Stabilire linee di cellule che Overexpressing DR3 per valutare la risposta apoptotica di anti-mitotico Therapeutics

Sommario

Stabilire una linea di cellulari stabili che overexpressing un gene di interesse per lo studio di funzione del gene può essere fatto da stabili transfezione-picking singoli cloni dopo trasfezione loro tramite infezione retrovirale. Qui indichiamo che linee di cellule HT29-DR3 generate in questo modo delucidare i meccanismi da cui la morte recettore 3 (DR3) contribuisce all'apoptosi indotta da antimitotici.

Abstract

Studiare la funzione di un gene di interesse può essere realizzato manipolando il suo livello di espressione, ad esempio diminuendo sua espressione con linee cellulari atterramento o aumentando la sua espressione con sovraespressione di cellula. Trasfezione transiente e stabile sono due metodi che vengono spesso utilizzati per l'espressione genica esogeno. Trasfezione transiente è utile solo per espressione a breve termine, mentre transfezione stabile consente di geni esogeni essere integrato nel genoma della cellula ospite dove sarà continuamente espresso. Di conseguenza, la transfezione stabile è solitamente utilizzata per la ricerca nella regolazione genica a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo semplice per generare una linea stabile delle cellule che overexpressing taggati death receptor 3 (DR3) per esplorare DR3 funzione. Abbiamo scelto singoli cloni dopo un'infezione retrovirale per mantenere l'omogeneità e la purezza delle linee cellulari stabili. Le linee cellulari stabili generate utilizzando questo protocollo rendono le cellule HT29 DR3-carenti sensibile ai farmaci antimitotici, ricostituendo così la risposta apoptotica in cellule HT29. Inoltre, il tag di bandiera il DR3 compensa l'indisponibilità di buona DR3 anticorpo e facilita lo studio biochimico del meccanismo molecolare attraverso il quale gli agenti antimitotici inducono apoptosi.

Introduzione

Espressione del gene eterologo è spesso impiegato per studiare la funzione dei geni di interesse. Due metodi, trasfezione transiente e stabile, sono impiegati prevalentemente nelle cellule e biologia molecolare per inserire un segmento di DNA o RNA in un host cella^1,2. Transitoriamente transfected DNA o RNA può essere trasmessa alle cellule figlie, quindi l'alterazione genetica possa essere conservato solo per un breve periodo di tempo. D'altra parte, in modo stabile transfected le cellule, geni esogeni sono integrati nel genoma della cellula ospite, sostenere la sua espressione nella linea cellulare. Così, la....

Protocollo

Siete pregati di notare che tutti gli esperimenti del mouse descritti qui sono stati approvati e in accordo con l'istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università di Tsinghua.

1. generazione di linee cellulari di DR3 sovraespressione

1. Costruire il plasmide per espressione DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandiera) con l'inserimento di cDNA integrale DR3 con 3 x bandiera al C-terminale in vettore retrovirale pMXs-IRES-Consciousness presso i siti di restrizione di BamHI/XhoI.
2. Crescere le cellule Plat-A in piastre da 60 mm con 4 mL di terreno dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM). Il giorno successivo, quando le c....

Risultati

Caratterizzazione di cellule HT29 che esprimono stabilmente DR3 è illustrata nella Figura 1. I cloni esprimono vari livelli di DR3, mentre le cellule wild-type, che servono come controllo negativo, non mostrano espressione genica esogeno. Qui indichiamo solo cinque cloni, tra cui clonare 1 e 5 express il massimo livello di DR3. Abbiamo scelto clone 1 e 5 per i seguenti esperimenti.

La morfologia del.......

Discussione

In questo manoscritto, descriviamo un metodo per generare linee cellulari stabili HT29-DR3. Le cellule HT29-DR3 forniscono un modello per studiare i meccanismi molecolari da cui DR3 contribuisce all'apoptosi indotta da agenti antimitotici. Questo approccio è versatile e ripetibile. Per garantire il successo della procedura, è necessario considerare quattro passaggi chiave del protocollo. In primo luogo, al fine di produrre un alto abbastanza titolo del virus, si consiglia di eseguire la transfezione del DNA quando le cel.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	Integrato con il 10% di FBS e l'1% di Penicilina/Streptomicina
Saggio di vitalità cellulare luminescente	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimetil solfossido	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Tripsina-EDTA (0,25%)	Invitrogen	25200056
1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametilene polimethobromide	Santa Cruz	sc-134220
Reagente di trasfezione	Promega	E2311
Anticorpo secondario anti-topo	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
anticorpo anti-Flag	Linea cellulare Sigma	F-3165
HT29 Linea cellulare	ATCC	HTB-38
plat-A Linea cellulare	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
Cilindro di clonazione	Sigma	C1059
Lettore multimodale per imaging cellulare Biotek		BTCYT3MV
CKX53 Microscopio invertito	Olympus	CKX53
Piastre per colture cellulari a 12 pozzetti	Nest	712001
piastre per colture cellulari da 60 mm	Nest	705001
provette da centrifuga da 15 mL	Nest
0,22 μ m filtro steril	Millipore	SLGP033RB
Centrifuga 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 pozzetti Micropiastra in polistirene bianco	Corning	3903
Western ECL Substrato	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Agitatore decolorante	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidina	InvivoGen	ant-bl-1
Contatore cellulare automatizzato	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I Siero ridotto Medium	Thermo Fisher	31985070

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