Il protocollo viene illustrato l'utilizzo dell'esame istopatologico e immunohistochemistry al profilo il macrofago di folato recettore beta e il suo rapporto con il totale delle cellule immuni infiltrarsi in biopsie temporali dell'arteria in arteritis gigante delle cellule.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Uno studio di Immunohistopathologic per profilare il folato recettore Beta macrofago e microambiente vascolare immuni nella arterite a cellule giganti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Arteritis gigante delle cellule (GCA) è un'immuno-mediata malattia cronica delle arterie di dimensioni medio-grandi che colpisce gli adulti più anziani. GCA manifesti con artrite e occlusivi sintomi di mal di testa, colpo o perdita della vista. Macrofagi e linfociti T-helper infiltrano nella parete vascolare e producono una risposta pro-infiammatoria che conducono a danno del vaso e ischemia. Ad oggi, non c'è nessun biomarcatore di GCA che può controllare la malattia attività e guida risposta terapeutica.
Folato del recettore beta (FRB) è una proteina di glicosilfosfatidilinositolo che è ancorata sulle membrane cellulari e normalmente espressi nella stirpe myelomonocytic e nella maggior parte delle cellule di leucemia mieloide pure come nel tumore e macrofagi sinoviali reumatoidi, dove la sua espressione correla con la severità di malattia. La capacità di associare composti di folati, acido folico-coniugati e droghe antifolati FRB ha reso una destinazione trattabili in cancro e la malattia infiammatoria ricerca. Questo rapporto descrive i metodi istopatologici e immunohistochemical, utilizzati per valutare l'espressione e la distribuzione di FRB in relazione GCAimmunopathology.
Le biopsie dell'arteria temporale formalina-fisso e paraffina-incastonati da GCA e comandi normali erano macchiate con ematossilina ed eosina per rivedere l'istologia del tessuto e identificare caratteristiche patognomoniche. Immunohistochemistry è stato usato per rilevare l'espressione FRB, CD68 e CD3. Stata effettuata un'analisi microscopica per quantificare il numero di celle positivamente macchiate in 10 sezioni selezionate di high-power-campo e nelle rispettive posizioni nella parete arteriosa.
L'infiammazione lymphohistiocytic (LH) accompagnato da iperplasia intimale e perturbata lamina elastica è stata veduta nel GCA con nessuno trovato nei controlli. L'infiltrazione di LH era composta di circa il 60% di linfociti e il 40% di macrofagi. Espressione di FRB era limitata ai macrofagi, che comprende il 31% della popolazione di macrofagi CD68 + totale e localizzato ai media e avventizia. Nessun FRB è stato visto nei controlli.
Questo protocollo ha dimostrato un modello distinto di numerico e spaziale del macrofago FRB rispetto al microambiente immune vascolare nel GCA.
Introduzione
Arteritis gigante delle cellule (GCA) è una malattia infiammatoria delle medio-grandi arterie, l'aorta ed i relativi rami di targeting e che interessa gli adulti più anziani. Si presenta con lievi a gravi complicanze ischemiche quali mal di testa, perdita della vista, dolore alla mascella, gangrene del colpo e del tessuto. La diagnosi è confermata dall'alti indicatori infiammatori come tasso di sedimentazione dell'eritrocito (ESR) e un modello istopatologico distinto sull'arteria temporale biopsia (scheda)1. GCA è la più comune vasculite adulta, e l'accessibilità dell'arteria temporale ottenuta per diagnosi presenta un vantaggio rispetto altre vasculopatie, così permettendo ad uno di studiare la relativa patogenesi più prontamente. I risultati tipici nella scheda includono un'infiltrazione dei macrofagi/istiociti e linfociti T trovati attraverso tutti gli strati vascolari della tonaca intima, media e avventizia con concomitante distruzione della lamina elastica che normalmente separa questi vani2. L'evidenza attuale dimostra che GCA comporta un antigene sconosciuto che attiva le cellule dendritiche nel adventitia vascolare, seguita dall'assunzione di helper cellule di T (Th), in particolare Th1 e Th17 sottotipi che secernono interleuchina-17 e interferone-gamma (IFG) rispettivamente. IFG poi recluta e attiva i macrofagi a produrre citochine e proteasi. Questi includono le citochine pro-infiammatorie; compreso IL-12, che reciprocamente si attiva le cellule Th1, fornendo così un ciclo di feedback positivo; fattore di necrosi tumorale e l'interleuchina-6, che causano artrite e febbri e metalloproteasi che danneggiare la lamina elastica. I glucocorticoidi (GC), che costituiscono la terapia cronica standard, controllano parzialmente le vie di citochina attenuando Th17/IL-17, ma non il braccio Th1/IFG di risposta immunitaria3,4. Purtroppo, l'interruzione del GC provoca in ricaduta di malattia. Come modalità alternativa, metotrexato è stato reimpiegato per trattamento di GCA, ma il desiderato endpoint clinici non sono stati raggiunti costantemente anche se biomarcatori più sensibili non sono stati utilizzati per il monitoraggio terapeutico5,6 . Nel 2017, il blocco di interleuchina 6, tocilizumab, è stato approvato per il trattamento del GCA quanto dimostrato efficacemente il controllo delle malattie e con parsimonia effetti7,8steroide.
Fin qui, non ci sono nessun buoni biomarcatori per GCA. Di conseguenza, è difficile monitorare l'attività di malattia e titolare di dosi di farmaci disponibili per evitare gli effetti negativi e ridurre l'onere del costo per la società. Pertanto, è imperativo per cercare un biomarcatore di candidato che correla con attività di malattia, fornire nuove conoscenze sulla patogenesi e l'aiuto nelle decisioni terapeutiche.
La disregolazione dell'attivazione macrofagica è un fattore critico nella patogenesi di GCA. Quindi, un mezzo efficace di trattare GCA può essere il targeting selettivo dei macrofagi attivati. La versione beta del recettore di folato (FRB) è una glicoproteina di glicosil fosfatidilinositolo che è ancorata sulla membrana cellulare espressa in cellule myelomonocytic normale, le cellule di leucemia mieloide e macrofagi attivati. Suo ligando, acido folico, è una vitamina essenziale nella sua forma ridotta, che consente la sintesi, la metilazione e la riparazione del DNA cellulare9. FRB espressione è indotta nella malattia autoimmune e durante la carcinogenesi. La sua espressione è limitata alla superficie dei monociti o pro-infiammatorie M1 macrofagi nell'artrite reumatoide, o a antinfiammatori M2 macrofagi in organo solido e neoplasie mieloidi10,11,12 , 13. oltre al suo ruolo potenziale come biomarcatore di macrofagi attivati, FRB può abilitare il trasporto del farmaco selettivo attraverso un processo a più fasi che inizia con l'associazione del recettore per l'acido folico, antifolici o folato-coniugati di droga dalla cella superficie, seguita da interiorizzazione, rilascio e consegna eventuale di farmaco desiderata per l'interno cella macchinari12,14,15,16. A differenza di FRB espressi su cellule tumorali e macrofagi attivati, FRB espresso in cellule emopoietiche normali è in grado di associare i folati assicurando che FRB/folato-ha mediato la consegna della droga è limitata a FRB-positiva infiammatoria o cellule tumorali.
Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che FRB è espresso nei macrofagi GCA e sua espressione correlata con CD68 + ed endotelina macrofagi beta del recettore, che contribuiscono alla patogenesi di GCA17. In questo rapporto, descriviamo l'istopatologico e immunohistochemical metodi utilizzati per valutare il macrofago FRB e analizzato il totale dei linfociti e macrofago conta per guadagnare la comprensione nella posizione di FRB nel paesaggio vascolare GCA.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i metodi descritti sono stati approvati da Penn State Institutional Review Board.
1. istopatologico preparazione ed elaborazione previa biopsia dell'arteria temporale
Nota: La biopsia dell'arteria temporale (scheda) viene eseguita in anestesia locale e condizioni sterili di un chirurgo certificato. Dopo aver ottenuto chirurgicamente una sezione arteriosa di 3 cm dal lato più commovente, l'esemplare è fissato in formalina immediatamente per 24 h, diviso in sezioni da 3 a 4 mm e inclusi in paraffina, prestando molta attenzione all'allineamento corretto del tessuto nel blocco che allora è conservato a temperatura ambiente. Selezione del campione viene eseguita dopo aver verificato la documentazione medica. La diagnosi si basa sull'American College of Rheumatology 1990 criteri che richiede che i soggetti compiono 3 di 5 domini: età > 50 anni, nuova cefalea, tenerezza dell'arteria temporale, un tasso di sedimentazione dell'eritrocito > 50 mm/ora dal metodo Westergren e una scheda anormale. Per sicurezza, guanti di protezione devono essere indossati in ogni momento nel maneggiare i campioni, prodotti chimici e gli anticorpi.
- Dai blocchi incorporati, tagliare sezioni spesse 4-5 µm, utilizzando un microtomo. e macchia con ematossilina ed eosina (H & E). Utilizzare una sezione di controllo del tessuto normale selezionato per garantire la qualità.
- Galleggiante di tagliare sezioni su un bagno di acqua calda riscaldata a 40 ° C per rimuovere le grinze e pick up con una diapositiva microscopica di vetro rivestito. Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
- Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
- Montare 3 sezioni su vetrini da microscopio.
- Mettere i vetrini in un rack verticale e asciugare durante la notte a 37 ° C per 24 h.
- Mettere i vetrini in un contenitore e conservare a 4 ° C.
2. Immunohistochemical preparazione, deparaffinazione, ricupero dell'antigene e la macchiatura15,18,19,20
- Caricare diapositive in un portavetrini. Eseguire il rack attraverso piatti come segue: due volte in xilene 100% per 5 minuti con 10 secondi di agitazione delicata ogni 30 secondi, una volta in etanolo al 100% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 90% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 70% con agitazione di 10 secondi , e due volte nel doppio distillata H2O con agitazione di 10 secondi.
Nota: Gestione di acetone e xilene deve essere eseguita in cappucci ventilati per evitare l'inalazione e tossicità respiratoria. - Recuperare l'antigene trasferendo il rack in un contenitore di vetro con 200 mL di 10 mmol/L, tampone a pH 6.0 citrato preriscaldata a 95 ° C. Impostare il timer per 30 minuti a bagnomaria, poi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti, poi sciacquare con acqua corrente per 5 minuti.
- Rimuovere attività perossidasica endogena incubando in 200 mL di perossido di idrogeno 3% per 10 minuti. Lavare i vetrini 3 volte in 200 µ l di soluzione salina tamponata (TBSS).
- Rimuovere le diapositive dal rack e tamponare ciascuno delicatamente per strofinare il tampone in eccesso. Per la colorazione, aggiungere 200 µ l dei seguenti anticorpi primari, aggiungere vetrini su vetrini e incubare in camera umida a temperatura ambiente per 1 ora:
Anticorpo anti-FRB diluito 1: 800
Monoclonale murino anti-umano CD68, diluizione 1: 200
Diluizione 1: 100 di policlonale di coniglio anti-CD3
Nota: Sezioni di paraffina-incastonato formalina-fisso della placenta sono stati anche trattati come descritto nella procedura 2.1 a 2,9 e incubate con anti-FRB18 e utilizzati come controllo positivo. Risultati della colorazione sono state ottenute trovando la concentrazione ottimale dell'anticorpo ed interpretata dalla titolazione l'anticorpo in diluizioni doppie (es. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1600). - Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBSS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione di anticorpo secondario contenente anticorpo secondario biotinilato Anti-coniugato/Mouse per reagire con l'anticorpo primario non coniugata legata all'antigene del tessuto. Posizionare le lamelle su diapositive e incubare in camera umida per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 µ l di diaminobenzidina (DAB) + tampone substrato (imidazolo HCl)-sistema cromogeno e incubare per 10 minuti per visualizzare il modello di macchiatura. Lavare con TBSS poi in acqua corrente per 10 minuti.
- Colorante di contrasto con ematossilina per 3 minuti.
- Montare le diapositive applicando 70 µ l di soluzione di montaggio sulla superficie del vetrino. Lentamente il suggerimento per il coprioggetto sul supporto di montaggio ed evitare la creazione di bolle e verso il basso in posizione. Attendere 24 ore per asciugare.
3. istopatologico e analisi immunoistochimica (IHC)
Esaminare la H & E e IHC macchiato sezioni da soggetti di GCA positivi e normale utilizzando un microscopio ottico.
-
Per la H & E sezioni colorate:
- Valutare l'architettura vascolare e identificare le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nel mezzi di tunica e fibroblasti e vasa vasorum della tunica avventizia21,22.
- Identificare le caratteristiche di GCA, che comprendono dei linfociti e l'infiltrazione del macrofago/del histiocyte, iperplasia cellulare e la degradazione di lamina elastica interna.
- Analizzare l'infiltrazione lymphohistiocytic per identificare e quantificare il numero di macrofagi rispetto i linfociti. Valutare l'entità della rottura della lamina elastica interna e iperplastiche nella cellule residenti e confrontare con i controlli.
-
Per l'IHC sezioni colorate:
- Esaminare il modello di macchiatura di FRB, prendendo atto della sua espressione di un determinato tipo o tipi di cellule e la sua distribuzione all'interno degli strati vascolari e la sua relazione per l'infiltrazione totale immune, l'indicatore del macrofago totale, anti-CD68 e la padella marcatore del linfocita anti CD3.
- Quantificare l'espressione delle cellule FRB, CD68 e CD3 contando le cellule marcate positivamente il 10 più campi selezionati in modo casuale ad alta potenza (hpf) e registrare i mezzi.
Nota: Identificazione di queste cellule normali e patologiche e le strutture sono state eseguite da un patologo cardiovascolare certificato (J.M.) e reumatologo (SAA) e i risultati sono stati registrati per tutti i casi. - Catturare immagini rappresentative utilizzando una fotocamera digitale.
Nota: Dopo questi passaggi, i restanti aliquote possono essere conservati a-80 ° C.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Risultati istopatologici
La H & E macchie in anatomia arteriosa normale dimostrata di esemplari normali con le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nella tunica media, e una matrice di collagene eterogenea che fibroblasti e vasi dell'alimentatore sono chiamati vasa vasorum nel adventitia di tunica. Non c'è nessun infiltrato infiammatorio identificato. Arterie temporali positive GCA...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
GCA è la vasculite più comune negli adulti, e relativo marchio di garanzia patologico esemplifica una potente combinazione di linfociti T helper e macrofagi che possono essere trovati anche in altre malattie granulomatose o vasculopatie come sarcoidosi attivati e granulomatosa polyangiitis2,3. Nel GCA, l'arteria temporale fornisce una buona rappresentazione di un'arteria di dimensione medio-grandi e la biopsia TA dà un esempio considerevole che possa essere memor...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato reso possibile dal supporto del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, il divisione di reumatologia/dipartimento di medicina e molecolare e istopatologici Core laboratorio, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microtomo | Reichert-Jung | ||
| vetrini per microscopio lisci e smerigliati | Fisher Scientific | ||
| Cremagliera verticale | Fisher Scientific | ||
| Microscopio ottico | Microscopio Olympus BX60 | ||
| Xilene | |||
| Acetone in acqua | concentrazioni 100%, 90%, 70% | ||
| Soluzione salina tamponata con tris (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| Perossido di idrogeno al 3% in TBS | |||
| Diaminobenzidina (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Supporto di montaggio | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% soluzione alcolica Fisher | Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM acido citrico monoidrato (pH 6,0) | |||
| Recettore anti-folato di coniglio policlonale beta | Manohar Ratnam | ottimizzato a 1:800 | |
| Topo monoclonale anti-umano CD68 | Dako | M071801 | ottimizzato a 1:200 |
| Coniglio policlonale anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | ottimizzato a 1:100 |
| Polimero capra anticorpo secondario coniglio/topo | Dako | ||
| Tessuto | per controllo positivo FRB |
Riferimenti
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13(2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
