Articolo metodologico

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

DOI:

10.3791/58735

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7 gennaio 2019

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1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.

Abstract

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Quantificazione di proteine di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è importante negli studi clinici e applicazioni di ricerca. Un metodo ottimale di quantificazione è accurato, ha un'ampia gamma dinamica lineare e mantiene l'integrità strutturale del campione per consentire per l'identificazione dei tipi di cella singola. Attuali metodi quali immunohistochemistry (IHC), spettrometria di massa e immunoblotting ciascuno non riescono a soddisfare queste stipulazioni dovuto la loro natura categoria o bisogno di omogeneizzare il campione. Come metodo alternativo, proponiamo l'uso di immunofluorescenza (IF) e analisi dell'immagine per determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in tessuti FFPE. Qui dimostriamo che questo metodo è facilmente ottimizzato, produce un'ampia gamma dinamica e linearmente quantificabile rispetto il gold standard di immunoblotting quantitativa. Inoltre, questo metodo consente il mantenimento dell'integrità strutturale del campione e per la distinzione dei vari tipi di cellule, che può essere cruciale in applicazioni diagnostiche. Nel complesso, questo è un metodo affidabile per la quantificazione relativa delle proteine in campioni FFPE e può essere facilmente adattato per soddisfare le cliniche o esigenze di ricerca.

Introduzione

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La necessità di quantificare le proteine nei campioni di biopsia di tessuto (FFPE) da formalina-fisse, paraffina-incastonato esiste in molti campi clinici. Ad esempio, quantificazione delle proteine di biomarcatore negli esemplari di biopsia di routine è usato per delucidare la prognosi e informare il trattamento per cancro pazienti1. Tuttavia, gli attuali metodi sono in genere soggettivi e mancano di convalida.

Immunohistochemistry (IHC) è usato ordinariamente nei laboratori di patologia e generalmente dipende da un anticorpo primario direzionati alla proteina bersaglio e un anticorpo secondario coniugato con un'eti....

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Protocollo

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Approvazione di utilizzare campioni di tessuti umani primari è stata ottenuta dalla Health Sciences e affiliati ospedali d'istruzione ricerca etica Board (HSREB) presso l'Università della Regina.

1. costruzione di un linea cellulare Tissue Microarray (TMA)

  1. Raccogliere e lavare le cellule.
    Nota: Questo protocollo è stato testato su varie linee cellulari immortalizzate stabilizzate (per esempio HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Per le celle aderenti, raccolto circa 1.3 x 107 cellule una volta che raggiungono circa confluency di 80%. Staccare le celle utilizzando un reagente appropriato per tale linea cellulare.<....

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Risultati

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Questo protocollo è stato usato per confermare la possibilità di se per determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2 nelle linee cellulari realizzati in blocchi di tessuto FFPE. Bcl-2 quantificare selettivamente nelle cellule tumorali può delucidare i meccanismi oncogenici e può essere utile nella diagnosi patologica e nell'informare le decisioni di gestione clinica24. Più specificamente, Bcl-2 svolge un ruolo nel corretto sviluppo dei linf.......

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Discussione

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Abbiamo descritto un metodo che fa uso di quantitativi immunoblotting (IB) per dimostrare l'utilità di immunofluorescenza (IF) per accertare l'abbondanza relativa di una proteina dell'obiettivo nei campioni di tessuto FFPE. Attuali metodi di quantificazione della proteina sono limitati nella loro natura categorica, come cromogenico IHC2,3, o dalla necessità di omogeneizzare campioni, impedendo di indagine nelle popolazioni delle cellule e la struttura del campion.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Fredrick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
697DSMZACC 42Linea cellulare
JeKo-1ATCCCRL-3006Linea cellulare
JurkatATCCTIB-152Linea cellulare
RCH-ACVDSMZACC 548Linea cellulare
Granta-519DSMZACC 342Linea cellulare
REHDSMZACC 22Linea cellulare
RajiLinea cellulare ATCCCCL-86
HeLaATCCCCL-2Linea cellulare
Soluzione di tripsina/EDTAInvitrogenR001100Per il distacco di cellule adesive
Siero bovino fetale (FBS)Wisent Inc.81150Per neutralizzare la tripsina
Formalina tamponata neutraProtocollo245-684Per il fissaggio di pellet cellulari
Agarosio ultrapuro a basso punto di fusioneInvitrogen15517-022Per colata di pellet cellulari
Anticorpo monoclonale di topo anti-umano Bcl-2, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Per rilevare Bcl-2 mediante immunofluorenzienza e immunoblot (lotto#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Perl'automazione della colorazione in immunofluorescenza
EnVision+ System- Polimero marcato HRP (anti-topo)Dako (Agilent)K4000Per l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza
EnVision+ System- Polimero marcato HRP (anti-coniglio)Dako (Agilent)K4002Per l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza
Cianina 5 reagente tiramidePerkin ElmerNEL745001KTPer l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Pervisualizzare i vetrini scansionati Software
analisi delle immagini HALOIndica Labs-Perimmunofluorescenza
(cocktail di inibitori della proteasi Halt, 100X)Thermo Scientific1862209 tampone RIPA
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)BioShopEDT001Per tampone RIPA
NP-40BDH Limited56009Per tampone RIPA
Desossicolato di sodioSigma-AldrichD6750Per tampone RIPA
GliceroloFisherBiotechBP229Per tampone Laemlli
Blu bromofenoloBioShopBRO777Per tampone Laemlli
Ditiotreitolo (DTT)Bio-Rad161-0611Per tampone Laemlli
Albumina sierica bovina (BSA)BioShopALB001Per lavaggi immunoblot
Scala proteica (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Per gel proteico da corsa
Carta da filtro (carta per macchie extra spessa)Bio-Rad1703969Per tamponamento trasferimento
Membrana in nitrocellulosaBio-Rad162-0115Per il trasferimento di blotting
Cella di trasferimento semi-secca Trans-blot SDBio-Rad1703940Per il trasferimento semisecco
Latte scremato in polvere (latte in polvere scremato)Tecnologia di segnalazione cellulare9999SPer tampone di blocco
Tween 20BioShopTWN510Per tampone di lavaggio
GAPDH coniglio anticorpo monoclonaleEpitomics2251-1Anticorpo primario della proteina di controllo (lotto#: YE101901C)Anticorpo
IgG anti-topo di capra (coniugato HRP)abcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Anticorpo secondario per immunoblot Anticorpo
IgG anti-coniglio di capra (coniugato HRP)abcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Anticorpo secondario per immunoblot (lotto#: GR3192725-5)
Clarity Western Substrati ECLBio-Rad1705060Per il rilevamento del segnale immunoblot
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Per il rilevamento del segnale immunoblot
SoftwareImageJ Freeware, NIH-Perl'analisi densitometrica
di la quantificazione degli inibitori della proteasi in

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A.

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Immunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

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