Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.
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Articolo metodologico
Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ispirato a Homer´s Trojan horse mito, abbiamo progettato il patogeno mais Ustilago maydis per trasportare proteine secrete nel mais apoplasto permettendo l'analisi fenotipica in vivo. Questo metodo non si basa sulla trasformazione mais ma sfrutta genetica microbica e capacità secretiva di agenti patogeni. Nel presente documento, esso permette di ispezione di in vivo consegnato proteine secrete con alta risoluzione spazio-temporale a diversi tipi di siti d'infezione e tessuti. La strategia di Trojan horse possa essere utilizzata per integrare transitoriamente mais fenotipi di perdita-de-funzione, per caratterizzare funzionalmente domini proteici, per analizzare gli effetti della proteina fuori bersaglio, o per studiare l'iperdosaggio proteina-gioco, che lo rende un potente strumento per studi della proteina nel sistema raccolto del mais. Quest'opera contiene un protocollo preciso su come generare un ceppo di Trojan horse seguito da protocolli standardizzati infezione per applicare questo metodo a tre tipi di mais differenti del tessuto.
Introduzione
L'agente patogeno biotrophic Ustilago maydis è l'agente causativo del mais smut malattia1. Essa colpisce tutte le parti aeree di mais con conseguente grandi tumori che contengono spore melanized, nero. A livello globale, U. maydis è stimata per causare una perdita annua di circa il 2% di rendimento di mais, mentre i tumori sono apprezzati come una prelibatezza gastronomica in Messico. Infezione di pianta è iniziata da un appressorium che secerne enzimi lisante parete cellulare per penetrare il primo strato di cellule epidermiche mais. Da un sito di infezione primaria, U. maydis cresce intracellulare e intercellularmen....
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Protocollo
1. costruzione di un U. maydis Trojan Horse
Nota: Vedere la Figura 1.
- Amplificare un gene di interesse da mais cDNA usando gli iniettori di gene-specific e una rilettura della polimerasi del DNA. Clonare il principale prodotto di PCR e trasformare il costrutto in e. coli seguendo le istruzioni del fornitore del plasmide. Verificare il gene corretto della sequenza di interesse dal Priore di sequenziamento Sanger da utilizzare per i prossimi passi di clonazione.
Nota: PCR specifiche devono essere ottimizzati a causa delle specificità di seq....
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Risultati
Costrutti per U. maydis Trojan horse esperimenti sono clonati nel plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene di interesse-mCherry-Ha. Il mais gene di interesse è fusa ad un reporter di fluorescenza mCherry e un epitopo HA-tag. L'espressione della proteina di fusione è sotto il controllo del promotorepit2 U. maydis Um che specificamente si attiva durante l'infezion.......
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Discussione
Ricerca di coltura moderna richiede protocolli per l'analisi molecolare sulla genetica e i livelli della proteina. Accessibilità genetica tramite trasformazione non è disponibile o inefficiente e richiede molto tempo per la maggior parte delle specie coltivate come il mais. Inoltre, affidabili strumenti genetici quali sistemi reporter promotore sono scarse, che rende difficile studiare la funzione della proteina in situ con alta risoluzione spazio-temporale a siti di tessuto distinti. Apoplastico proteine posson.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand per la fornitura di materiale di laboratorio spazio e pianta. L'opera originale sul metodo Trojan horse era sostenuto da una borsa postdoc Leopoldina e progetto NSF IOS13-39229. Il lavoro presentato in questo articolo è stato supportato da SFB924 (progetti A14 e B14) del DFG.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 2 ml | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 ago ipodermico | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA da mais | da tessuto di mais che esprime il gene dell'interrest | ||
| Carbone | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Microscopio | utilizzare attrezzature disponibili localmente | ||
| Cuvetta (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubatrice-agitatore impostato a 28 ° C, 200 giri/min | utilizzare l'attrezzatura disponibile localmente | ||
| Microscopio ottico con ingrandimento | utilizzare l'attrezzatura disponibile | ||
| localmenteNco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | si prega di contattare l'autore corrispondente | ||
| Pipetta Pasteur (vetro, punta lunga) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | può essere sostituita con altri vettori di clonazione di base come pENTR o pJET |
| Destrosio di patata Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | utilizza apparecchiature disponibili localmente | ||
| Spettrofotometro | utilizza apparecchiature disponibili localmente | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligasi | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| em>Xba I | NEB | R0145 | |
| Estratto di lievito | BD | 212750 |
Riferimenti
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Jour....
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Ristampe e permessi
