Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

Summary

Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell'impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell'effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.

Abstract

L'HIV rimane incurabile a causa dell'esistenza di un serbatoio di cellule che nutre forma stabile e latente del virus, che rimane invisibile al sistema immunitario e non è mirato dall'attuale terapia antiretrovirale (cART). Trascrizione e splicing sono stati indicati per rafforzare la latenza di HIV-1 nelle cellule T CD4 + di riposo. Inversione di latenza mediante l'uso di agenti di inversione di latenza (LRA) nell'approccio "shock and kill" è stata studiata estesamente nel tentativo di eliminare questo serbatoio ma finora non ha dimostrato alcun successo negli studi clinici a causa della mancanza di sviluppo di piccoli adeguato molecole che possono perturbare in modo efficiente questo serbatoio. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per attendibilmente ed efficientemente valutare gli agenti di inversione di latenza (LRA) sulla trascrizione di HIV e giunzione. Questo approccio si basa sull'uso di un reporter di doppio colore LTR-driven che consente di misurare contemporaneamente l'effetto di un LRA sulla trascrizione e splicing tramite flusso cytometry. Il protocollo descritto qui è adeguato per le celle aderenti, come pure le cellule in sospensione. È utile per il testing di un gran numero di farmaci in un sistema di alta velocità di trasmissione. Il metodo è tecnicamente semplice da implementare ed economicamente vantaggiosa. Inoltre, l'uso di citometria a flusso permette la valutazione di attuabilità delle cellule e così droga tossicità allo stesso tempo.

Introduction

Nonostante la terapia antiretrovirale a lungo termine efficace HIV persiste in uno stato latente come un provirus integrato in memoria di cellule T CD4 +¹. La struttura della cromatina del HIV-1 5' promotore di ripetizione terminale lunga (litro) e modificazioni epigenetiche come metilazione dell'istone e deacetilazione di methyltransferases del DNA (DNMT) e istone deacetilasi (HDAC) sono importanti meccanismi che conducono alla repressione trascrizionale e così post-integrazione latenza^2,3. Una grande varietà di agenti inversione di latenza (LRA) è stata studiata per la loro efficacia ....

Protocol

Nota: Procedure per la clonazione, trasformazione e sequenziamento sono discussi altrove^18,19. I protocolli qui iniziano dalla trasfezione di vettori di espressione mammifera (Figura 3).

1. transfezione delle cellule HEK293T con doppio colore Reporter costruire

1. Coltivare le cellule HEK293T nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL) in un 5% CO₂ incubatore a 37 ° C. Dopo lo scongelamento, gli esperimenti d....

Results

Risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 5 per l'espressione di HIV-1 unspliced (EGFP) e impiombato (DsRed) prodotti dopo il trattamento con l'inibitore bromodomain JQ1. Sia JQ1(+) e Tat ha aumentato significativamente la percentuale di cellule che esprimono EGFP (2.18 e 4.13 FC sopra DMSO rispettivamente; n = 3) indicativo di unspliced trascrizioni. Inoltre, JQ1(+) aumentato significativamente la percentuale di cellule esprimenti DsRed (46,6 FC.......

Discussion

Data la difficoltà nel misurare la riattivazione del virus ex vivo, una vasta gamma di in vitro sono stati sviluppati modelli nel tempo al fine di studiare la latenza di HIV tra cui latente infettato linee a cellula T (J-Lats, ACH2, U1), modelli primari dell'infezione latente di riposo ( Modelli o ' Doherty, Lewin, Greene e Spina) o pre-attivato le cellule T CD4 + (Serafini, Marini, Planelles, Siliciano, modelli di Karn) con singolo turno o replica competente reporter virus²². Per modellare le con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
HEK293T (cellule renali embrionali umane)	ATCC	CRL-3216	Replica i vettori che trasportano la regione di replicazione SV40.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4,5 g/L D-glucosio + 110 mg/L Piruvato di sodio
Fetale Siero bovino	Gibco	10099-141	Origine Australia
Penicillina-Streptomicina	Sigma	P4458
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-136
Trypan blue Stain, 0,4%	Gibco	15250
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Gibco	25300054
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente di trasfezione lipidica
Opti-MEM I (1x) terreno sierico ridotto	Gibco	31985-070	Terreno privo di siero
NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
Clontech	(TaKaRa)	6085-1	Espressione di EGFP in cellule di mammifero, promotore CMVIE.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Espressione di DsRed-Express in cellule di mammifero, promotore CMVIE.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 1 μ M
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 1 μ
M Phorbol Myristate Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Stock a 100 μ g/mL in DMSO; concentrazione di lavoro 10 nM
Fitoemoagglutinina (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Stock a 1 μ g/μ L in PBS; concentrazione di lavoro 10 μ g/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 0,5 μ M
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Mycoplasma Detection Kit, basato su
PCRName	Company	Numero catalogo	Comments
Reagenti per citometria a flusso
LSR Fortessa	BD Biosciences		Citometro a flusso (4 laser: blu, rosso, viola e giallo)
LSR II Bd	Biosciences Citometro		flusso (3 laser: blu, rosso e viola)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34976	Colorante di vitalità: per eccitazione a 633 o 635 nm, 400 saggi. I componenti A e B sono entrambi forniti nel kit.
Albumina sierica bovina	Sigma	A2153
EDTA 0.5M pH8	Gibco	15575-038
Soluzione di formaldeide 37/10 (37%)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS& T Research Beads	BD Biosciences	655050	Perline di calibrazione
Sphero Rainbow Particelle di calibrazione (8 picchi)	BD Biosciences	559123	3,0 - 3,4 mm
Soluzione di guaina	Chem-Supply	SA046	90 g NaCl in 10 L di acqua
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Compresse per rilascio di cloro per la disinfezione
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Detergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro Decon 90 5%.
Ipoclorito di sodio (soluzione al 12-13%)	Labco	SODHYPO-5L	Detergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro candeggina 1%.
7x	MPBio	IM76670	Detergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro 7x 1%.
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Materials
Flaconi per coltura tissutale (75 cm2, collo inclinato, tappo ventilato)	Corning	430641U
Piastre per coltura tissutale (fondo piatto da 96 pozzetti con coperchio)	Costar	3599
Piastre per coltura tissutale (96 pozzetti V-bottom senza coperchio)	Costar	3896
Provette da centrifuga (10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Provette da centrifuga (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Provette per microcentrifuga (1,5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Sierologico Pipetta (25 mL), pipetta sierologica sterile	Corning	CLS4489-200EA
(10 mL), pipetta sierologica sterile	Corning	CLS4488-200EA
(5 mL), serbatoi di	Corning	CLS4487-200EA
(50 mL),	Corning	CLS4470-200EA
in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con tappo per filtro	cellulare Corning	352235	12 x 75 mm, rete di nylon da 70 mm
	SEFAR	03-100/32	100 mm
Micro provette,	BIO-RAD	2239391	provette microfacs sfuse Provette
5 mL in polistirene a fondo tondo, senza tappo	Corning	352008	12x75 mm
Tappi a scatto per provette da 12x75 mm	Corning	352032
Camera di conteggio, Neubauer improved double net ruling, linea chiara (Emocitometro, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 quadrati grandi da 1 mm2; Profondità 0,100 mm; volume 0,1 mL; area minima 0,0025 mm2
Vetrini coprioggetti (Menzel-Glä Microscopio	Grale Scientific	HCS2026	20 x 26 mm
	Nikon TMS	310528
Centrifuga 5810R refrigerato	Eppendorf	5811000487	con rotore A-4-81 inclusi adattatori per provette coniche da 15/50 mL
Lettore di micropiastre FLUOstar Omega	BMG Labtech	N/A	Lettore di piastre per saggi di proliferazione cellulare. Filtro 490 nm.
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Programma di acquisizione e analisi dei dati del citometro a flusso, versione 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Programma di analisi dei dati del citometro a flusso, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar controllo lettore multiutente, versione 5.11
Omega - Analisi dei dati	BMG Labtech	MARS	Analisi dei dati FLUOstar, versione 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel:mac 2011	versione 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	versione 7.0c