Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.
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Articolo metodologico
Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC) della sottofamiglia TRP canonica sono canali cationici non selettivi che svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi del calcio, voce negozio-funzionata specialmente del calcio, che è fondamentale per mantenere il corretto funzionamento del rilascio delle vescicole sinaptiche e vie di segnalazione intracellulare. Di conseguenza, canali TRPC sono stati implicati in una varietà di malattie umane, inclusi i disturbi cardiovascolari quali l'ipertrofia cardiaca, malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e disturbi neurologici come atassia spinocerebellar. Canali TRPC rappresentano quindi un potenziale bersaglio farmacologico in malattie umane. Tuttavia, i meccanismi molecolari del gating in questi canali sono ancora poco chiari. La difficoltà nell'ottenere grandi quantità di proteina purificata, omogenea e stabile è stata un fattore limitante negli studi di determinazione di struttura, particolarmente per le proteine di membrana dei mammiferi quali i canali ionici TRPC. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione su larga scala di proteine di membrana del canale dello ione dei mammiferi utilizzando un sistema di trasferimento del gene di baculovirus modificate e la purificazione di queste proteine di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Presentiamo inoltre un protocollo per raccogliere immagini di microscopia di singola particella cryo-elettrone dalla proteina purificata e utilizzare queste immagini per determinare la struttura della proteina. Determinazione della struttura è un metodo potente per la comprensione dei meccanismi di gating e funzione di canali ionici.
Introduzione
Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell'omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l'apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di E....
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Protocollo
1. trasformazione delle cellule competenti di DH10α per produrre Bacmid DNA
- Sintetizzare il gene di interesse e subclone esso in una versione modificata del vettore pEG contenente un doppia strep-tag, un His8-tag e GFP con un sito di clivaggio della trombina al capolinea (pFastBacI) N20.
- Trasformare cellule competenti con l'aggiunta di 5 ng di plasmide contenente un gene desiderato in pFastBacI a 50 μL di DH10α cellule in un 1,5 mL tubo e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Le cellule per 45 di scossa di calore s a 42 ° C. Aggiungere 200 μL di brodo super ottima con il mezzo di repressore catabolico (SOC) al tubo e incubare ....
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Risultati
Una descrizione schematica del protocollo per l'espressione e purificazione di hTRPC3 è mostrati in Figura 1A. Un'immagine della hTRPC3 bacmid piastra con colonie bianchi ideale, simile a quella selezionata per purificazione del DNA di bacmid, è mostrata in Figura 1B. Abbiamo trovato che 48 ore è ideale per la colorazione chiara Bluo-gal mantenendo la presenza di colonie isolate. Picco della produzione di virus P2 per hTRPC3, com.......
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Discussione
Determinazione strutturale delle proteine da cryo-EM ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle nuove telecamere e algoritmi che velocizza notevolmente la determinazione della struttura delle proteine che non prontamente cristallizzarsi, in particolare proteine di membrana. Nonostante tutti i recenti progressi nella tecnica di cryo-EM, la preparazione delle proteine purificate in qualità e quantità sufficiente per facilitare ad alta-qualità delle immagini spesso rim.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Si ringraziano G. Zhao e X. Meng per il supporto con raccolta di dati presso il David Van Andel Advanced Cryo-Electron microscopia Suite. Apprezziamo il team VARI High-Performance Computing per supporto computazionale. Noi diamo la nostra gratitudine a N. Clemente, D. debiti, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z per i commenti che ha notevolmente migliorato questo manoscritto. Si ringrazia D. Nadziejka per supporto editoriale per questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da interno VARI finanziamenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cellule | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | per la trasformazione di cellule DH10α per Bacmid |
| Piastre di coltura Bacmam | Teknova | L5919 | per la coltura di cellule DH10α |
| trasformate Agitatore di incubazione per cellule batteriche | Infors HT | Multitron standard | |
| Agitatore orbitale incubato per cellule di insetti | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubatore per cellule di mammifero | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Agitatore orbitale da tavolo | Thermo-Fisher | SHKE416HP | utilizzato nell'incubatore a CO2 Reach-in per cellule |
| di mammiferoIncubatore | VWR | 1535 | per piastre batteriche |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | per l'estrazione e la purificazione dei plasmidi |
| Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico | Invitrogen | 15593031 | per l'estrazione del DNA |
| Cellule Sf9 | Life Technologies | 12659017 | cellule di insetti per la produzione di |
| virus Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | terreno di coltura per cellule di insetto |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | per la trasfezione di cellule di insetti |
| lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-027 | per la trasfetzione di cellule mamaliane |
| per siringa da 0,2 mm | VWR | 28145-501 | per il filtraggio del virus P1 Palloni |
| filtranti da 0,2 mm 500ml resevoir | Corning | 430758 | per filtrare il virus P2 |
| pallone di coltura Erlenmeyer (fondo piatto 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | per la coltura di cellule di insetti |
| pallone di coltura Erlenmeyer (deflettore 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | per la coltura di cellule di mammifero |
| spettrofotometro nanodrop 2000 | Thermo-Fisher | ND-2000 | per la determinazione delle concentrazioni di DNA e proteine |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | cellule di mammifero per la produzione di proteine |
| Freestyle 293 espressione Medium | Gibco | 1238-018 | mezzi cellulari di mammifero per l'espressione proteica |
| Acido butirrico Sale di sodio | Acros | 263195000 | per amplificare l'espressione proteica |
| PMSF | Acros | 215740500 | inibitore della proteasi |
| Aprotinina dal polmone bovino | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | inibitore della proteasi |
| Leupeptin cloridrato | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | inibitore della proteasi |
| pepstatina A | Fisher Scientific | BP2671-250 | inibitore della proteasi |
| digitonina | EMD Millipore | 300410 | detergente - per solubilizzare le proteine dalla membrana |
| imidazole | Sigma | 792527 | per eluire la proteina dalla colonna di resina |
| Resina TALON | Clonetech | 635504 | per la purificazione di affinità con His-tag |
| superose6 colonne da incastro | GE | 29091596; 29091597 | per HPLC e FPLC |
| Sistema HPLC modulare Prominence | Shimadzu | Vedi sotto | |
| Modulo controller | " | CBM20A | |
| " | LC30AD | ||
| Rivelatore a fluorescenza | " | RF20AXS | |
| Autocampionatore con raffreddamento | " | SIL20ACHT | |
| Sistema FPLC puro con frazionatore | Trombina Akta | ||
| (alfa) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Alfa umano | per la scissione del tag GFP |
| Amicon Ultra 15 mL 100K tubo filtrante centrifugo | Millipore UFC910008 | per la concentrazione di proteine | |
| EDTA | Fisher | E478500 | per la stabilizzazione di proteine |
| 400 mesh griglie di rame rivestite di carbonio Ted | Pella Inc. | 01754-F | griglie per macchia negativa |
| Quantifoil griglia in carbonio forato (oro, 1.2/1.3 μ m dimensioni/spazio fori, 300 mesh) | Microscopia elettronica Scienze | Q3100AR1.3 | griglie per Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | per la preparazione di griglie di campioni mediante congelamento di etano liquido | |
| azoto liquido | Dura-Cyl | UN1977 | |
| gas etano | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | per la pulizia delle griglie prima Microscopio |
| elettronico Tecnai Spirit | FEI | per l'imaging EM con colorazione negativa | |
| Microsocope | elettronico FEI | per lo screening e l'imaging a bassa risoluzione di griglie Cryo-EM Microscopio | |
| elettronico Titan Krios | FEI | per l'imaging Cryo-EM ad alta risoluzione | |
| Software | |||
| Gautomatch | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | per prelevare particelle dalle micrografie, | |
| il software Relion 2.1 | https://github.com/3dem/relion | per costruire la classificazione 2D e 3D | |
| il software CryoSPARC | https://cryosparc.com/ | per generare un modello di struttura iniziale | |
| il software | Frealign | per perfezionare software | |
| Coot | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | per costruire un | |
| modello Software MolProbity | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | per valutare le geometrie del modello atomico | |
| Software SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | per l'acquisizione automatizzata di immagini seriali Software | |
| MortionCor2 | per la correzione del movimento di pile di filmati sommate Software | ||
| GCTF | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | per misurare i valori di sfocatura in pile di filmati | |
| Phenix.real_space_refine | Software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | per il perfezionamento dello spazio reale del modello 3D iniziale |
Riferimenti
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone se....
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Ristampe e permessi
