Articolo metodologico

Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

DOI:

10.3791/58761

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7 gennaio 2019

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1Department of Biology, Central Michigan University

In questo articolo

Sommario

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Analisi SEM sono un metodo efficace per aiutare nell'identificazione di specie o discriminazione fenotipica. Questo protocollo descrive i metodi per l'esame di specifici dettagli morfologici dei tre tipi rappresentativi di organismi e sarebbe ampiamente applicabile ad esaminare le caratteristiche di molti organismi e tipi di tessuto.

Abstract

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Microscopia elettronica (SEM) è una tecnica ampiamente disponibile che è stata applicata per lo studio di campioni biologici che vanno da singole proteine, cellule, tessuti, organelli e persino interi organismi. Questo protocollo si concentra su due metodi di essiccazione chimiche, esametildisilazano (HMDS) e alcol t-butilico (TBA) e loro applicazione all'imaging di organismi sia procarioti ed eucarioti utilizzando SEM In questo articolo, descriviamo come difficoltà, lavare, disidratare, asciugare, montare, polverizza il cappotto e tre tipi di organismi di immagine: cianobatteri (Toxifilum mysidocida, SP. Golenkina e an SP sconosciuto), due euglene dal genere Monomorphina (M. Enigmonia e M. pseudopyrum) e la Mosca della frutta (Drosophila melanogaster). Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un metodo veloce, economico e semplice per ottenere informazioni dettagliate sulla struttura, dimensioni e caratteristiche superficiali degli esemplari che possono essere ampiamente applicati a una vasta gamma di organismi per morfologica valutazione. Completamento del presente protocollo permetterà ad altri di utilizzare SEM per visualizzare esempi di applicazione di queste tecniche al loro sistema.

Introduzione

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Un microscopio elettronico a scansione (SEM) usa un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia per generare un'immagine da elettroni secondari che mostra la morfologia e topografia di un campione1. SEM può essere utilizzato per determinare direttamente la dimensione fisica di un campione, la struttura della superficie e la forma tridimensionale e offre una risoluzione maggiore e maggiore profondità di campo rispetto alla microscopia. Un'altra forma di microscopia elettronica (EM), microscopia elettronica a trasmissione (TEM) utilizza concentrati gli elettroni che passano attraverso il campione, generando le immagini con dettagli raffinati ....

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Protocollo

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1. preparazione e la fissazione

  1. Preparare i cianobatteri.
    1. Coltivare colture unialgali in F/2 media24,25 ad una temperatura di 28 ° C su un 14:10 h ciclo scuro della luce. Trasferire cultura sufficiente in una microcentrifuga da 1,5 mL, in modo che dopo 15 min di stabilirsi, il pellet batterico è circa 0,05 mL di dimensioni. Rimuovere il supporto e sostituire con 1,5 mL di fissativo (1,25% glutaraldeide, 0.1 M tampone fosfato pH 7.0), delicatamente capovolgendo e incubare per una notte a 4 ° C.
    2. Trasferire le cellule fisse con una pipetta di vetro in un impianto di filtrazione di 10 ....

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Risultati

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I cianobatteri sono un procariotico gruppo di organismi che sono fondamentali per il globale del carbonio, ossigeno e azoto cicli28,29. Di circa 6000 specie di cianobatteri30, la maggior parte hanno una guaina mucillaginosa che coprono e collegare insieme le cellule e ad altre strutture31, che, insieme con la forma, può essere risolto microscopicamente32. Dime.......

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Discussione

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Qui abbiamo descritto un protocollo utilizzando SEM per ottenere informazioni dettagliate sulle caratteristiche morfologiche esterne di tre tipi di organismi che gli altri possono applicare per esaminare le caratteristiche di molti tipi di organismi o tessuti. All'interno di ogni passaggio del protocollo, ci sono potenziali punti di errore che possono verificarsi e sono discussi in dettaglio di seguito.

Mentre i volumi per il fissativo e lavaggi dati qui sono specifici, in generale il fissativ.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione per MLS e un estate Scholar Award a MAK dal ufficio di ricerca e studi universitari presso l'Università centrale del Michigan. I cianobatteri sono stati forniti dal Zimba e laboratorio di plancton, parte del centro per studi costieri, Texas A & M University al Corpus Christi. Euglene sono stati forniti dal laboratorio Triemer, Michigan State University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
oro– palladioTed Pella, Inc.91212
Adesivo conduttivo argento 503Scienze della microscopia elettronica12686-15
Membrane incise su traccia di nuclepori Whatman; diametro 25 mm, dimensione dei pori 8 μ m, policarbonatoSigmaWHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched membranes; diametro 25 mm, dimensione dei pori 0,8 μ m, policarbonato, neroSigmaWHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched membranes; diam. 25 mm, dimensione dei pori 0,2 μ m, piattoin alluminio SigmaWHA110606
 Fisher Scientific08-732-100
Barre di montaggio in alluminio (12 mm)microscopia elettronicaSciences 75210
(25 mm)microscopia elettronica75186
 Microscopia elettronica Scienze76760
linguette adesive in carbonio conduttivo Scienzemicroscopia elettronica77825
F/2 mediaCollezione di alghe presso l'Università del Texas ad Austinhttps://utex.org/products/f_2-mediumNessun numero di catalogo fornito - vedi link 
AF6 mediaBigelow - Centro Nazionale per le Alghe Marin eil Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdfNessun numero di catalogo fornito - vedi link 
Terreno acqua mediaCarolina Biological Supply Company153785
Polietilenglicole terz-ottilfenile etere (Triton X-100)VWR97062-208
Hummer 6.2 Sputter CoaterAnatech USAhttp://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4Nessun numero di catalogo fornito - vedi link 
Hitachi 3400N-II SEM Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		Sembra che l'azienda non venda più questo modello 
di pesatura in policarbonatoBarre di montaggio in alluminio per Linguette adesive per della

Riferimenti

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  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F.

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