Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.
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Articolo metodologico
Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunoterapia è diventata un campo di crescente interesse nella lotta contro il cancro altrimenti intrattabile. Tra tutti i metodi immunotherapeutic, recettore chimerico antigene (auto) Reindirizzamento cellule T ottenute i risultati più spettacolari, in particolare con la leucemia linfoblastica acuta B pediatrica (B-ALL). Metodi di convalida classica delle cellule di T auto si basano sull'uso di specificità e test di funzionalità delle cellule T auto contro le cellule bersaglio in sospensione e in modelli di xenotrapianto. Purtroppo, le osservazioni fatte in vitro spesso sono disaccoppiate dai risultati ottenuti in vivo e un sacco di fatica e animali potrebbe essere risparmiato con l'aggiunta di un altro passo: l'uso della cultura 3D. La produzione di sferoidi fuori potenziali cellule bersaglio che imitano la struttura 3D delle cellule del tumore, quando essi sono innestate nel modello animale rappresenta l'alternativa ideale. Qui, segnaliamo un metodo conveniente, affidabile e facile da produrre sferoidi da una linea cellulare colorettale trasdotte come uno strumento di convalida per la terapia cellulare adottiva (esemplificato qui dalle cellule di T auto CD19). Questo metodo è accoppiato con un avanzato sistema di imaging dal vivo che possa seguire la crescita della sferoide, effettrici cellule apoptosi delle cellule del tumore e citotossicità.
Introduzione
Trasferimento adottivo di cellule (ACT) rappresenta il trattamento di cancro di generazione successivo. Essa si basa sull'iniezione di cellule effettrici (T - o cellule NK) in un paziente. Queste cellule possono essere geneticamente modificate con un recettore che li guiderà alla loro destinazione, il tumore e distruggerlo. Recentemente questo approccio è stato indicato per essere fattibile quando un recettore chimerico antigene (auto) diretto contro il marcatore di cellule B CD19 è stato introdotto nelle cellule del paziente T per uccidere il suo cancro1. Nel caso di auto, che è un recettore artificiale, il disegno consiste di frammenti antico....
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Protocollo
1. generazione di sferoidi dalla linea cellulare di cancro colorettale
- Monostrati di cellule umane lavare HCT 116 (stabilmente transduced per esprimere Cluster di differenziazione 19 (CD19) e proteina di fluorescenza verde (GFP)) con fosfato tampone salino (PBS; 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un pallone da2 di 75 cm). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un pallone da2 di 75 cm) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
- Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare enzima di dissociazione della cellula con terreno di Roswell Park Memorial Institute 160 completo (R....
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Risultati
Come si può vedere nella Figura 1, è fondamentale controllare tramite flusso cytometry il livello di espressione di CD19 auto sulle cellule di T (Figura 1A) e il livello di CD19 su linee cellulari tumorali di HCT116 (Figura 1B). Figura 2 esemplifica il risultato di un esperimento tipico sferoide. L'apparato di imaging automatizzato prende le immagini in quattro diversi c.......
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Discussione
L'uso di sferoidi come strumento innovativo per convalidare il trattamento del cancro futuro è diventato un campo di crescente interesse negli ultimi anni. Sferoidi rappresentano un passaggio intermedio tra il classico 2D analisi in vitro e valutazione in vivo. Il metodo ulteriormente tiene un sacco di promesse per quanto riguarda la loro potenza in termini di che imita il micro-ambiente del tumore così come gene profiling7. Il protocollo presentato in questa pubblicazione è stato adattato da sere.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Norwegian Research Council sotto sovvenzioni #244388, #254817 e #284983; l'associazione del cancro norvegese (n. 6829007); Il norvegese salute regione sud-est sotto Grant n. 17/00264-6 e #2016006.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | strong>Numero di lotto: RNBG7037 |
| 75 cm² palloni per area di crescita | VWR | 430639 | Numero di lotto: 2218002 |
| 75 cm² palloni per area di crescita | VWR | 734-2705 | Numero di lotto: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Numero di lotto: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutammina, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Numero di lotto: 1926384 |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10500064 | Numero di lotto: 08Q3066K |
| Gentamicina | Thermo Fischer | 15750060 | Numero di lotto: 1904924A |
| Soluzione blu di tripano, 0,4% | Thermo Fischer | 15250061 | Numero di lotto: 1886513 |
| Piastra a 96 pozzetti, fondo rotondo | VWR | 734-1797 | Numero di lotto: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D-X-VIVO | |
| 15 con gentamicina L-Gln, rosso fenolo, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Numero di lotto: 8MB036 |
| CTS Sostituzione del siero di cellule immunitarie | Thermo Fischer | A2596102 | Numero di lotto: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Numero di lotto: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Numero di lotto: 17A1025-122117 |
| Serbatoio reagente | VWR | 89094-672< | strong>Numero di lotto: 89094-672 |
| Provette da 15 mL | VWR | 734-1867 | Numero di lotto: 19317044 |
| anti-umano CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Numero di lotto: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotina-SP (spaziatore lungo) AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Numero di lotto: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Numero di lotto: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Linea di carcinoma colorettale | ATCC | CCL-247-Incucyte | |
| S3 | Essen Bioscience |
Riferimenti
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al.
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Ristampe e permessi
