Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.
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Articolo metodologico
Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunoterapia è diventata un campo di crescente interesse nella lotta contro il cancro altrimenti intrattabile. Tra tutti i metodi immunotherapeutic, recettore chimerico antigene (auto) Reindirizzamento cellule T ottenute i risultati più spettacolari, in particolare con la leucemia linfoblastica acuta B pediatrica (B-ALL). Metodi di convalida classica delle cellule di T auto si basano sull'uso di specificità e test di funzionalità delle cellule T auto contro le cellule bersaglio in sospensione e in modelli di xenotrapianto. Purtroppo, le osservazioni fatte in vitro spesso sono disaccoppiate dai risultati ottenuti in vivo e un sacco di fatica e animali potrebbe essere risparmiato con l'aggiunta di un altro passo: l'uso della cultura 3D. La produzione di sferoidi fuori potenziali cellule bersaglio che imitano la struttura 3D delle cellule del tumore, quando essi sono innestate nel modello animale rappresenta l'alternativa ideale. Qui, segnaliamo un metodo conveniente, affidabile e facile da produrre sferoidi da una linea cellulare colorettale trasdotte come uno strumento di convalida per la terapia cellulare adottiva (esemplificato qui dalle cellule di T auto CD19). Questo metodo è accoppiato con un avanzato sistema di imaging dal vivo che possa seguire la crescita della sferoide, effettrici cellule apoptosi delle cellule del tumore e citotossicità.
Introduzione
Trasferimento adottivo di cellule (ACT) rappresenta il trattamento di cancro di generazione successivo. Essa si basa sull'iniezione di cellule effettrici (T - o cellule NK) in un paziente. Queste cellule possono essere geneticamente modificate con un recettore che li guiderà alla loro destinazione, il tumore e distruggerlo. Recentemente questo approccio è stato indicato per essere fattibile quando un recettore chimerico antigene (auto) diretto contro il marcatore di cellule B CD19 è stato introdotto nelle cellule del paziente T per uccidere il suo cancro1. Nel caso di auto, che è un recettore artificiale, il disegno consiste di frammenti anticorpali specifici, l'antigene vincolante dominio ridotto a un frammento di variabile entità designata a singola catena (scFv), legata ai domini di segnalazione del T-cell. Anche se ci sono parecchi disegni, le versioni più comunemente usate di cui come seconda generazione auto disegni, costituito da CD3z per la segnalazione di TCR e un dominio di costimolazione (CD28, 4-1BB, OX40, ecc.) 1 , 2. il campo di immunoterapia diretto la maggior parte della sua attenzione a questa nuova forma di atto quando CD19 auto-T cellule trattate efficacemente numerosi pazienti con le malignità delle cellule di B3,4. Dopo questo successo, i ricercatori hanno cercarono di sfruttare i disegni simili prendendo di mira altri epitopi per tumori solidi con successo limitato. Purtroppo, la scarsità di antigeni specifici del tumore e le più severe microambienti di tumore resi auto T cellule meno efficace nei confronti di tumori solidi5.
Attualmente, le strategie di convalida più comunemente usato in vitro si basano su sistemi bidimensionali (2D) che interessano solo un frammento delle sfide già citato tumore solido. Classicamente, 2D in vitro sistemi coinvolgono una miscela delle cellule T auto e linee cellulari del cancro di destinazione come strati monomolecolari per valutare la funzionalità e la specificità di queste cellule effettrici. Anche se queste strategie sono parti importanti e vitali degli studi, non prendono in considerazione la complessa morfologia e struttura tridimensionale (3D) del cancro cellule6. Le cellule tumorali coltivate in sistemi 3D, definito come sferoidi, acquisiscono nuovi tratti fenotipici attraverso cambiamenti nel gene espressione profilo7, che possa influenzare il riconoscimento di cellule effettrici reindirizzata. Birgersdotter e colleghi hanno dimostrato che una linea cellulare di linfoma (HL) Hodgkin quando coltivata solo in un modello 3D cultura acquisisce un profilo di espressione genica che è simile al tumore primario campioni8. Di conseguenza, sferoidi o 3D simile cultura offerta di metodologie più pertinenti in modelli in vitro al contrario di sistemi 2D standard. Tali sistemi sono anche simili a studi in vivo, che sono visti come il passo finale nel processo di convalida di una determinata macchina. Considerando che i sistemi 2D non riescono a imitare la morfologia dei cluster di cancro, sferoidi offrono formazioni simili per valutare la funzionalità delle cellule di T auto prima di modelli in vivo. In uno studio, Pickl et al. identificato che un modello di sferoide del recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER2) che overexpressing le cellule tumorali hanno dimostrato profili simili segnalazione a modelli in vivo9. Questo ulteriore sostiene che sferoidi offrono più pertinenti e close-in vivo valutazione delle cellule di T di auto. Inoltre, convalida di auto T-cellula contro sferoidi potrebbe aiutare valutare la loro efficacia più criticamente e impedire alcuni dei disegni di trasferirsi in vivo gli studi prematuramente10; contribuendo in tal modo, alla ricerca eticamente interessato sacrificando meno animali. Inoltre, protocolli utilizzando sferoidi non sono più costosi rispetto ai classici sistemi 2D e molto più veloce rispetto alla classica in vivo studi. Presi insieme, si può prevedere che l'inclusione degli studi sferoide diventerà presto la pratica standard per collegare gli studi in vitro e in vivo.
Qui, presentiamo la preparazione di sferoidi dalla linea cellulare del cancro del colon HCT 116. Questa linea cellulare è stata modificata per esprimere la molecola CD19 umana rendono sensibile ai linfociti CD19 auto e fornire una chiara valutazione dell'uccisione mediante un costrutto auto clinicamente validato.
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Protocollo
1. generazione di sferoidi dalla linea cellulare di cancro colorettale
- Monostrati di cellule umane lavare HCT 116 (stabilmente transduced per esprimere Cluster di differenziazione 19 (CD19) e proteina di fluorescenza verde (GFP)) con fosfato tampone salino (PBS; 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un pallone da2 di 75 cm). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un pallone da2 di 75 cm) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
- Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare enzima di dissociazione della cellula con terreno di Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL per un 25 cm2 o 20 mL per un pallone da2 di 75 cm).
- Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere pipettando su e giù parecchie volte con 5 mL di terreno completo RPM1 1640.
- Contare le celle utilizzando esclusione in Trypan blue su un contatore di cellule compatibili.
- Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere in medium RPMI per ottenere 5 x 103 cellule/mL.
- Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e dispensare 200 µ l/pozzetto in un 96-pozzetto rotondo piastre inferiori usando una pipetta multicanale.
- Trasferire la piastra all'apparato di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).
- Accedere al software di acquisizione, selezionare Pianificazione per acquisire | Apri Aggiungi nave | Scansione il programma | Creare nave: nuovo.
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Selezionare il tipo di scansione: sferoide. Selezionare i canali di interesse: fase + campo chiaro (per seguire la crescita di sferoidi), verde (per seguire il segnale del tumore, tempo di acquisizione 300 ms) e rosso (per seguire l'apoptosi, acquisizione tempo 400 ms).
- Selezionare l'ingrandimento desiderato: 10x.
- Scegli il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto. Selezionare la posizione dei pozzi all'immagine. Immettere la descrizione dell'esperimento: nome, tipo di celle, numero di celle.
- Per la configurazione di analisi, selezionare Rinviare l'analisi fino a più tardi. Fare clic con il pulsante destro sulla timeline e selezionare opzione di Impostare l'intervallo del gruppo scansione selezionata e impostare aggiungere scansioni ogni a 4 h e per un totale di 24 h. impostare l'ora di partenza desiderata (almeno 1 h dopo incubazione nell'apparato imaging automatizzato).
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Verifica ogni 2 giorni per la crescita di sferoidi accedendo al software di imaging.
- Scegliere l'opzione Vista recenti scansioni e fare doppio clic sull'esperimento desiderata. Selezionare il campo chiaro nel pannello canali immagine e quindi utilizzare lo strumento di caratteristiche di immagine di misura per misurare il diametro di sferoidi. Ci vogliono 6 giorni per uno sferoide di raggiungere la dimensione desiderata: 0,5 mm di diametro. Aggiungere 50 µ l di terreno RPMI completo per pozzetto al giorno 4 per limitare l'effetto di evaporazione medio.
2. generazione di cellule CD19 auto T
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Espansione di cellule T auto CD19
Nota: L'espressione stabile di cellule CD19 auto T è stata acquisita da trasduzione retrovirale di massa del donatore sano PBMCs come descritto in precedenza16. Il costrutto retrovirale codificante per CD19 auto è una macchina di seconda generazione e consiste di fmc63 scFv catena, CD8 cerniera e dominio transmembrana, un dominio costimolatorie 4-1BB e, infine, un dominio CD3ζ.- Per espandere, cultura il trasdotte T cellule in presenza di anti-CD3/28 biglie magnetiche con una cella a rapporto perlina di 1:1 per 10 – 11 giorni. Durante l'espansione, le cellule sono in sostanza completa (X-VIVO 15, 5% sostituzione del siero e 100 U/mL ricombinante umano il-2).
Nota: La densità ideale per un'espansione efficiente è 1 a 2 x 106 cellule/mL. A seconda del numero iniziale, le cellule possono essere espansa in boccette (25cm2 beute a 20 mL, 75 cm2 beute a 40 mL di volume totale) in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità). - Come un gruppo di controllo negativo per i seguenti saggi, comprendono non trasdotte PBMCs (verrà denominata come Mock) del protocollo di espansione parallela alle cellule T auto CD19.
- Il giorno 3 in poi, aggiungete mezzo fresco ogni giorno e dividere le celle in matracci di cultura più se necessario.
- Giorno 10 – 11, cellule di centrifugare a 500 x g per 5 min, rimuovere il surnatante e combinare tutte le cellule in una provetta da 50 mL e risospendere le cellule in ~ 30 mL di fresco multimediale completo.
- Posizionare il tubo da 50 mL contenente le celle di sedimento su un supporto magnetico per separare i branelli magnetici da terreno di coltura.
- Attendere 2-3 min per le perline per raccogliere sul lato del tubo.
- Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta e trasferirlo in una nuova provetta senza toccare le zone di raccolta biglie magnetiche.
- Ripetere i passaggi per quanto riguarda la rimozione di tallone (2.1.5–2.1.7) ancora una volta a limitare il numero di perle in terreno di coltura finale.
- Risospendere e contare le celle, regolare la densità di 1 a 2 x 106 cellule/mL in terreno completo.
- Le cellule per almeno 4 ore fino a una notte di riposo. Quindi direttamente congelarli giù a-80 ° C e trasferire le fiale a un serbatoio di azoto liquido il giorno seguente per l'archiviazione a lungo termine. In alternativa, uno può prolungare il resto fino a una notte per un uso immediato.
- Per espandere, cultura il trasdotte T cellule in presenza di anti-CD3/28 biglie magnetiche con una cella a rapporto perlina di 1:1 per 10 – 11 giorni. Durante l'espansione, le cellule sono in sostanza completa (X-VIVO 15, 5% sostituzione del siero e 100 U/mL ricombinante umano il-2).
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Controllo di espressione di CD19 auto su cellule T primarie
- Contare il numero di cellule T espanse come i numeri potrebbero variare leggermente dopo una notte cultura o moderatamente dopo congelamento/scongelamento.
- Trasferire 5 x 105 celle da entrambi auto CD19 e Mock cellule T primarie per separare i tubi di citometria a flusso.
- Lavare le cellule con 200 μL di tampone di flusso (2% FBS in PBS) e centrifugare le provette a 500 x g per 5 min, ripetere i passaggi di lavaggio per sbarazzarsi di eventuali artefatti causati da terreno di coltura.
- Preparare l'anticorpo primario (biotina Goat Anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ frammento specifico) effettuando la diluizione 1: 200 nel Buffer del flusso.
- Risospendere le cellule in 100 μL di miscela di anticorpi per tubo e incubare in ghiaccio per 15 min. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio due volte per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
- Preparare l'anticorpo secondario (streptavidina-PE) come diluizione di 1: 400 nel Buffer del flusso.
- Risospendere le cellule in 100 μL di miscela di anticorpi per tubo e incubare in ghiaccio per 15 min. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio due volte per sbarazzarsi dell'anticorpo in eccesso.
- Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di flusso per tubo e analizzarlo su un citometro a flusso.
- Le cellule di T di Mock uso per impostare il cancello positivo e negativo e analizzare CD19 auto trasdotte cellule T di conseguenza.
3. 3D tumore sferoide uccisione Assay
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Dopo 6 giorni o una volta sferoidi raggiunge la dimensione desiderata, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Usando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 µ l/pozzetto di sostanza RMPI 1640 completa delle placche di sferoide.
- Per questo passaggio, angolo le punte verso l'interno muro della piastra 96 pozzetti, evitando il contatto con il fondo del pozzo al fine di ridurre al minimo la dispersione di sferoidi. Rimanente volume dovrebbe essere circa 100 µ l.
- Preparare una soluzione di 1: 200 di Annexin V rosso mescolando 50 µ l di Annexin V rosso con 9,95 mL di terreno completo RPMI 1640.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di Annexin V rosso 1: 200.
- Trasferire la piastra in un incubatore (37° C, 5% CO2, 95% di umidità) per 15 min.
- Raccogliere le cellule trasdotte auto CD19 T in una provetta da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere pipettando su e giù più volte con 2 mL di terreno completo RPM1 1640.
- Contare le celle utilizzando esclusione in Trypan blue su un contatore di cellule compatibili.
- Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere in medium RPMI per ottenere 2 x 105 cellule/mL.
- Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e pipettare 100 µ l/pozzetto in un 96 pozzetti tondo piastra sferoide inferiore usando una pipetta multicanale.
- Trasferire la piastra indietro all'apparato di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).
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Accedere al software di acquisizione, selezionare pianificazione per acquisire.
- Pulsante destro del mouse sulla timeline scansione e selezionare Edit Timeline. Pulsante destro del mouse sul gruppo di scansione ed eliminarlo. Pulsante destro del mouse sulla timeline e selezionare opzione di Impostare l'intervallo del gruppo scansione selezionata e impostare aggiungere scansioni ogni a 1,5 h e per un totale di 24 h.
- Impostare l'ora di partenza desiderata (almeno 1 h dopo incubazione nell'apparato imaging automatizzato). Selezionare Salva pianificazione scansioni.
4. analisi di immagine automatizzato
- Accedere al acquisizione, scegliere l'opzione Vista recente analizza e seleziona l'opzione Launch Analysis . Seleziona Crea nuova definizione di analisi | Analisi tipo: sferoide. Spuntare i canali dell'immagine per analizzare (fase + campo chiaro, verde e rosso).
- Selezionare almeno 10 immagini rappresentative: in genere, 1 per ogni condizione e almeno 3 punti di tempo (inizio, metà e fine dell'acquisizione).
- Anteprima l'impostazione predefinita analizzare procedura nello stack di tutta l'immagine.
- Modificare i parametri per campo chiaro maschera. Parametri tipici sono: sensibilità 10, foro riempimento 1.000 µm2min area 1.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.
- Modificare i parametri per maschera verde (GFP). Parametri tipici sono: segmentazione del cappello superiore con raggio 200 µm e soglia 3 GCU, bordo spaccato fuori, riempimento dei fori 5.000 µm2, regola dimensione -2 pixel, Area min 3.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.
- Modificare i parametri per maschera rossa (Annessina V). Parametri tipici sono: segmentazione del cappello superiore con raggio 150 µm e soglia 2 GCU, bordo spaccato fuori, riempimento dei fori 5.000 µm2, regola dimensione di 0 pixel, Area min 1.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.
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Lanciare l'analizzatore.
- Una volta fatto l'analisi, estrarre la misura di interesse. Selezionare il file analizzato e quindi l'opzione Grafico metriche . Selezionare i parametri di interesse, la scansione e il pozzo. In genere, totale intensità rosso e verde all'interno di confini campo chiaro danno le misurazioni più accurate limitando il segnale di fluorescenza per i confini di sferoidi determinata dalla maschera di campo chiaro (Figura 3). Estrarre metriche selezionate in vari formato di file facendo clic su "Esporta dati".
- Procedere all'estrazione delle immagini e dei filmati selezionando il file analizzato e quindi selezionare l'opzione Esporta immagini e filmati . Due opzioni sono disponibili, sia come "visualizzare" recuperare immagini e filmati come visto sul software di imaging (immagini solitamente composite), entrambi "come memorizzato" per recuperare i dati grezzi per analisi esterna tramite software di terze parti.
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Risultati
Come si può vedere nella Figura 1, è fondamentale controllare tramite flusso cytometry il livello di espressione di CD19 auto sulle cellule di T (Figura 1A) e il livello di CD19 su linee cellulari tumorali di HCT116 (Figura 1B). Figura 2 esemplifica il risultato di un esperimento tipico sferoide. L'apparato di imaging automatizzato prende le immagini in quattro diversi c...
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Discussione
L'uso di sferoidi come strumento innovativo per convalidare il trattamento del cancro futuro è diventato un campo di crescente interesse negli ultimi anni. Sferoidi rappresentano un passaggio intermedio tra il classico 2D analisi in vitro e valutazione in vivo. Il metodo ulteriormente tiene un sacco di promesse per quanto riguarda la loro potenza in termini di che imita il micro-ambiente del tumore così come gene profiling7. Il protocollo presentato in questa pubblicazione è stato adattato da sere...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Norwegian Research Council sotto sovvenzioni #244388, #254817 e #284983; l'associazione del cancro norvegese (n. 6829007); Il norvegese salute regione sud-est sotto Grant n. 17/00264-6 e #2016006.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | strong>Numero di lotto: RNBG7037 |
| 75 cm² palloni per area di crescita | VWR | 430639 | Numero di lotto: 2218002 |
| 75 cm² palloni per area di crescita | VWR | 734-2705 | Numero di lotto: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Numero di lotto: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutammina, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Numero di lotto: 1926384 |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10500064 | Numero di lotto: 08Q3066K |
| Gentamicina | Thermo Fischer | 15750060 | Numero di lotto: 1904924A |
| Soluzione blu di tripano, 0,4% | Thermo Fischer | 15250061 | Numero di lotto: 1886513 |
| Piastra a 96 pozzetti, fondo rotondo | VWR | 734-1797 | Numero di lotto: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D-X-VIVO | |
| 15 con gentamicina L-Gln, rosso fenolo, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Numero di lotto: 8MB036 |
| CTS Sostituzione del siero di cellule immunitarie | Thermo Fischer | A2596102 | Numero di lotto: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Numero di lotto: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Numero di lotto: 17A1025-122117 |
| Serbatoio reagente | VWR | 89094-672< | strong>Numero di lotto: 89094-672 |
| Provette da 15 mL | VWR | 734-1867 | Numero di lotto: 19317044 |
| anti-umano CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Numero di lotto: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotina-SP (spaziatore lungo) AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Numero di lotto: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Numero di lotto: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Linea di carcinoma colorettale | ATCC | CCL-247-Incucyte | |
| S3 | Essen Bioscience |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
