Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.

Abstract

I telomeri sono trascritti, dando luogo a telomeric repeat-contenente RNA lunghi non codificanti (TERRA), che sono state proposte per svolgere un ruolo importante nella biologia del telomero, tra cui la formazione dell'eterocromatina e nell'omeostasi di lunghezza del telomero. Recenti scoperte hanno rivelato che TERRA molecole interagiscono anche con interne regioni cromosomiche per regolare l'espressione genica in cellule staminali embrionali (ES) del topo. In linea con questa prova, RNA fluorescenza in situ di ibridazione (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme di TERRA trascrizioni localizzare alle estremità del cromosoma. Una migliore comprensione delle dinamiche di molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione. Qui, descriviamo un metodo per etichettare e visualizzare trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule di cancro usando il sistema di MS2-GFP. A questo scopo, vi presentiamo un protocollo per generare cloni stabili, utilizzando la linea cellulare del cancro AGS stomaco umano, che contiene le sequenze di MS2 integrate a un singolo subtelomeriche. Trascrizione di TERRA dal telomero MS2-etichetta provoca l'espressione di molecole TERRA MS2-Tag che vengono visualizzate da microscopia di fluorescenza di cellule vive al momento di co-espressione di una proteina di legame al RNA MS2-fusa a GFP (MS2-GFP). Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle single-telomero TERRA molecole nelle cellule tumorali, e può essere applicato ad altre linee cellulari.

Introduzione

La TERRA di RNA lunghi non codificanti è trascritto dalla regione subtelomerica dei cromosomi e la trascrizione procede verso le estremità del cromosoma, che chiude all'interno del tratto di ripetizione telomerica^1,2. Per questo motivo, trascrizioni TERRA sono costituiti da sequenze subtelomeric derivata alla loro estremità 5' e terminare con ripetizioni telomeriche (UUAGGG nei vertebrati)³. Importanti ruoli sono stati proposti per TERRA, tra cui la formazione dell'eterocromatina presso i telomeri^4,5, DNA replication

Protocollo

1. Selezione di cloni resistenti neomicina

1. Crescere le cellule AGS in medium F-12_K di Ham (Kaighn) completate con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) a 37 ° C e 5% CO₂. Transfect le cellule in una confluenza di 50-60% con il sgRNA/Cas9 esprimendo vettoriale e la cassetta di MS2 presso un 01:10 rapporto molare²¹.
   Nota: In un esperimento parallelo, verificare l'efficienza di trasfezione di trasfezione un vettore che esprimono GFP (cioè, Cas9-GFP vector). Almeno 60-70% di efficienza di trasfezione dovrebbe essere reali....

Risultati

Figura 1 rappresenta una panoramica della strategia sperimentale. I passaggi principali del protocollo e un calendario indicativo per la generazione di cloni di TERRA-MS2 in cellule AGS sono illustrati (Figura 1A). Giorno 1, più pozzetti di una piastra ben 6 transfected con la cassetta di MS2 e sgRNA/Cas9 esprimendo vettori (illustrati nella Figura 1B)........

Discussione

In questo articolo presentiamo un metodo per generare cloni di cellule tumorali umane contenenti sequenze di MS2 integrati all'interno di subtelomeriche 15q. Utilizzando questi cloni, le molecole di MS2-etichetta TERRA trascritte da subtelomeriche 15q vengono rilevate da microscopia di fluorescenza di co-espressione di una proteina di fusione GFP-MS2. Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica della TERRA espressa da un singolo dei telomeri in vita cellule²¹. In questo protoc.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule AGS	-		Dono di Christian Baron (Université de Montré al).
F12K Nut Mix 1X	GIBCO	21127022	Terreno di coltura per cellule AGS
L-Glutammina	CORNING	MT25005CI	Componente del terreno di coltura cellulare
Soluzione di penicillina streptomicina	CORNING	30-002-CI	Componente del terreno di coltura cellulare
Fetale Siero bovino Sigma	Aldrich	F2442	Componente del terreno di coltura cellulare
DMEM 1X	GIBCO	21068028	terreno di coltura per cellule di fenice
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)
Destrosio	Sigma Aldrich	D9434	utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	utilizzato nella trasfezione di cellule phoenix (soluzione HBS) e nella precipitazione di retrovirus
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X	CORNING	59430C	utilizzato nella divisione cellulare
DPBS 1X	GIBCO	14190250	Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco
	DMSO Sigma Aldrich	D8418	Componente del mezzo di congelamento cellulare (80% FBB e 20% DMSO)
G-418 Disolfato	per medium	G4185	farmaco di selezione per
Soluzione di gelatina Bioreagente	Sigma Aldrich	G1393	Composizione di una piastra di DNA a 96 pozzetti e di una piastra di congelamento
Fisher BioReagents	a base di tris	10376743	Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico
SDS	Sigma Aldrich	71729	Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione genomica del DNA
Proteinasi K	Thermo Fisher	AM2546	Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico
RNAsi A	Thermo Fisher	12091021	degradazione dell'RNA durante l'estrazione del DNA
Agarosio	Sigma Aldrich	A5304	Preparazione del gel di DNA
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Reagente colorante utilizzato per la rilevazione di campioni di DNA e RNA in gel di agarosio
etanolo	Fisher BioReagents	BP28184	precipitazione del DNA
Acetato di sodio	Sigma Aldrich	71196	Utilizzato per la precipitazione del DNA a una concentrazione 3M pH5.2
Wizard SV Gel e sistema di pulizia PCR	Promega	A9282	Estrazione di frammenti PCR da gel di agarosio durante lo screening PCR di cloni positivi alla neomicina
Trizol	AMBION	15596018	Solvente organico utilizzato per l'estrazione dell'RNA
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradazione del DNA genomico dall'RNA
Miscela di dNTP	Invitrogen	10297018	utilizzato nelle reazioni RT e PCR
DTT	Invitrogen	707265ML	utilizzato nelle reazioni RT
pirocarbonato di dietil	Sigma Aldrich	D5758	utilizzato per inattivare le RNAsi in acqua (diluizione 1:1000)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	Inibitore della RNasi
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparazione di gel di RNA
Paraformaldeide Microscopia	elettronica	Scienze 15710	preparazione di gel di RNA denaturante (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Trascrittasi inversa	Invitrogen	18080-093	Reazione di retrotrascrizione
Pfu DNA polimerasi (ricombinante)	Thermo Scientific	EP0501	Reazione PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	Reazione PB 20.14	qPCR
L'adenovirus Cre-GFP	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	utilizzato per infettare i cloni TERRA-MS2 al fine di rimuovere il gene neomycn
Butirrato di sodio	Sigma Aldrich	B5887	utilizzato per promuovere la produzione di particelle di retrovirus nelle cellule di fenice
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitazione di parti di retrovirus
35µ-Dish Glass Bottom	Ibidi	81158	utilizzato nelle analisi di imaging su cellule vive di cloni TERRA-MS2