Articolo metodologico

Composizione e analisi della distribuzione di Bioaerosols in diverse condizioni ambientali

DOI:

10.3791/58795

⸱

7 gennaio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendere la composizione biologica del particolato ambientale è importante per lo studio dei relativi impatti significativi sulla salute umana e la diffusione della malattia. Qui, abbiamo utilizzato tre tipi di metodi di campionamento di bioaerosol e un'analisi biologica di microbi nell'aria per meglio esplorare le comunità microbiche nell'aria in diverse condizioni ambientali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Variabile microrganismi nel particolato (PM) in diverse condizioni ambientali possono avere un impatto significativo sulla salute umana. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo per l'analisi multiple delle composizioni in ambientale del pomeriggio cinque esperimenti biologiche sono presentate: (1) PM numero monitoraggio utilizzando un contatore di particelle laser; (2) PM raccolta utilizzando un campionatore ciclonico aerosol; (3) PM raccolta utilizzando un campionatore d'aria ad alto volume con filtri; (4) insieme di microbi coltivabili dal campionatore di sei stadi di Andersen; e (5) rilevamento di composizione biologica di PM ambientale di batterica 16SrDNA e fungine relativa regione sequenziamento. Abbiamo selezionato i giorni foschi e una fattoria di bestiame come due esempi tipici di applicazione del presente protocollo. In questo studio, questi due metodi di campionamento, campionatore di aerosol ciclonica e campionatore di filtro, ha mostrato l'efficienza di campionamento diverso. Il campionatore ciclonico aerosol eseguito molto meglio in termini di raccolta di batteri, mentre questi due metodi hanno mostrato la stessa efficienza nella raccolta di funghi. Campionatori di filtro possono lavorare in condizioni di bassa temperatura mentre campionatori ciclonico aerosol hanno una limitazione di campionamento per la temperatura. Un campionatore impattante solido, come un campionatore di sei stadi di Andersen, può essere utilizzato per esempio bioaerosols direttamente nel terreno di coltura, che aumenta il tasso di sopravvivenza dei microrganismi coltivabili. Tuttavia, questo metodo si basa principalmente sulla cultura mentre oltre il 99% dei microbi non può essere coltivato. DNA estratto dai batteri coltivabili raccolti dal campionatore di sei stadi di Andersen e campioni raccolti da campionatore aerosol ciclonica e campionatore di filtro sono stati rilevati da batterici 16S rDNA e fungine ITS regione dall'ordinamento. Tutti i metodi di cui sopra potrebbero avere ampia applicazione in molti campi di studio, come il monitoraggio ambientale e rilevamento del patogeno nell'aria. Da questi risultati, possiamo concludere che questi metodi possono essere utilizzati in condizioni diverse e possono aiutare altri ricercatori esplorare ulteriormente gli impatti sanitari del bioaerosols ambientale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ambienti naturali, vari tipi di microrganismi presenti nella bioaerosols, tra cui funghi, batteri, virus e altri microrganismi1. Microrganismi trasportati dall'aria, che possono essere emessa da alcune attività umane come le operazioni di alimentazione animale negli allevamenti di bestiame, sono i contenuti importanti dell' ambiente atmosferico2. Questi microrganismi possono non solo svolgono un ruolo importante nell'ambiente atmosferico ma anche avere un impatto significativo sulla salute umana e malattie diffuse.

Come un mezzo importante di diffusione di malattie, aerosol microbici hanno attirato grande attenzione in tutto il mondo. In studi recenti, molte malattie umane sono stati trovati per essere associati con la complessa composizione del particolato ambientale (PM) in luoghi diversi, come fabbriche chimiche, aziende zootecniche e smog città3,4. La composizione biologica di PM può contribuire ad alcune malattie respiratorie e cardiovascolari in esseri umani esposti a PM5. Regioni differenti del corpo, come ad esempio la mucosa, pelle, apparato digerente e respiratorio, possono essere potenziali bersagli di microbi attaccati al PM6,7. Un aumentato rischio di cancro al polmone potrebbe essere causato da esposizione prolungata a PM2,58.

Batteri dispersi nell'aria sono stati censiti in varie località in diversi paesi del mondo, tra cui in stazioni della metropolitana, ospedali veterinari, macelli, compostaggio strutture, concerie, impianti di lavorazione del latte, miniere di carbone, cliniche dentali e ambienti interni9,10,11,12,13,14,15,16,17, generando un gran numero di rapporti su aerosol biologici. Luoghi affollati associati campus, bestiame nella fattoria e grandi città durante giorni foschi sono tre condizioni comuni particolarmente importante per il quale abbiamo bisogno di esplorare le connessioni tra salute umana e i potenziali effetti della esposizione a PM. Inoltre, durante i giorni di inverno nelle città del nord della Cina, elevati valori di PM2.5 possono incidere sulla salute umana. Anche se PM2.5 può generare effetti tossici di targeting superfici respiratorie e dissoluzione nel sangue18, non è ancora chiaro se e come i microbi attaccati al PM2.5 potrebbero potenzialmente influenzare la salute umana19 ,20. Allevamenti di bestiame sono una delle principali fonti di PM e aerosol microbici nell'aria. Il gran numero di agenti patogeni, quali virus dell'influenza e Brucella melitensis, che sono trasportati da aerosol nei campi nei dintorni di allevamenti è fattori importanti che causano malattie respiratorie in bestiame e pollame lavoratori.

In questo studio, abbiamo esplorato diversi tipi di analisi di bioaerosols, incluso PM numero bioaerosol per monitoraggio, raccolta e analisi di composizione biologica. Campioni d'aria sono stati raccolti da un campionatore di aerosol ciclonica, un campionatore d'aria ad alto volume con filtri e un campionatore di sei stadi di Andersen. Quindi, i campioni raccolti da questi tre campionatori sono stati analizzati da analisi biologiche tra cui batterici 16S rDNA e fungine ITS sequenziamento per determinare le loro composizioni biologici. Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi da bioaerosol campioni raccolti durante giorni foschi Beijing e dagli allevamenti che indica che bioaerosols potrebbe hanno un grande impatto sulla salute umana e animale. Il confronto tra liquido e filtro, metodi di campionamento sono stati esplorati anche in questo studio, principalmente sulla base dei dati del DNA 16S e fungine ITS sequenziamento.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PM numero monitoraggio

  1. Utilizzare una particella di airborne laser contatore (Vedi Tabella materiali) per determinare il numero totale di PM. Raccogliere il PM con la porta di campionamento dell'aria sulla parte superiore il contatore di particelle laser disperso nell'aria.
    Nota: Questo contatore di particelle è un'apparecchiatura di automazione e può funzionare in modo indipendente quando il programma tra cui tempo di campionamento, intervallo, tempi di raccolta, ecc è stato impostato il suo touch screen.
    1. Dotare lo strumento di un sensore per monitorare temperatura e umidità relativa. Misurare e registrare i dati di temperatura e umidità relativa simultaneamente ogni 5 min.
    2. In totale, misurare e registrare 6 classi di dimensioni delle particelle differenti (0.3-0.5 μm, 0.5-0.7 μm, 0,7-2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm e > 10 μm) ogni 5 min misurare simultaneamente 4 altre classi di dimensione delle particelle (0.3-0.5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm e ≥ 3 μm).
    3. Raccogliere i campioni di aria anche se il foro di campionamento sulla parte superiore il campionatore e utilizzare i moduli di test all'interno il campionatore per misurare la dimensione delle particelle di ogni PM. Quindi i dati vengono memorizzati automaticamente. Tutti i processi di cui sopra può essere eseguita automaticamente dopo i relativi parametri, tra cui tempo di campionamento e conteggio della gamma, sono però impostare il displayer mini tocco del contatore di particelle laser disperso nell'aria.
      Nota: Questo contatore di particelle è un'apparecchiatura di automazione e dispone di moduli di prova che contano il numero di PM di classi di dimensioni delle particelle differenti.
  2. Per valutare l'errore standard sperimentale, garantire che le classi di dimensione delle particelle differenti sono contati con almeno 15 ripetizioni. Assicurarsi che le letture sono memorizzate nella memoria interna dello strumento e successivamente analizzate.
    1. Assicurarsi che l'analisi dei dati primari includa PM concentrazione numerica, il test ANOVA e la percentuale di PM in ogni classe di dimensione. Ad esempio, come mostrato in Figura 1A, le concentrazioni di PM numero nel mese di dicembre (237.6 particelle/cm3) erano significativamente più alti rispetto a quelli in ottobre (media: 110,2 particelle/cm3) (ANOVA; P-value < 0.05). Figura 1B Mostra che il numero di particelle di dimensioni inferiori a 3 μm ha rappresentato per oltre il 99% del numero totale.
    2. Utilizzare il contatore di particelle laser per monitorare le concentrazioni di PM numero e memorizzare i dati automaticamente. Utilizzare un disco flash USB per esportare i dati nel computer ed eseguire il test ANOVA.

2. PM collezione by ciclonico Aerosol Samplers

  1. Eseguire il campionamento in un'area aperta senza qualsiasi vicina grandi fonti di inquinamento alle ∼2 m sopra il suolo di PM.
    1. Registrare la posizione del sito di campionamento. Ad esempio, il campus dell'Istituto di tecnologia di Pechino è la seguente: 39 ° 57' 51,0 ' N; 116 ° 19' 38,5 ' E.
  2. Utilizzare un campionatore di aerosol ciclonica per raccogliere campioni di aria. Utilizzare un flusso di campionatore di 323 L/min e un tempo di raccolta di 6 h.
    Nota: La portata del campionatore è fisso e non può essere modificata. La data di raccolta è controllata da cronometraggio manuale come c'è solo un pulsante di Start e Stop su questo sampler.
    1. Utilizzare acqua sterile per lavare l'interno del campionatore ciclonico aerosol 3 volte prima raccolta e utilizzare la funzione automatica di pulizia 3 volte premendo continuamente il pulsante Raccogli 3 volte.
    2. Premere il pulsante Raccogli per avviare il campionamento e premere il pulsante pump per interrompere il campionamento. Mettere il campionatore su una mensola o piano con nessuno tenendolo in luogo.
    3. Conservare tutti i campioni al buio a-20 ° C fino a quando le analisi successive.

3. PM collezione di filtri

  1. Eseguire il campionamento in un'area aperta senza qualsiasi vicina grandi fonti di inquinamento alle ∼2 m sopra il suolo di PM.
    1. Registrare la posizione del sito di campionamento. Ad esempio, il campus dell'Istituto di tecnologia di Pechino è come segue: 39 ° 57' 51,0 ' N; 116 ° 19' 38,5 ' E.
  2. Raccogliere i campioni di PM su 20,32 filtri di2 cm × 25,4 (Vedi Tabella materiali) utilizzando un campionatore d'aria ad alto volume (Vedi Tabella materiali) con una portata di 1.000 L/min impostare il tempo di raccolta e tasso di flusso dalla relativa auto-programmazione.
    1. Conservare tutti campionati filtri al buio a-20 ° C fino a quando le analisi successive.

4. analisi della composizione biologico

  1. Per l'analisi di composizione biologica, utilizzare ogni campione di liquido dal campione campionatore o Filtro ciclonico aerosol per l'estrazione di DNA da un'estrazione di DNA multisorgente Kit (Vedi Tabella materiali) secondo i protocolli del produttore.
    1. Per campioni dal campionatore d'aria ad alto volume con filtri, è possibile utilizzare 1/8 di ogni campione di filtro per estrazione del DNA. Mettere il filtro in una provetta da 50 mL con il campione rivolti verso l'interno e la parte posteriore rivolta verso la parete del tubo. Aggiungere 10 perline in siti centrali verso il lato del filtro contenente il campione.
    2. Vortice del tubo per 15 min a temperatura ambiente. Dispensare il liquido nel tubo in una provetta da centrifuga pulita 50ml per continuare il processo di estrazione del DNA.
  2. Estrarre il DNA dal campione tramite i processi come segue.
    1. Centrifugare il campione di batteri a 2.000 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e sospendere i batteri in 2 mL di tampone PBS sterile.
    2. Raccogliere la sospensione di batteri in una provetta da centrifuga da 2 mL e poi Centrifugare a 2.000 x g per 5 min scartare il supernatante.
    3. Aggiungere 350 μL di tampone PBS sterile contenente i batteri sospesi alla soluzione.
    4. Aggiungere 0,8 mL di RNAsi A.
    5. Aggiungere 150 μL di tampone CL e 8 μL di proteinasi K e mescolare immediatamente Vortex agitazione per 1 min. Dopo la breve centrifugazione a 1.000 x g per 30 s (nessun residui sul muro), mettere il tubo centrifugo in acqua di 56 ° C per 10 min.
    6. Aggiungere 350 μL di tampone PD e mix per 30 s e poi Centrifugare per 10 min a 12.000 x g.
    7. Posizionare il tubo di preparazione di DNA in una provetta da centrifuga da 2 mL e trasferire la miscela fatta al punto 4.2.6 al tubo della preparazione. Poi Centrifugare per 1 min a 12.000 x g.
    8. Scartare il filtrato, rimettere il contenuto della provetta preparazione della provetta da centrifuga 2 mL originale e aggiungere 50 μL di tampone W1. Centrifugare la miscela per 1 min a 12.000 x g.
    9. Scartare il filtrato, rimettere il contenuto della provetta preparazione della provetta da centrifuga 2 mL originale e aggiungere 700 µ l di tampone W2. Centrifugare la miscela per 1 min 12.000 x g. Ripetere questo passaggio per lavare nuovamente con 700 µ l di tampone W2.
    10. Eliminare il liquido di scarto e rimettere il contenuto della provetta preparazione della provetta da centrifuga 2 mL originale. Centrifugare la miscela per 1 min a 12.000 x g.
    11. Mettere il contenuto della provetta preparazione del DNA in un'altra provetta da centrifuga pulito 1,5 mL e aggiungere 100 μL di acqua deionizzata o eluente al centro della membrana nel tubo di preparazione (acqua deionizzata o eluente è stata riscaldata a 65 ° C). Lasciar riposare a temperatura ambiente per 1 min e centrifugare la miscela per 1 min a 12.000 x g.
  3. Eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (Q-RT-PCR) per quantificare le abbondanze relative di batteri e funghi sui filtri di campionamento.
    1. Utilizzare il primer come segue: per batterici 16S rDNA, 515F (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') e 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); e per i funghi ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') e ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3').
    2. Eseguire le analisi di Q-RT-PCR su un sistema di PCR in tempo reale (Vedi Tabella materiali). Condizione di RT-PCR: predegeneration, 95 ° C, 10 min; degenerazione, 95 ° C, 15 s; tempri ed estensione, 60 ° C, 1 min; 40 cicli da degenerazione tempri ed estensione.
  4. Per analisi della struttura di comunità batteriche e fungine, amplificare la regione V1 – V3 della batterici 16S rDNA e la relativa regione dell'operone rRNA fungine mediante PCR.
    1. Utilizzare il primer come segue: per i batteri, V1-9F (5 ′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ′) e V3-541R (5 ′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ′); e per i funghi, ITS-3F (5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') e ITS-4R (5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3').
    2. Assicurarsi che la miscela di 20 μL di PCRs inclusi 2 μL di dNTPs 2,5 mM, 4 μL di 5 × FastPfu Buffer, 0,8 μL di ogni primer (5 μM), 0,4 μL della polimerasi di FastPfu e 10 ng di DNA campione (Vedi Tabella materiali).
    3. Utilizzare il programma PCR come segue: 94 ° C per 5 min; seguita da 10 cicli di 94 ° C per 30 s, 55-60 ° C per 45 s e 72 ° C per 90 s; 20 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 45 s e 72 ° C per 90 s; e un'estensione finale a 72 ° C per 5 min.
  5. Eseguire la purificazione del DNA, di quantificazione del DNA e di pirosequenziamento come descritto in un precedente studio 21.

5. Bioaerosol campionamento e coltivazione

  1. Utilizzare un campionatore di sei stadi Andersen standard internazionale (Vedi Tabella materiali) per esempio batteri coltivabili nell'aria e funghi con una portata di 28,3 L/min uso un tempo di campionamento di 35 min. mettere la piastra di coltura in ogni fase del campionatore. Dopo ogni campionamento sufficientemente disinfettare il campionatore con alcool etilico al 75%.
    Nota: Il tasso di flusso del campionatore è fisso e la data di raccolta è controllata da cronometraggio manuale.
    1. Fasi di campione sei con il campionatore di sei stadi di Andersen, che è definito dal diametro aerodinamico delle particelle nell'aria, tra cui Stadio VI (0,65 – 1.1 μm), fase V (1.1 – 2.1 μm), Stadio IV (2.1 – 3.3 μm), Stadio III (3.3 – 4.7 μm), fase II (4,7-7,0 μm) e della fase I (≥7.0 μm).
    2. Raccogliere le particelle batteriche e depositare sulla piastra di coltura in ogni fase contenente soia-Casein Digest Agar (Vedi Tabella materiali). C'è un contenitore con molte prese d'aria sulla parte superiore in ogni fase del campionatore.
    3. Cultura della raccolta di batteri dispersi nell'aria piastre a 37 ° C per 24-48 h; quindi, contare il numero di Colonia di batteri sul piatto del campione per ogni fase.
  2. Per evitare che le particelle raccolte dal campionatore di sei stadi di Andersen da sovrapposti, correggere il numero di colonie a ogni livello di campionatore dalla seguente formula:
    figure-protocol-1
    dove Pr: corretto numero di colonie ad ogni livello,
    N: numero di fori del campionatore a tutti i livelli (400), di campionamento e
    r: il conteggio effettivo delle colonie.
  3. Calcolare l'unità di colonie per m3 di aria come segue:
    figure-protocol-2
    dove c: concentrazione (CFU/m3),
    N1-N6: il corretto numero di colonie ad ogni livello,
    T: tempo (min), di campionamento e
    F: flusso di campionamento (28,3 L/min).
  4. Utilizzare i metodi passi 5.1 - 5.3 per studiare il bioaerosol in allevamento, compresi i quattro tipi di porcilaie.
    Nota: L'allevamento si trova a Changchun, Cina. La posizione centrale 2 m dal suolo in ogni porcilaia è stata selezionata come posizione di campionamento). Dopo coltura di batteri, trattare tutte le colonie nelle piastre come descritto nella procedura 6.1 - 6.2.

6. identificazione di batteri coltivabili

  1. Dopo 48 h o 72h di coltura, è possibile posizionare i batteri in una provetta da centrifuga da 2 mL. Estrarre il DNA di questi batteri o funghi utilizzando un'estrazione di DNA multisorgente Kit (Vedi Tabella materiali). Il processo di estrazione del DNA è descritto nella sezione 4.2.
  2. Utilizzare 200 μL estrazione del DNA per sequenziamento del 16S rDNA . Utilizzare gli stessi processi, come descritto nella procedura 4.2, 4.3 e 4.4 sull'analisi della composizione biologica.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, abbiamo effettuato una valutazione della distribuzione generale PM e un'analisi completa dei bioaerosols in un caseificio da settembre a dicembre. Molti fattori ambientali contribuiscono alla distribuzione delle particelle dell'aerosol. Abbiamo studiato le distribuzioni di concentrazione e dimensione di PM in una casa di vacca utilizzando un contatore di particelle laser TSI. Come mostrato in Figura 1A, la concentrazione delle particelle dell'aerosol era più alta nel mese di dicembre e più basso nel mese di ottobre, che potrebbe essere causato da variazioni di temperatura e umidità (tabella 1). La concentrazione delle particelle di aerosol inalabile (0,3-3,0 µm) ha rappresentato per oltre il 99% della concentrazione totale delle particelle (Figura 1B), e le particelle in questa fascia potrebbero raggiungere profondità respiratorio, causando gravi pericoli per gli esseri umani e animali.

Analisi di composizione biologica dei campioni può essere eseguita DNA estrazione, batterica 16SrDNA ed fungine ITS regione ordinando invece di coltura del microrganismo. Dall'analisi biologica di bioaerosol campioni raccolti utilizzando un campionatore di aerosol ciclonico o un campionatore d'aria ad alto volume con filtri, possiamo confrontare preliminarmente le efficienze di questi due metodi nella raccolta di batteri e funghi. Figura 2 ha mostrato i risultati dell'analisi di bioaerosol campioni raccolti durante giorni foschi Beijing nel campus dell'Istituto di tecnologia di Pechino in 20 dicembre 2016. Per la raccolta di batteri, i risultati hanno indicato che il campionatore ciclonico aerosol raccolti molti generi più rispetto il campionatore d'aria ad alto volume con filtri (Figura 2A). Per la raccolta di funghi, questi campionatori ha mostrato efficienze pari e quasi la stessa abbondanza di genere (Figura 2B). Dai risultati presentati nella Figura 2, siamo stati in grado di misurare l'efficienza di raccolta differenti di questi due metodi per batteri e funghi. Per raccolta di batteri, il campionatore ciclonico aerosol eseguita molto meglio di quanto il high-volume aria campionatore con filtri perché i campioni dal precedente ha mostrato una maggiore abbondanza di genere (Figura 2A). Tuttavia, l'analisi di sequenziamento fungine dei due campioni da metodi di campionamento differenti ha mostrato strutture comunitarie quasi identici (Figura 2B).

Abbiamo studiato i batteri coltivabili nell'aria utilizzando un campionatore di sei stadi di Andersen. Come mostrato nella Figura 3, i numeri di Colonia di batteri coltivabili per particelle di fase-VI è stato ridotto. Le particelle della fase I (particella > 8.2 µm) aveva il più alto numero di colonie di batteri coltivabili. La percentuale di fase I colonie in quattro diversi tipi di porcilaie tra cui parto scrofa incinta, casa casa, casa da ingrasso e svezzamento casa era 33%, 30%, 26% e 34%, rispettivamente. La percentuale di fase II colonie in quattro diversi tipi di porcilaie era 20%, 22%, 19% e 20% rispettivamente. La percentuale di fase III colonie in quattro diversi tipi di porcilaie era 18%, 18%, 18% e 19% rispettivamente. La percentuale di fase IV colonie in quattro diversi tipi di porcilaie era 17%, 16%, 16% e 16% rispettivamente. La percentuale di fase V colonie in quattro diversi tipi di porcilaie era 10%, 10%, 14% e 6% rispettivamente. Particelle di fase VI (particella < 1.0 µm) avevano il più basso numero di colonie di batteri coltivabili. La percentuale di fase VI colonie in quattro diversi tipi di porcilaie era 3%, 5%, 6% e 5%, rispettivamente.

I campioni di aria sono stati raccolti in quattro diversi tipi di porcilaie utilizzando un campionatore di sei stadi di Andersen e poi coltivate nelle circostanze adatte. Il DNA intero genoma dei batteri coltivabili raccolti da ogni fase della particella è stata estratta e rilevato da batterici 16S rDNA e fungine ITS regione sequenziamento. Un totale di 91 generi e 158 specie di batteri sono stati identificati nei batteri coltivabili in porcilaie. Le strutture di comunità di batteri coltivabili in quattro diversi tipi di porcilaie, tra cui casa, incinta di figliata seminano casa, ingrasso house e lo svezzamento sono illustrato nella Figura 4 con dati dalla fase I alla fase VI . Il contenuto dei diversi generi batterici predominanti non è lo stesso tra diversi porcilaie.

figure-results-1
Figura 1: la distribuzione di concentrazione e dimensione di PM in quattro diversi mesi. (A) Boxplot di PM numero durante il periodo di studio. Ogni boxplot comprende il massimo, minimo, mediana, due quartili e valore anormale del database. Mappe di distribuzione di dimensioni medio di (B) di PM. C'erano ottanta vacche nella casa da settembre a dicembre. La percentuale di PM (≥ 3 µm) in quattro mesi (settembre, ottobre, novembre e dicembre) era 0,005, 0,005, 0,002 e 0,002 rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: analisi biologiche di bioaerosol campioni raccolti da due campionatori. (A) e (B) Visualizza le abbondanze dei generi batteriche o fungine nei campioni di bioaerosol ottenuti con metodi di raccolta differenti. Campionatore d'aria bagnata-parete rappresenta il campionatore di aerosol ciclonica. Filtri a quarzo rappresenta il campionatore d'aria ad alto volume con filtri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: media mappe di distribuzione gerarchica di batteri coltivabili in quattro tipi di porcilaie. I quattro tipi di porcilaie sono parto scrofa incinta, casa casa, casa di ingrasso e svezzamento casa. S1 a S6 rappresentano le fasi di sei particelle (I-VI) raccolte dal campionatore di sei stadi di Andersen. Le fasi sono state definite dal diametro aerodinamico delle particelle nell'aria, tra cui fase VI (0.65-1.1 µm), fase V (1.1-2.1 µm), Stadio IV (2.1-3.3 µm), Stadio III (3.3-4,7 µm), fase II (4,7-7,0 µm) e della fase I (7,0 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: strutture di comunità batteriche con differenti abbondanze nei campioni di aria. I campioni di aria sono stati raccolti in quattro diversi tipi di porcilaie utilizzando un campionatore di sei stadi di Andersen e poi coltivate nelle circostanze adatte. Il DNA intero genoma dei batteri coltivabili in ogni fase delle particelle raccolte dal campionatore di sei stadi di Andersen è stata estratta e rilevato dal batterici 16S rDNA 16S. I numeri da 1 a 6 in ogni tipo di porcilaia rappresentano particella stadi da I a VI misurato dal campionatore di sei stadi di Andersen. Il testo sul lato destro include il nome del genere per ogni batterio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, abbiamo fornito alcuni risultati rappresentativi che sono stati ottenuti durante giorni foschi e negli allevamenti di bestiame. I risultati ottenuti da campioni di bioaerosol presi durante giorni foschi Beijing ha facilitato una migliore comprensione delle composizioni biologiche della composizione biologica del PM senza PM presente durante giorni foschi Beijing. I risultati da campioni prelevati dagli allevamenti fornirà anche dati di base per aria ambientale percorre in porcilaie e un fondamento teorico e supporto tecnico per l'allevamento sano e sicuro produzione negli allevamenti di bestiame. Molti fattori ambientali, come temperatura, umidità e velocità del vento, potrebbero contribuire alla distribuzione delle particelle di aerosol nella casa di vacca (Figura 1). Gli studi precedenti hanno rivelato che il PM in allevamenti proviene principalmente dal foraggio, feci, pelo e piuma, che può essere correlata alle attività degli animali. I fattori ambientali possono influenzare non solo attività animale, ma anche l'aggregazione e la diffusione di PM in una casa di vacca relativamente chiusa. Di conseguenza, rileviamo diverse concentrazioni e le distribuzioni di dimensioni di PM in quattro diversi mesi. Inoltre, la condizione sanitaria, alimentazione metodo e attività degli animali erano differenti fra i quattro tipi di porcilaie, che potrebbero colpire anche la loro struttura di comunità di batteri coltivabili nell'aria (Figura 4).

Tuttavia, in questo studio, ci siamo concentrati principalmente sui metodi disponibili che potremmo utilizzare per studiare la composizione e la distribuzione di bioaerosols in diverse condizioni ambientali. Confrontato con altri campioni microbici, quelli di microrganismi trasportati dall'aria hanno concentrazioni molto basse e sono mescolati con un gran numero di impurità, come particelle di polvere inorganica, che introducono alcune difficoltà durante la raccolta e l'individuazione di tali microrganismi21. Di conseguenza, metodi appropriati di raccolta e di rilevamento devono essere selezionati per aerosol microbici. La raccolta di campioni di aerosol microbici viene generalmente eseguita utilizzando il metodo di precipitazione o attrezzature specializzate per raccogliere i microrganismi in solido, liquido o semi-solido campionamento medio22,23,24 . Quindi, alcuni corrispondente trattamento tecnico e test specifici e analisi vengono successivamente espletate25. Il mezzo di campionamento dovrebbe mantenere intatte per ridurre l'errore associato a rilevamento e analisi26microrganismi. Tuttavia, campionatori microorganismo aerosol diversi hanno diversi effetti sull'integrità dei campioni a causa di loro principi di campionamento diverso e media. Persone hanno progettato molti tipi di campionatori di bioaerosol che utilizzano principi di campionamento diverso, ad esempio inerzia compressione, resistenza di filtrazione e precipitazione elettrostatica27.

Un impatto campionatori può spingere PM disperso nell'aria nel mezzo di campionamento ad alta velocità utilizzando attrezzature per l'estrazione. Ci sono due tipi di impatto con campionatori: solidi e liquidi. Solido che incidono campionatori possono essere usate per esempio bioaerosols ad una concentrazione bassa e può essere quasi impermeabile all'aria flusso28. Particelle di aerosol di diverse dimensioni possono essere preliminarmente sottoposti a screening e microbi possono campionare direttamente nel terreno di coltura, che aumenta il tasso di sopravvivenza dei microrganismi coltivabili10. A causa di impatto inerzia, particelle di aerosol microbici facilmente si scontrano nello stesso sito e colonie possono sovrapporsi facilmente dopo cultura. Allo stato attuale, il campionatore impattante solido più comune è il campionatore di aerosol microbici Andersen-6. In questo studio, abbiamo usato un campionatore di sei stadi di Andersen per studiare i batteri coltivabili distribuiti in PM dispersa nell'aria di diverse dimensioni.

Campionatori di aerosol ciclonico utilizzano cicloni all'aria a spirale ad alta velocità in un cilindro o cono. Bioaerosol particelle possono essere separate dal flusso d'aria dalla forza centrifuga, che significa che i microbi possono urtare la parete interna del campionatore e poi essere raccolti da buffer di campionamento. Questo metodo è conveniente e può essere utilizzato per lunghi tempi nel grande flusso di campionamento e le operazioni di campionamento. Tuttavia, questo metodo non può essere implementato a basse temperature, poiché l'operazione dipende dal liquido. Il campionatore ciclonico aerosol utilizzato in questo studio è un campionatore di ciclonico parete bagnata aerosol che può estrarre e trasferire agenti patogeni nell'aria e particelle dall'aria campionata in un piccolo volume di acqua per analisi29.

Campionatori di filtro possono lavorare in condizioni di bassa temperatura e possono assaggiare le particelle sopra una certa dimensione. Tuttavia, essi hanno un grande impatto sull'attività microbica e sono soggette a danni, che influenzerà notevolmente gli studi successivi su attività di campionamento. In questo studio, sono stati raccolti campioni di bioaerosol da giorni foschi Beijing utilizzando un campionatore d'aria ad alto volume con filtri e un campionatore di aerosol ciclonica. Lo scopo di questo esperimento era di analizza la composizione biologica del PM senza la separazione e la coltura di microbi nell'aria. Pertanto, questi due metodi di campionamento erano adatti per questo studio. Per il metodo di campionatore aerosol ciclonica, microbi nell'aria a bassa concentrazione possono essere facilmente estratta nel buffer in esecuzione e quindi possono essere analizzati comodamente senza il trattamento supplementare che viene comunemente utilizzato per i campioni di filtro. In questo studio, questi due metodi di campionamento, campionatore di aerosol ciclonica e campionatore di filtro, ha mostrato l'efficienza di campionamento diverso. Il trattamento supplementare che viene comunemente utilizzato per i campioni di filtro, come il recupero del campione dal filtro, è una delle principali differenze tra questi due metodi. Inoltre, i campioni di aria sono stati raccolti direttamente nel buffer in esecuzione da campionatore ciclonico aerosol mentre l'altro metodo campioni raccolti su filtri. Le caratteristiche di diverso tipo di metodo di campionamento potrebbero contribuire a questa efficienza di campionamento diverso. Possiamo supporre che il campionatore di aerosol ciclonico è la scelta migliore per la raccolta del microorganismo, e quest'ipotesi ha bisogno di ulteriore conferma.

In questo studio, batterici 16S rDNA e fungine ITS regione sequenziamento sono stati utilizzati per eseguire l'analisi biologica di bioaerosols. Sequenziamento di 16SrDNA è la determinazione del rDNA 16S segmenti nel genoma microbico30. 16S rDNA è ampiamente presente nei procarioti con alta conservazione e specificità, che lo rende utile per l'identificazione di specie microbiche31. Sequenziamento di intero genoma richiede solo l'estrazione del DNA genomico e successivo sequenziamento. Oltre a produrre una grande quantità di dati, questo processo consente inoltre per un'analisi più completa della struttura della comunità microbica. Inoltre, metagenomica può essere utilizzato anche in questo campo di Studio fornendo maggiori informazioni in futuro. Handelsman et al. in primo luogo proposto il concetto del metagenoma in un libro del 1998 sui microbi nel suolo32. Negli studi successivi, il concetto del metagenoma gradualmente è stato accettato, e molta ricerca è stata condotta sui microbi inclusi nel umano intestino, oceano e terra33,34,35. Con il supporto di sequenziamento ad alta tecnologia, metagenomica ha sviluppato rapidamente e svolge un ruolo sempre più importante nello studio del rilevamento del patogeno. Metodi di ricerca microbiche tradizionali si basano principalmente sulla cultura per la separazione e purificazione. Tuttavia, molti studi non possono essere effettuati perché più del 99% dei microbi non può essere coltivato. Contrariamente ai metodi tradizionali, metagenomica può prendere l'informazione genetica di tutti i microbi nell'ambiente nel suo complesso senza la necessità di separare i singoli organismi36. Un'analisi completa di tutti i microrganismi risultante può essere condotta direttamente.

In sintesi, questo studio ha mostrato diversi di rilevazione, campionamento e metodi di analisi che potrebbero essere utilizzati per gli studi sulla composizione biologica del PM ambientale, tra cui PM monitoraggio; PM campionamento da un campionatore di sei stadi di Andersen, un campionatore d'aria ad alto volume con filtri o campionatore ciclonico aerosol; e successiva analisi biologica basata sul sequenziamento del DNA. In pratica, questi metodi possono essere utilizzati in diverse condizioni ambientali, come molti tipi di allevamenti. I nostri protocolli e risultati possono aiutare altri ricercatori in tutto il mondo esplorare ulteriormente gli impatti sanitari del fungine e batteriche bioaerosols nell'ambiente.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Sostegno finanziario per questo studio è venuto da National Natural Science Foundation of China (No. 41775148). I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
contatore di particelle laser ad ariaTSI Inc, MN, USAmodello 9306
Campionatore a sei stadi AndersenTisch Inc, USATE-20-600
AxyPrep kit miniprep DNA multisorgenteAxygen, NY, USAAP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu PolymeraseTransGen Inc., Pechino, CinaAP221-01
Campionatored'aria ad alto volumeBeijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., CinaHH02-LS120
Sistema PCR in tempo realeThermo Fisher Scientific, USAApplied Biosystems® 7500
Soia-Caseina Digest AgarBecton, Dickinson and company, MD, USA211043
Tissuquartz filtriPall, NY, USA7204
Campionatored'aria a parete bagnata17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		SASS 2300

Riferimenti

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