Diagnosi di malattia di Hirschsprung da immunostaining biopsie di aspirazione rettale per calretinina, S100 proteina e proteina gene prodotto 9,5

Sommario

Questo protocollo descrive il processo di immunocolorazione delle biopsie di aspirazione rettale per la calretinina, la proteina S100 e il gene proteico prodotto 9,5. Questo nuovo metodo diagnostico adiuvante per la malattia di Hirschsprung ha un tasso di sensibilità e specificità preferibile.

Abstract

La malattia di Hirschsprung (HD) è una malattia intestinale congenita che si manifesta clinicamente come incapacità di passare il meconio nei neonati o come stipsi a lungo termine nei bambini. La biopsia di aspirazione rettale (RSB) per determinare l'assenza di cellule di ganglio e ipertrofia neurale è il test più accurato per la diagnosi di MH al momento. Colorazione ematossilina-eosina tradizionale manca di sensibilità e specificità. La colorazione dell'acetilcolinesterasi non può essere ampiamente utilizzata a causa del suo complesso processo. Il nostro nuovo protocollo di immunocolorazione per calretinina, proteina S100 e proteina genica prodotto 9,5 (PGP 9.5), che abbiamo condotto su rsbs, presenta elevati tassi di sensibilità e specificità di 96,49% (intervallo di confidenza 95%, 0,88-0,99) e 100% (95% di confidenza intervallo di frequenza, 0,97-1,00), rispettivamente. I segmenti affetti da MH spesso presentano l'assenza dell'espressione di calretinina, proteina S100 e PGP 9.5, che sono marcatori di ipertrofia neurale nel tessuto sottomucoso. Questo protocollo descrive il processo operativo dettagliato di questo nuovo metodo diagnostico.

Introduzione

La malattia di Hirschsprung (HD) è un disturbo intestinale congenito comune caratterizzato da una mancanza di cellule di ganglio in diversi segmenti del tratto intestinale distale¹. Il sistema nervoso enterico umano si forma quando l'invasione delle cellule neurali embrionali è completata. Se c'è un disturbo del processo e l'invasione non riesce a completare, l'intestino distale del neonato diventa aganglionic². Questa condizione potenzialmente fatale è chiamata malattia di Hirschsprung. La proliferazione, la motilità e la crescita intestinale sono i tre componenti principali della colonizzazione di successo.

La colorazione tradizionale di ematossilina e eosina (H & E) di una biopsia submucosa limitata non può raggiungere risultati soddisfacenti come la colorazione H & E di un tessuto a spessore pieno ottenuto dalla chirurgia. Inoltre, la colorazione dell'acetilcolinesterasi (dolore) del tessuto di aspirazione rettale è teoricamente impegnativa a causa della sua inadeguata sensibilità, che è 91%, e l'elaborazione complessa delle sezioni congelate^3,4. Molti altri marcatori immunoistochimici di cellule gangliari e fibre nervose che possono essere macchiati in campioni fissati in formalina e in paraffina stanno gradualmente diventando la diagnostica HD mainstream. La calretinina è una proteina di legame di calcio dipendente dalla vitamina D che non è espressa nel plesso mienterico e submucoso dei segmenti affetti da MH⁵. La proteina S100 è espressa in cellule derivate dalla cresta neurale, come le fibre nervose e le cellule gliali, che spesso presentano ipertrofia neurale nel tessuto submucoso dei segmenti affetti da MH⁶. Il gene proteico prodotto 9,5 (PGP 9.5) macchia in modo affidabile le fibre nervose e le cellule del ganglio; La colorazione di PGP 9.5 agisce come complemento alla colorazione del calretinina, specialmente nei casi di ipoanglionosi isolata. La doppia colorazione con S100 e PGP 9.5 può diminuire il tasso di falsi negativi e aumentare la sensibilità. Come prerequisito, lo studio attuale mira a garantire un'adeguata specificità e un'elevata sensibilità di questo nuovo metodo diagnostico. Il nostro nuovo protocollo ha utilizzato tutti e tre i marcatori per la discriminazione dell'intestino aganglionico e delle fibre nervose ipertrofici. Uno studio prospettico di 318 bambini è stato eseguito dal nostro laboratorio e pubblicato in precedenza senza un protocollo dettagliato⁷. Il protocollo dettagliato e le precauzioni sono discussi in questo articolo. Tutti i neonati che hanno sofferto di un grave problema di defecazione dalla nascita o da bambini affetti da stitichezza cronica, escluse altre malattie comuni, sono potenziali candidati per la biopsia di aspirazione rettale (RSB). Il nostro nuovo protocollo è adatto per la colorazione non solo di RSBs, ma anche di biopsie a pieno spessore o di campioni chirurgici per effettuare una diagnosi finale.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Consiglio etico di ricerca dell'ospedale dell'Unione di Huazhong Università della scienza e della tecnologia.

1. biopsia di aspirazione rettale

1. Eseguire la biopsia di aspirazione rettale da un chirurgo pediatrico ben addestrato e un assistente utilizzando un sistema di biopsia rettale di aspirazione Rbi2 dopo aver ottenuto il consenso informato dal tutore.
   1. Eseguire RSB su pazienti che hanno le seguenti indicazioni: incapacità di passare meconio nei neonati o gonfiore a lungo termine con o senza stitichezza nei bambini; bambini con costipazione a lungo termine che necessitano di olio di paraffina per completare la defecazione; ostruzione intestinale o perforazione intestinale con motivi sconosciuti nei bambini sottoposti a un'enterostomia.
      Nota: le controindicazioni per l'RSB sono le seguenti: i bambini che hanno sintomi gravi, che sono in cattive condizioni fisiche, o che non possono tollerare il RSB; bambini con enterocolite a stadio acuto; bambini sottoposti a anastomosi intestinale senza guarigione completa.
2. Eseguire una normale ritenzione Salina clistere come preparazione dell'intestino 36 h prima della procedura per evitare feci molli e edema eccessivo della mucosa. Aggiungere la soluzione di solfato di magnesio se il bambino ha una grave stipsi. Somministrare la vitamina K (1 mg/kg) ai neonati.
   Nota: non eseguire esami del sangue preoperativi o somministrare antibiotici, in quanto non sono necessari.
3. Mettere il paziente in posizione litotomia. Rivestire la superficie del tubo con olio di paraffina. Inserire il tubo smussato 4-7 cm nel retto con il foro laterale rivolto verso le pareti posteriori o laterali.
4. Applicare una leggera pressione sul tubo per agevolare un'adeguata adesione del foro laterale alla parete rettale. Premere il grilletto e ritirare immediatamente l'utensile.
5. Utilizzare lo strumento per biopsia per ottenere 4 biopsie di aspirazione con un diametro di 2 mm a 3 cm e 6 cm sopra la linea dentale, anteriormente e posteriorly. Usare un ago per posizionare il campione sulla garza inumidito con soluzione salina.
6. Osservare il paziente fino a 2 ore dopo la procedura per escludere il sanguinamento rettale. Evitare ulteriori manipolazioni rettali e anali nelle prime 24 ore dopo RSB.

2. preparazione delle sezioni RSB

1. Posizionare le biopsie di aspirazione rettale in 4% paraformaldeide per 6 h per fissare il tessuto. Utilizzare un volume fissativo 5 volte superiore al volume del tessuto.
2. Disidratare il tessuto usando il disidratatore tissutale patologico per 11 h. L'intero processo programmato è costituito dai seguenti 5 passaggi:
   1. Mettere il tessuto in formaldeide e fissare per 1 h.
   2. Mettere il tessuto in 75% etanolo per 4 h.
   3. Collocare il tessuto in etanolo assoluto (due variazioni, 1 h ciascuna).
   4. Collocare il tessuto in etanolo assoluto (due variazioni, 30 min ciascuna).
   5. Collocare il tessuto in xilene (tre variazioni, 1 h ciascuna).
3. Collocare il tessuto in cera di paraffina (58-60 ° c) (tre variazioni, 1 h ciascuna). Incorporare i tessuti RSB in blocchi di paraffina.
4. Tagliare i blocchi di paraffina utilizzando un microtomo fino a quando il tessuto è completamente esposto con un piano di sezione completo.
5. Tagliare i blocchi in sezioni 0,4 μm con un microtomo.
6. Collocare le sezioni in acqua 45-50 ° c per alcuni secondi ciascuna per consentire la diffusione delle sezioni in una piastra piana.
7. Trasferire le sezioni di paraffina sulle diapositive.
8. Cuocere i vetrini in un forno 60 ° c per 3-5 h. evitare di cuocere troppo a lungo, il che può portare alla perdita degli antigeni.
9. Collocare le diapositive deparaffinizzate in xilene (2 variazioni, 15 min ciascuna).
10. Idratare le diapositive in etanolo assoluto, 95%, 80%, e 75% etanolo per 5 min ciascuno. Quindi, risciacquarli in osmosi inversa (RO)-acqua depurata per altri 5 min.

3. recupero dell'antigene

1. Fare diluizioni di lavoro per il recupero di calretinina miscelando 4 mL di tampone di recupero dell'antigene EDTA con 200 mL di acqua purificata. Fare diluizioni di lavoro per il recupero S100 e PGP 9.5 miscelando 1 mL di tampone di citrato di sodio acido citrico (100x) con 99 mL di acqua purificata.
   Nota: calretinina può essere recuperata preferenzialmente dalla soluzione di recupero EDTA. Tuttavia, tampone di citrato di sodio acido citrico è più adatto per il recupero di S100 e PGP 9.5.
2. Posizionare le diapositive in un barattolo di colorazione vaschetta Coplin. Riempire il barattolo con la soluzione di recupero e posizionarlo in un bagno d'acqua bollente preriscaldato. Dopo aver bollata per 20 minuti, togliere il barattolo dal bagno d'acqua e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Il processo di raffreddamento richiede circa 10 minuti. rimuovere le diapositive e risciacquarle delicatamente una volta con soluzione salina tampone fosfato (PBS).
3. Disegna un cerchio con una penna marcatore intorno al tessuto e prepara una scatola umida per le seguenti procedure.

4. blocco delle

1. Fare diluizioni di lavoro mescolando 3 mL di 30% H₂O₂ con 27 ml di acqua ro-purificata.
2. Aggiungere due o tre gocce di 3% H₂o₂ soluzione goccia sul tessuto per bloccare i perossidati. Aggiungere prontamente la soluzione H₂O₂ per assicurarsi che la soluzione non si overflow dal cerchio. Eseguire il blocco dei perossidati in un incubatore a 37 ° c per 20 min.
3. Sciacquare delicatamente i vetrini con PBS (tre Lavini, 5 min ciascuno).
4. Bloccare i vetrini per 20 minuti a 37 ° c con 5% di albumina sierica bovina (BSA, preparata miscelando 1,5 g di polvere di BSA con 30 mL di acqua purificata).
   Nota: il blocco con 3% H₂O₂ può impedire 95% di colorazione non specifica e il blocco con 5% BSA può impedire l'altro 5% di colorazione non specifica. Combinare i due metodi per ottenere un risultato affidabile.

5. antigene-reazione anticorpale

1. Rimuovere il 5% BSA e aggiungere 50 μL di anticorpo primario (calretinina, S100 o PGP 9.5) alla diapositiva. Incubare durante la notte a 4 ° c.
2. Lavare il vetrino con PBS (tre volte, 3 min ciascuno).
3. Aggiungere 50 μL di potenziatore polimerico (Reagente A; vedere la tabella dei materiali) alla sezione e incubare per 20 minuti in un incubatore a 37 ° c. Quindi, lavare il vetrino con PBS (tre volte, 3 min ciascuno).
4. Aggiungere 50 μL di anticorpo secondario B (anticorpo secondario IgG anti-coniglio/topo di capra) alla sezione e incubare per 30 minuti in un incubatore a 37 ° c. Lavare la sezione con PBS (tre volte, 5 min ciascuno).

6.3, 3-diaminobenzidina e ematossilina colorazione

1. Aggiungere 850 μL di acqua RO-purificata a un tubo da 1,5 mL e aggiungere i reagenti di colorazione (vedere tabella dei materiali) nell'ordine a, B e C. aggiungere 50 μl di ciascun reagente per ottenere un totale di 1 ml di 3, 3-diaminobenzidina (DAB) soluzione di lavoro. Se ci sono precipitati, utilizzare la soluzione dopo la filtrazione.
2. Aggiungere una goccia di soluzione di lavoro DAB alla sezione tissutale e macchia per 3-10 min. Incubare le diapositive in DAB a temperatura ambiente fino a quando non viene rilevata la colorazione marrone. Monitorare con attenzione il microscopio a campo chiaro. Tenere la soluzione di lavoro DAB lontana dalla luce. Quindi, lavare il vetrino con PBS per 5 min.
3. Aggiungere una goccia di ematossilina per contromacchia i nuclei per circa 1 min. Quindi, tenere il barattolo di vaschetta Coplin e lavarlo sotto un filo d'acqua per circa 30-40 s fino a quando il colorante in eccesso viene rimosso. Fare attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto.
4. Immergere le diapositive RSB in un barattolo vaschetta Coplin contenente PBS per 25-30 s. Quindi, differenziare in 1% acido cloridrico-etanolo per 10 s. lavare le diapositive con PBS per 1 min.
5. Deidratare le diapositive in ordine inverso di idratazione: 75%, 80%, 95% e etanolo assoluto (5 min ciascuno).
6. Esporre le diapositive a xilene (2 variazioni, 5 min ciascuna).
7. Montare il vetrino coprioggetti utilizzando il montaggio ULTRACLEAN. Lasciare asciugare le diapositive prima della visualizzazione utilizzando un microscopio.

Risultati

In totale, 318 pazienti sono stati arruolati nel nostro studio. Tutti i pazienti erano sottoposti a RSB e i tessuti erano macchiati per calretinina, S100 e PGP 9.5. La diagnosi basata sul nostro nuovo protocollo è stata la MH in 97 casi, non HD in 213 casi, e sospetta MH in 8 casi. Tra i 132 pazienti chirurgici, 99 pazienti sono stati diagnosticati con MH mediante immunocolorazione di campioni a pieno spessore dopo l'intervento chirurgico. La colorazione S100 e PGP 9.5 ha mostrato che il ...

Discussione

Qui abbiamo descritto una procedura che utilizza tre diversi anticorpi immunoistochimici per macchiare le sezioni RBS per la diagnosi di MH. La sensibilità del nostro protocollo diagnostico era 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), e la specificità era 100% (95% CI, 0,97-1.00).

Le fasi più critiche del protocollo sono RSB e reazione di antigene-anticorpo. La dimensione della biopsia determina l'accuratezza della colorazione. Una piccola biopsia non fornirà abbastanza tessuto per fare una diagnosi precis...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anticorpo alla calretinina	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	anticorpo: anticorpo primario
Anticorpo S-100 MXB	Biotechnologies	Kit-0007	anticorpo: anticorpo primario
PGP9.5 anticorpo	Shanghai long island antibody Co. Ltd	R-0457-03	di anticorpi primari
	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	anticorpo: anticorpo secondario A
Capra anti-coniglio/topo IgG Anticorpo secondario	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	anticorpo: anticorpo secondario B
Kit di colorazione DAB (contenente reagenti A, B e C)	MXB Biotechnologies	Kit di colorazione DAB-0031	Incubatore
termico	Shanghai yiheng instrument Co. Ltd	DHP-9082	strumento
Rbi2 aspirazione biopsia rettale sistema	Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia	CP1200 HP1000 SS1000
strumento microtomo	Leica	leica RM2016	strumento
acido citrico citrato di sodio tampone (100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	tampone per il recupero dell'antigene
disidratatore tissutale patologico	wuhan junjie electronic Co. Ltd	JT-12F	strumento

anticorpo: reagente potenziatore