Articolo metodologico

Analizzando per polifosfato inorganico nei batteri

DOI:

10.3791/58818

⸱

21 gennaio 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un metodo semplice per rapida quantificazione di polifosfato inorganico in diversi batteri, tra cui specie micobatteriche, Gram-positivi e Gram-negative.

Abstract

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Polifosfato inorganico (polipo) è un polimero biologico trovato in cellule da tutti i domini della vita ed è necessaria per la virulenza e la risposta allo stress in molti batteri. Ci sono una varietà di metodi per quantificare polyP nei materiali biologici, molti dei quali sono laboriosi o insensibile, limitando la loro utilità. Presentiamo qui un metodo semplificato per la quantificazione del polipo nei batteri, usando un'estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un'elaborazione rapida di più campioni, digestione del polipo con il polipo specifiche exopolyphosphatase ScPPX e rilevamento della risultante fosfato libero con un saggio colorimetrico basato su acido ascorbico sensibile. Questa procedura è semplice, poco costoso e permette la quantificazione affidabile polipo in diverse specie batteriche. Vi presentiamo la quantificazione di polipo rappresentativo dal batterio gram-negativo (Escherichia coli), il batterio gram-positivo dell'acido lattico (Lactobacillus reuteri) e la specie micobatterica (Mycobacterium smegmatis). Abbiamo anche un semplice protocollo per purificazione di affinità del nichel di quantità di mg di ScPPX, che non è attualmente disponibile in commercio.

Introduzione

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Polifosfato inorganico (polipo) è un biopolimero lineare delle unità di fosfato phosphoanhydride-collegato che si trova in tutti i domini di vita1,2,3. In diversi batteri, polipo è essenziale per la risposta allo stress, motilità, formazione di biofilm, controllo del ciclo cellulare, antibiotico-resistenza e virulenza4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studi del metabolismo di polipo in batteri quindi hanno il potenziale per produrre intuizioni fondamentali la capacità dei batteri di causare malattia e prosperano in ambienti diversi. In molti casi, tuttavia, i metodi disponibili per quantificare polipo in cellule batteriche sono un fattore limitante in questi studi.

Ci sono diversi metodi attualmente utilizzati per misurare i livelli di polipo in materiali biologici. Questi metodi implicano in genere due fasi distinte: estrazione di polipo e quantificare il polipo presente in tali estratti. L'attuale metodo gold standard, sviluppato per il lievito Saccharomyces cerevisiae da Bru e colleghi12, polipo estratti insieme a DNA e RNA usando fenolo e cloroformio, seguita dalla precipitazione dell'etanolo, il trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) e ribonucleasi (RNasi) e la digestione del polyP purificato risultante con lo S. cerevisiae polipo-degradanti enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 a cedere gratis fosfato, che è poi quantificato utilizzando un analisi colorimetrica base verde di malachite. Questa procedura è altamente quantitativa ma alta intensità di lavoro, limitando il numero di campioni che possono essere elaborati in un singolo esperimento e non è ottimizzato per campioni batterici. Altri hanno segnalato estrazione polipo da una varietà di cellule e tessuti utilizzando perline ("glassmilk") di silice o silice membrana colonne6,14,15,16,17, 18. Questi metodi non estrarre in modo efficiente catena corta polipo (meno di 60 unità di fosfato)12,14,15, anche se questo è di meno preoccupazione per i batteri, che sono pensati generalmente per sintetizzare principalmente Polipo della lungo-catena3. Vecchi metodi di estrazione di polipo con acidi forti19,20 non più ampiamente sono usati, poiché il polyP è instabile in condizioni acide12.

Ci sono anche una varietà di metodi segnalati per quantificare il polyP. Tra i più comuni è 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), una tintura fluorescente più tipicamente usata per macchiare il DNA. Complessi di DAPI-polipo hanno maxima di eccitazione e di emissione di fluorescenza diversi oltre DAPI-DNA complessi21,22, ma c'è una notevole interferenza da altri componenti cellulari, tra cui RNA, nucleotidi e inositolo fosfati12,15,16,23, riducendo la specificità e la sensibilità delle misurazioni di polipo effettuate utilizzando questo metodo. In alternativa, il polipo e adenosina difosfato (ADP) può essere convertiti in adenosina trifosfato (ATP) usando purificato Escherichia coli chinasi polipo (PPK) e l'ATP risultante quantificati tramite luciferasi14,17 ,18. Questo permette la rilevazione di piccole quantità di polipo, ma richiede due fasi di reazione enzimatica e luciferina e ADP molto puro, che sono i reagenti costosi. In particolare il digest polipo in fosfato libero6,12,13,24, che può essere rilevato utilizzando metodi più semplici, ma ScPPX è inibita da DNA e RNA12, ScPPX trattamento della dnasi e RNasi che necessita di polipo-contenenti estratti. PPK, né ScPPX sono disponibili in commercio, e purificazione di PPK è relativamente complesso25,26.

Polipo in lisati cellulari o estratti possa anche essere visualizzato su gel di poliacrilammide di DAPI27,28,29,30, un metodo che permette la valutazione della lunghezza della catena, ma è la macchiatura negativa scarsamente quantitativa e bassa velocità.

Ora segnaliamo un saggio di polipo veloce, poco costoso, media-velocità di trasmissione che permette la rapida quantificazione del polyP livelli in diverse specie batteriche. Questo metodo inizia con la lisi delle cellule batteriche a 95 ° C in 4m guanidina isotiocianato (GITC)14 per inattivare cellulare fosfatasi, seguite da un'estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un'elaborazione rapida di campioni multipli. Il polipo-contenere l'Estratto risultante viene poi digerito con un grande eccesso di ScPPX, eliminando la necessità per il trattamento della dnasi e RNasi. Includiamo un protocollo per la purificazione di affinità nichel semplice di quantità di mg di ScPPX. Infine, fosfato libero polipo-derivato è quantificato con un saggio colorimetrico semplice, sensibile, basati su acido ascorbico24 e normalizzato a proteine cellulari totali. Questo metodo semplifica la misurazione del polipo in cellule batteriche, e dimostriamo l'utilizzo con specie rappresentative di batteri gram-negativi, batteri Gram-positivi e micobatteri.

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Protocollo

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1. purificare il lievito Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Trasformare il ceppo di sovraespressione di proteina di e. coli BL21 (DE3)31 con plasmide pScPPX26 di elettroporazione32 o trasformazione chimica33.
  2. Inoculare 1 L di brodo di Lisogenesi (LB) contenente 100 µ g ampicillina di-1 mL in un pallone da 2 L unbaffled con una singola colonia di BL21 (DE3) contenente pScPPX2 e incubi durante la notte a 37 ° C senza agitazione, per un'assorbanza a 600 nm (un600) di circa 0.3, misurata con uno spettrofotometro.
  3. Avviare la cultura agitazione (180 giri/min) e incubare per 30 min a 37 ° C, durante il quale le cellule crescerà a un A600 di 0,4 - 0,5.
  4. Aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e un ulteriore 100 µ g mL-1 è ampicillin, quindi incubare per 4 h a 37 ° C con agitazione a 180 giri/min.
    Nota: Questo protocollo di sovraespressione genera una grande quantità di ScPPX solubile. Tuttavia, la sovraespressione di ScPPX è molto indulgente, e una varietà di altri comuni protocolli di sovraespressione della proteina sono stati usati per purificare con successo ScPPX.
  5. Trasferire le cellule a una centrifuga 1 L e raccoglierle mediante centrifugazione per 20 min a 5000 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante e trasferire il pellet cellulare in una provetta conica da 50 mL.
    Nota: Palline delle cellule possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C.
  6. Scongelare il pellet sul ghiaccio, quindi esso risospendere in 9 mL di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl e imidazolo di 5 mM (pH 8) per un volume totale di circa 10 mL.
  7. Aggiungere (concentrazioni finali) 1 mg mL-1 lisozima, 2 mM MgCl2e 50 unità mL-1 di un'endonucleasi di RNA e DNA-degradanti (Vedi Tabella materiali) ed incubare per 30 min in ghiaccio.
    Nota: ScPPX lega gli acidi nucleici (dati non mostrati), così il trattamento nucleasi è essenziale durante la purificazione.
  8. Utilizzando un sonicatore con un microtip (Vedi Tabella materiali), lisare le cellule da 2 cicli di sonicazione su ghiaccio al 50% di potenza, pulsare 5 s s on e 5 fuori, con un resto di 2 min tra i cicli.
    Nota: Utilizzare adeguate protezioni acustiche durante la sonicazione. Analogamente al caso con sovraespressione, una varietà di metodi di lisi delle cellule sono accettabili per la purificazione di ScPPX.
  9. Rimuovere i detriti insolubili mediante centrifugazione il lisato per 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante risultante (circa 10 mL) attraverso un filtro di siringa di 0,8 µm poro dimensione dell'acetato di cellulosa.
  10. Caricare il lisato su una carica di nichel 5 mL chelanti colonna (Vedi Tabella materiali) utilizzando una pompa peristaltica o una grossa siringa.
  11. Lavare la colonna con 50 mL di imidazolo di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM (pH 8).
  12. Lavare la colonna con 50 mL di imidazolo di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM (pH 8).
  13. Eluire ScPPX con 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl e imidazolo di 0,5 M (pH 8), raccolta 15 frazioni di 1 mL. Prova queste frazioni di eluizione per contenuto proteico con il dosaggio di proteina Bradford34 (Vedi Tabella materiali) ed eseguire un gel di SDS-PAGE35 per confermare quali frazioni contengono ScPPX purificata (peso molecolare = 45 kDa).
  14. Piscina le frazioni contenenti ScPPX puro e regolare la concentrazione della proteina in pool di circa 2 mg mL-1 con 50 mM HEPES e 0,5 M di NaCl. Più alte concentrazioni di proteina possono precipitare nel passaggio successivo.
  15. Scambiare il ScPPX purificata nel buffer di memoria (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glicerolo al 10% [v/v]) tramite dialisi. Inserire frazioni ScPPX raccolte in una lunghezza sigillata di 12.000-14.000 Da peso molecolare cutoff dialisi membrana tubazione (Vedi Tabella materiali) e sospendere in 1 L di buffer di archiviazione con continua agitazione a 4 ° C per almeno 4 h. Ripetere questo passaggio con prodotti freschi buffer di memoria per un totale di 3 cambi di buffer.
  16. Trasferire la proteina purificata, dializzata una provetta da centrifuga o tubi e centrifugare per 20 min a 20.000 x g a 4 ° C per rimuovere eventuali aggregati insolubili. Trasferire con cautela il surnatante in una provetta conica pulito da 15 mL.
  17. Regolare la concentrazione della ScPPX purificata a 1 mg mL-1 con buffer di archiviazione, aggiungere 0,1% (p/v) l'albumina di siero bovino indenne da proteasi (BSA; concentrazione finale) e conservare fino a 6 mesi a 4 ° C.
    Nota: ScPPX perde oltre il 90% della sua attività quando è congelato13.

2. raccolta campioni per l'estrazione di polifosfato

  1. Crescere i batteri sotto le condizioni di interesse per determinare il contenuto di polipo. Per questo protocollo, crescere Lactobacillus reuteri36 durante la notte a 37 ° C senza agitazione all'enzima malico induzione (MEI) media37 senza cisteina (MEI-C).
  2. Raccogliere abbastanza cellule mediante centrifugazione in una microcentrifuga da 1,5 mL a totale 50 – 100 µ g di proteina cellulare (Vedi punto 3 qui sotto). Per e. coli, si tratta di 1 mL di una cultura di fase di log a un A600 di 0.2 - 0.4. Di L. reuteri, si tratta di 1 mL di una coltura durante la notte. Regolare come necessario per le altre specie di interesse.
  3. Rimuovere completamente il supernatante dal pellet cellulare.
  4. Risospendere il pellet cellulare in 250 µ l di tampone di lisi GITC (4m guanidina isotiocianato, 50 mM Tris-HCl, pH 7) e lisare mediante incubazione a 95 ° C per 10 min. Store lisati a-80 ° C.
    Nota: Essere coerente con il tempo di Lisi, poiché estesa incubazione a temperatura elevata potrebbe causare riduzione del polyP di idrolisi38. Lisati possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C.
    Attenzione: Guanidina isotiocianato è un sale di caotropici e dovrebbe essere maneggiato con guanti e smaltito come rifiuti pericolosi.

3. misurazione del contenuto di proteina di lisati cellulari

  1. Preparare gli standard di BSA che contiene 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL-1 di BSA in tampone di lisi GITC.
    Nota: È importante rendere gli standard di BSA in GITC, poiché GITC influenza lo sviluppo del colore dell'analisi di Bradford. Standard di BSA possono essere conservati a tempo indeterminato a-20 ° C.
  2. Aliquotare 5 µ l di lisati cellulari scongelati, omogeneizzato e di standard di BSA per separare pozzetti in una piastra a 96 pozzetti chiaro.
  3. Aggiungere 195 µ l di reagente di Bradford34 in ciascun pozzetto e misurare l'assorbanza a 595 nm (un595) in un lettore di piastra (Vedi Tabella materiali).
  4. Calcolare la quantità di proteina in ciascun pozzetto di confronto con la curva standard di BSA, usando la formula y = mx + b, dove y è un595, x è µ g di BSA, m è la pendenza della curva standard, e b è l'intercetta y della curva standard. Moltiplicare il valore risultante da 0.05 a determinare il totale mg di proteina in ciascun campione.

4. estrazione di polifosfato

  1. Aggiungere 250 µ l di etanolo al 95% per ogni campione GITC-lisati e vortex per mescolare.
  2. Applicare tale miscela per una colonna di silice membrana spin e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
  3. Scartare il flusso continuo, poi aggiungere 750 µ l di 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% di etanolo e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
  4. Eliminare il flusso continuo e centrifugare per 2 min 16.100 x g.
  5. Posizionare la colonna in una provetta di microfuge pulito da 1,5 mL e aggiungere 150 µ l di 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi eluire il polipo mediante centrifugazione per 2 min a 8.000 x g.
    Nota: Se lo si desidera, gli eluati possono conservati a-20 ° C per almeno 1 settimana.

5. digerendo polifosfato

  1. Preparare standard contenenti lo 0, 5, 50 o fosfato di potassio 200 µM in 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Nota: Fosfati di potassio possono essere conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
  2. Aliquotare e 100 µ l di ogni standard di fosfato e di estratti campioni di polipo in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti chiaro.
  3. Preparare un mix master contenente (per campione): 30 µ l di 5 x ScPPX reazione tampone (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 millimetri di acetato di ammonio, pH 7.5)13e 19 µ l di H2O 1 µ l di ScPPX purificato (1 mg mL-1).
  4. Aggiungere 50 µ l di master mix in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti. Incubare per 15 min a 37 ° C.
    Nota: Se lo si desidera, i polipo digerito campioni possono essere conservati a-20 ° C a tempo indeterminato.

6. rilevazione fosfato libero24

  1. Preparare la soluzione di rilevamento base sciogliendo 0,185 g di tartrato di antimonio in 200 mL di acqua, aggiungere 150 mL di 4 N H2così4, aggiungendo quindi 1,49 g di Eptamolibdato di ammonio. Mescolare per sciogliere e quindi portare ad un volume finale di 456 mL. Filtrare la soluzione per rimuovere particelle e conservare al riparo dalla luce a 4 ° C per 1 mese.
  2. Preparare una soluzione di acido ascorbico 1 M. Conservare al riparo dalla luce a 4 ° C per 1 mese.
  3. Preparare un brodo di lavoro fresco di soluzione di rilevamento ogni giorno mescolando 9,12 mL di soluzione di rilevamento base con 0,88 mL di acido ascorbico 1 M. Lasciare la soluzione di rilevamento di venire a temperatura ambiente prima dell'uso.
  4. Aggiungere 50 µ l di soluzione di rilevamento per ogni campione e standard della piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per circa 2 min consentire lo sviluppo di colore.
  5. Misurare l'assorbanza a 882 nm con un lettore di piastra e calcolare la concentrazione di fosfato di ciascun campione in confronto alla curva standard del fosfato di potassio.
    Attenzione: La soluzione di rilevamento contiene sali tossici e acidi forti. Indossare guanti e trattare la soluzione in eccesso come rifiuti tossici.

7. calcolo del contenuto cellulare di polifosfato

  1. Convertire le concentrazioni di fosfato determinate nel passaggio 6.5 a nanomoles di polipo-derivati fosfato in ogni cella intero lisato secondo la seguente formula:
    Polipo nmol = 1,5 x (fosfato µM / 10)
    Nota: Il metodo basato sulla curva standard nel passaggio 6 determina la concentrazione di fosfato (in µM) in ciascun campione di polipo µ l 100 aliquotati al punto 5.2. Per convertire questa concentrazione in un numero di nmol, 100 µ l è diviso per 106 per dare un volume in L, moltiplicato per la concentrazione (µmol L-1), quindi moltiplicato per 1.000 (il numero di nmol in un µmol). Questo riduce al dividendo la concentrazione per 10. Il volume di estratto totale preparato nel passaggio 4 è 150 µ l, quindi è necessario moltiplicare il valore risultante per 1,5 per calcolare il nmol di fosfato presente nell'estratto intero.
  2. Normalizzare il contenuto cellulare polipo alla proteina cellulare totale dividendo nmol polipo per la proteina totale di mg in ogni campione determinato al punto 3.4. Livelli di polipo sono espressi in termini di concentrazione di fosfato libero polipo-derivati individuo.
    Nota: In alcuni casi, la quantità di fosfato di polipo-derivati presente in un campione può rientrano nel range lineare della curva standard fosfato (passo 6.5). Se i livelli del polyP sono molto elevati, l'eluato contenente polipo in eccesso dal passaggio 4.6 può essere diluito 01:10 o 1: 100, se necessario e poi misurato nuovamente come descritto nei passaggi da 5 a 7.

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Risultati

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I passaggi chiave del protocollo sono diagrammed in forma semplificata nella Figura 1.

Per illustrare l'utilizzo di questo protocollo con i batteri gram-negativi, il selvaggio-tipo e. coli MG165539 era cresciuto fino a Mid-registro fase nel terreno ricco di LB a 37 ° C con agitazione (200 giri), quindi sciacquati e incubati per altre 2 h in morpholinopropanesulfonate...

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Discussione

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Il protocollo descritto qui semplifica e accelera la quantificazione dei livelli di polipo in diversi batteri, con un tipico insieme di 24 campioni prendendo circa 1,5 h per elaborare completamente. Questo permette di screening rapido di campioni e analisi di librerie mutante e semplifica il esperimenti cinetici misura l'accumulo di polipo nel corso del tempo. Abbiamo dimostrato che il protocollo funziona in modo efficace sui rappresentanti di tre diversi phyla: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, che sono noti ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo progetto era sostenuto dalla University of Alabama a Birmingham dipartimento di microbiologia avvio fondi e sovvenzioni NIH R35GM124590 (per MJG) e NIH sovvenzione R01AI121364 (FW).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmide pScPPX2Addgene112877disponibile per istituzioni accademiche e altre istituzioni senza scopo di lucro
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli mezzo di crescita
ampicillinaFisher ScientificBP176025
isopropilβ-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
tampone HEPESBiotechnologyH-400-1
idrossido di potassio (KOH)Fisher ScientificP250500per la regolazione del pH delle soluzioni tamponate con HEPES
cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoloFisher Lisozima O3196500
scientifico Fisher ScientificAAJ6070106
cloruro di magnesio (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) è un sostituto accettabile
Modello 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120anche altri metodi di lisi cellulare (ad es. French Press) possono essere efficaci
5 mL di colonna HP chelante HiTrapGE Life Sciences17040901qualsiasi colonna cromatografica di affinità al nichel o resina potrebbe essere sostituita
solfato di nichel(II) esaidratoScientificAC415611000per caricare la colonna HiTrap
0,8 e micro; m pori di dimensioni dei pori filtri per siringhe in acetato di cellulosaFisher Scientific09-302-168
Reagente BradfordBio-Rad5000205
tampone TrisFisher ScientificBP1525
Spectrum  Spectra/Por 4 RC Membrana per dialisi Tubi da 12.000 a 14.000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Baltre membrane per dialisi con MWCO < 30.000 Da dovrebbero funzionare anche
acido cloridrico (HCl)Fisher ScientificA144-212per la regolazione del pH delle soluzioni tamponate con Tris
cloruro di potassio (KCl)Fisher ScientificP217500
gliceroloFisher ScientificBP2294
10x MOPS media miscelaTeknovaM2101E. coli crescita
medio glucosioFisher ScientificD161
monobasico potassio fosfato (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
potassio bibasico fosfato (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
estratto di lievito disidratatoFisher ScientificDF0886-17-0
triptoneFisher ScientificBP1421-500
solfato di magnesio eptaidratoFisher ScientificM63-50
solfato di manganese monoidratoFisher ScientificM113-500
guanidina isotiocianatoFisher ScientificBP221-250
albumina sierica bovina (senza proteasi)Fisher ScientificBP9703100
piastre a 96 pozzetti a fondo piatto trasparenteSigma-AldrichM0812-100EAqualsiasi piastra a 96 pozzetti trasparente funzionerà
Tecan M1000 Lettore di piastre infinitoTecan, Inc.non applicabilequalsiasi lettore di piastre in grado di misurare l'assorbanza a 595 e 882 nm funzionerà
etanoloFisher Scientific04-355-451
colonne di spin con membrana di siliceEpoch Life Science1910-050/250
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Fisher ScientificBP120500
provette per microfuge da 1,5 mLFisher ScientificNC9580154
acetato di ammonioFisher ScientificA637-500
antimonio tartrato di potassioFisher ScientificAAA1088922
acido solforico 4 N (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
eptamolibdato di ammonioFisher ScientificAAA1376630
acido ascorbicoFisher AC401471000
Gold Fisher scientifico

Riferimenti

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