Descriviamo un metodo semplice per rapida quantificazione di polifosfato inorganico in diversi batteri, tra cui specie micobatteriche, Gram-positivi e Gram-negative.
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Articolo metodologico
Analizzando per polifosfato inorganico nei batteri
In questo articolo
Sommario
Abstract
Polifosfato inorganico (polipo) è un polimero biologico trovato in cellule da tutti i domini della vita ed è necessaria per la virulenza e la risposta allo stress in molti batteri. Ci sono una varietà di metodi per quantificare polyP nei materiali biologici, molti dei quali sono laboriosi o insensibile, limitando la loro utilità. Presentiamo qui un metodo semplificato per la quantificazione del polipo nei batteri, usando un'estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un'elaborazione rapida di più campioni, digestione del polipo con il polipo specifiche exopolyphosphatase ScPPX e rilevamento della risultante fosfato libero con un saggio colorimetrico basato su acido ascorbico sensibile. Questa procedura è semplice, poco costoso e permette la quantificazione affidabile polipo in diverse specie batteriche. Vi presentiamo la quantificazione di polipo rappresentativo dal batterio gram-negativo (Escherichia coli), il batterio gram-positivo dell'acido lattico (Lactobacillus reuteri) e la specie micobatterica (Mycobacterium smegmatis). Abbiamo anche un semplice protocollo per purificazione di affinità del nichel di quantità di mg di ScPPX, che non è attualmente disponibile in commercio.
Introduzione
Polifosfato inorganico (polipo) è un biopolimero lineare delle unità di fosfato phosphoanhydride-collegato che si trova in tutti i domini di vita1,2,3. In diversi batteri, polipo è essenziale per la risposta allo stress, motilità, formazione di biofilm, controllo del ciclo cellulare, antibiotico-resistenza e virulenza4,5,6,7,8 ,9,10,<....
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Protocollo
1. purificare il lievito Exopolyphosphatase (ScPPX)
- Trasformare il ceppo di sovraespressione di proteina di e. coli BL21 (DE3)31 con plasmide pScPPX26 di elettroporazione32 o trasformazione chimica33.
- Inoculare 1 L di brodo di Lisogenesi (LB) contenente 100 µ g ampicillina di-1 mL in un pallone da 2 L unbaffled con una singola colonia di BL21 (DE3) contenente pScPPX2 e incubi durante la notte a 37 ° C senza agitazione, per un'assorbanza a 600 nm (un600) di circa 0.3, misurata con uno spettrofotometro.
- Avviare la c....
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Risultati
I passaggi chiave del protocollo sono diagrammed in forma semplificata nella Figura 1.
Per illustrare l'utilizzo di questo protocollo con i batteri gram-negativi, il selvaggio-tipo e. coli MG165539 era cresciuto fino a Mid-registro fase nel terreno ricco di LB a 37 ° C con agitazione (200 giri), quindi sciacquati e incubati per altre 2 h in morpholinopropanesulfonate.......
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Discussione
Il protocollo descritto qui semplifica e accelera la quantificazione dei livelli di polipo in diversi batteri, con un tipico insieme di 24 campioni prendendo circa 1,5 h per elaborare completamente. Questo permette di screening rapido di campioni e analisi di librerie mutante e semplifica il esperimenti cinetici misura l'accumulo di polipo nel corso del tempo. Abbiamo dimostrato che il protocollo funziona in modo efficace sui rappresentanti di tre diversi phyla: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, che sono noti .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto era sostenuto dalla University of Alabama a Birmingham dipartimento di microbiologia avvio fondi e sovvenzioni NIH R35GM124590 (per MJG) e NIH sovvenzione R01AI121364 (FW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmide pScPPX2 | Addgene | 112877 | disponibile per istituzioni accademiche e altre istituzioni senza scopo di lucro |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli mezzo di crescita |
| ampicillina | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropilβ-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| tampone HEPES | Biotechnology | H-400-1 | |
| idrossido di potassio (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | per la regolazione del pH delle soluzioni tamponate con HEPES |
| cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazolo | Fisher | Lisozima O3196500 | |
| scientifico Fisher Scientific | AAJ6070106 | ||
| cloruro di magnesio (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) è un sostituto accettabile |
| Modello 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | anche altri metodi di lisi cellulare (ad es. French Press) possono essere efficaci |
| 5 mL di colonna HP chelante HiTrap | GE Life Sciences | 17040901 | qualsiasi colonna cromatografica di affinità al nichel o resina potrebbe essere sostituita |
| solfato di nichel(II) esaidrato | Scientific | AC415611000 | per caricare la colonna HiTrap |
| 0,8 e micro; m pori di dimensioni dei pori filtri per siringhe in acetato di cellulosa | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Reagente Bradford | Bio-Rad | 5000205 | |
| tampone Tris | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Membrana per dialisi Tubi da 12.000 a 14.000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | altre membrane per dialisi con MWCO < 30.000 Da dovrebbero funzionare anche |
| acido cloridrico (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | per la regolazione del pH delle soluzioni tamponate con Tris |
| cloruro di potassio (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glicerolo | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS media miscela | Teknova | M2101 | E. coli crescita |
| medio glucosio | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasico potassio fosfato (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| potassio bibasico fosfato (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| estratto di lievito disidratato | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| triptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| solfato di magnesio eptaidrato | Fisher Scientific | M63-50 | |
| solfato di manganese monoidrato | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidina isotiocianato | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| albumina sierica bovina (senza proteasi) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| piastre a 96 pozzetti a fondo piatto trasparente | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | qualsiasi piastra a 96 pozzetti trasparente funzionerà |
| Tecan M1000 Lettore di piastre infinito | Tecan, Inc. | non applicabile | qualsiasi lettore di piastre in grado di misurare l'assorbanza a 595 e 882 nm funzionerà |
| etanolo | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| colonne di spin con membrana di silice | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| provette per microfuge da 1,5 mL | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| acetato di ammonio | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimonio tartrato di potassio | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| acido solforico 4 N (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| eptamolibdato di ammonio | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| acido ascorbico | Fisher AC401471000 |
Riferimenti
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator.....
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Ristampe e permessi
