La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

Abstract

Cromatina, che è una lunga catena di subunità nucleosoma, è un sistema dinamico che permette tali processi critici come replicazione del DNA e la trascrizione di prendere posto nelle cellule eucariotiche. La dinamica dei nucleosomi fornisce l'accesso al DNA di replicazione e trascrizione macchinari e criticamente contribuisce ai meccanismi molecolari sottostanti le funzioni della cromatina. Studi di singola molecola come microscopia a forza atomica (AFM) imaging hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione corrente del ruolo del nucleosoma struttura e dinamica. L'attuale protocollo viene descritta la procedura di attivazione di tecniche di imaging ad alta risoluzione AFM studiare le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Il protocollo è illustrato dai dati AFM ottenuti per i nucleosomes centromero in cui istone H3 è sostituito con proteina di sua controparte centromero (CENP-A). Il protocollo inizia con l'Assemblea del mono-nucleosomi utilizzando un metodo di diluizione di continuo. La preparazione del substrato mica funzionalizzato con amminopropil silatrane (APS-mica) che viene utilizzato per l'imaging del nucleosoma è critica per la visualizzazione di AFM dei nucleosomi descritto e viene fornita la procedura per preparare il substrato. Nucleosomi depositati sulla superficie della APS-mica sono prima Imaging utilizzando statico AFM, che cattura un'istantanea della popolazione nucleosoma. Dall'analisi di queste immagini, parametri quali la dimensione del DNA avvolto intorno i nucleosomes possono essere misurate e questo processo è anche dettagliato. Il time-lapse AFM procedura nel liquido di imaging è descritto per l'alta velocità AFM time-lapse che può catturare diversi frame delle dinamiche nucleosoma al secondo. Infine, l'analisi delle dinamiche del nucleosoma consentendo la caratterizzazione quantitativa dei processi dinamici è descritta e illustrata.

Introduction

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è altamente condensata e organizzato in cromosomi. ¹ il primo livello di organizzazione del DNA all'interno di un cromosoma è l'Assemblea di nucleosomi in cui 147 bp di DNA è strettamente avvolto intorno ad un nucleo istonico istone. ^{2 , 3} particelle nucleosome montare su una lunga molecola di DNA che formano una matrice di cromatina che viene organizzata fino a formare un'unità estremamente compatta del cromosoma. ⁴ il disassemblaggio della cromatina fornisce l'accesso per liberare il DNA richiesto dalla critici processi cellul....

Protocol

1. continuo diluizione Assemblea del Mono-nucleosomi

1. Generare e purificare un substrato di DNA bp circa 400 che contiene un decentrato Widom 601 nucleosoma sequenza di posizionamento. ⁵⁵
   Nota: Per limitare la formazione indesiderata di-nucleosomi, ogni 'braccio' che fiancheggiano la sequenza di posizionamento non deve superare ~ 150 bp.
   1. Utilizzare il plasmide pGEM3Z-601 insieme con gli iniettori progettati e amplificare il DNA substrato usando la PCR. Per il substrato 423 bp con lunghezze di braccio di 122 e 154 bp usato qui, utilizzare avanti (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e inversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') primer.
   ....

Results

Mono-nucleosomi sono stati preparati prima per AFM imaging esperimenti utilizzando un metodo di assemblaggio di continuo diluizione (Figura 1). I nucleosomes preparati erano poi controllati mediante SDS-PAGE discontinua (Figura 2). Una superficie di mica era successiva funzionalizzata con APS, che cattura nucleosomi alla superficie pur mantenendo un fondo liscio per imaging ad alta risoluzione (Figura 3). Nucleosomi sono stati depos.......

Discussion

Il protocollo descritto sopra è piuttosto semplice e fornire risultati altamente riproducibili, anche se alcuni problemi importanti possono essere enfatizzati. Funzionalizzati APS-mica è un substrato fondamentale per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Un'elevata stabilità di APS-mica è una delle caratteristiche importanti di questo substrato che permette di preparare il substrato imaging in anticipo per l'uso che può essere utilizzato almeno due settimane dopo la fase di preparazione. ⁵⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmide pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	Custom Order	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerasi	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Numero di catalogo per 200 unità
Kit di purificazione PCR	Qiagen, Hilden, Germania	28104	Numero di catalogo per 50 unità
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Numero di catalogo per 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Numero di catalogo per 500 g
(CENP-A/H4)2, EpiCypher umano ricombinante	, Durham, NC	16-0010	Numero di catalogo per 50 ug
H2A/H2B, EpiCypher umano ricombinante	, Durham, NC	15-0311	Numero di catalogo per 50 ug
H3 Octamer, ricombinante umano	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	Numero di catalogo per 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Numero di catalogo per 10 dispositivi
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numero di catalogo per 500 mg
Amicon Ultra-0,5  Filtri centrifughi mL	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Numero di catalogo per 8 dispositivi
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numero di catalogo per 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numero di catalogo per 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numero di catalogo per 1 kg
di persolfato di ammonio (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Codice prodotto 10 g
acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Codice prodotto 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Numero di catalogo per 5 mL
4x tampone proteico Laemmli per SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Numero di catalogo per 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Numero di catalogo per 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Numero di catalogo per 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Numero di catalogo per
salviette in tessuto non tessuto da 1 L per camera bianca: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grado-1
Aminopropil silatrane (APS)	Sintetizzato come descritto in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numero di catalogo per 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda AFM TESPA-V2 (per imaging statico)	Sonde AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonda AFM MSNL-10 (per imaging time-lapse standard)	Sonde AFM Bruker, Camarillo, CA
Colla Krazy industriale Aron Alpha	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Numero di catalogo per tubo da 2 g
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Numero di catalogo per 100 g
Filtro Millex-GP, 0,22  µ m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numero di catalogo per 10 dispositivi
BL-AC10DS-A2 afm sonda (per HS-AFM)	Olympus, Giappone
Composto FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Giappone
Composto FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Giappone
Microscopio a forza atomica multimodale	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
Microsocopia a forza atomica time-lapse ad alta velocità	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Università di Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Giappone