Saggi per il tasso di crescita specifico e la capacità di cella-associazione di Rotavirus

Virus del RNA forma una popolazione geneticamente eterogenea, nota come quasispecie¹, a causa del loro tasso di mutazione,² che è superiore a quello degli organismi basati sul DNA. Struttura della popolazione in quasispecie è influenzata da fattori genetici della popolazione, tra cui la deriva genetica, mutazione e selezione pressione. Ceppi all'interno di una singola stirpe genetico possono mostrare differenti fenotipi a causa della diversità genetica. Ad esempio, Devid et al ha mostrato che la sensibilità di cloro libero era differente fra ceppi murini norovirus che ha avuto origine da un ceppo di placca-purificato S7-PP3³.

Rotavirus (rotavirus di genere nella famiglia reoviridae) sono virus non capsulati ds RNA formando delle quasispecie². Oltre ai fattori genetici di popolazione sopra descritti, riassortimento genoma colpisce la diversità genetica del rotavirus perché questo virus ha 11 genoma segmentato⁴. I rotavirus causano diarrea principalmente fra gli infanti, e morti infantili nel 2013 sono stati stimati circa 250.000⁵. Due vaccini sono in uso in diversi paesi e sono stati efficaci nel ridurre l'onere dell'infezione di rotavirus, ma alcuni ricercatori stanno ora discutendo la presenza del vaccino-fuga mutanti^{6,7,8, 9}. la caratterizzazione di questi mutanti è importante capire i meccanismi del vaccino-fuga.

Qui, presentiamo protocolli per due saggi per valutare il tasso di crescita specifico e la capacità delle cellule-associazione di rotavirus al fine di comprendere le differenze fenotipiche tra ceppi/mutanti. La curva di crescita di rotavirus è stata presentata nei precedenti rapporti¹⁰, ma i parametri di crescita come il tasso di crescita specifico non sono di solito misurati. Un'analisi di cella-obbligatoria condotta precedentemente coinvolge la macchiatura immunofluorescente tecnica¹¹. Indichiamo qui metodi più facili di utilizzando il saggio della placca e la RT-qPCR, che ci permettono di discutere quantitativamente la differenza nei fenotipi virale. Questi metodi sono appropriati per la caratterizzazione dei fenotipi di rotavirus e infine possono contribuire alla costruzione di nuovi vaccini efficaci per genotipi multipli.

1. preparazione media

1. Per rendere un terreno di coltura cellulare (contenenti siero medio), è necessario aggiungere 4,7 g di polvere MEM di Eagle a 500 mL di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave a 120 ° C per 20 min e lasciare che le medie raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere siero bovino fetale (concentrazione finale: 10%), L-Glutammina (2 mM), penicillina streptomicina (1%) e bicarbonato di sodio (1,125 g/L). Conservare a 4 ° C per 1 mese.
2. Preparare il medium privo di siero per la propagazione di virus, come descritto nel passaggio 1.1, ma senza il siero bovino fetale. Conservare a 4 ° C per 1 mese.
3. Per il dosaggio di placca, sterilizzare in autoclave 100 mL di medium di MEM di Eagle (non contenente rosso fenolo). Lasciate che il mezzo raffreddare alla temperatura ambiente e quindi aggiungere 2% FBS, 2% penicillina streptomicina, 4 mM L-Glutammina e 2,25 g/L di NaHCO₃. Conservare a 4 ° C.
4. Per il dosaggio di placca, sterilizzare 100 mL di gel di agarosio al 2,5% in autoclave. Preparare il gel lo stesso giorno che il saggio della placca è condotto. Conservare il gel a 47 ° C in un bagno d'acqua.

2. coltura cellulare

1. Rimuovere un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente linee cellulari MA104 dal contenitore di azoto liquido. Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA in un bagno di acqua a 37 ° C per scongelare le cellule. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per 20 mL di terreno contenenti siero in una boccetta di T75. Incubare la beuta in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ per 2 o 3 giorni.
   Nota: La concentrazione finale delle cellule in sospensione è circa 10⁶ cellule/mL.
2. Una volta che il monostrato cellulare raggiunge 80% confluency, eliminare il surnatante e lavare le cellule due volte con 5 mL di 1 x PBS di Dulbecco (tamponato fosfato salino).
3. Aggiungere 4 mL di tripsina-EDTA 0,05% al pallone e incubare a 37 ° C per 5 min staccare le cellule dal pallone. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 190 x g per 5 min.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule pellettate (10⁶ cellule) in 1 mL di siero contenente medio preparato in 1.1. Diluire le cellule sedimento alle 100 volte con il mezzo.
5. Aggiungere 3 mL di sospensione cellulare diluito in ciascun pozzetto di 6 pozzetti (per il dosaggio di placca) o piastre da 24 pozzetti (per il dosaggio di cella-associazione), rispettivamente. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo per 2 o 3 giorni.
   Nota: Una boccetta di T75 è adatta raccogliere i campioni di corso di tempo perché il volume del campione del surnatante (1 mL) può essere ignorato rispetto al volume totale di surnatante (30 mL). Nel frattempo, il titolo infettivo del virus in ogni supernatante viene misurato dall'analisi della placca, che è solitamente condotto utilizzando una piastra a 6 pozzetti. Una piastra a 24 pozzetti è utilizzata per il dosaggio di cella-associazione.

3. tasso di crescita specifiche del Rotavirus

Nota: Rotavirus rhesus (RRV, genotipo: G3P[3]) è utilizzata in questo protocollo perché RRV possono formare placche con cellule MA104 rapidamente e facilmente.

1. Posto una provetta contenente 1 mL di sospensione di virus (10⁷ pfu/mL) in un medium senza siero conservato a-80 ° C in bagnomaria a 37 ° C per lo scongelamento. Aggiungere 1 µ g / µ l tripsina da pancreas suino a 1 mL della sospensione di virus (concentrazione finale di tripsina è 4 µ g/mL) e poi vortice. Incubare la sospensione di virus a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo per 30 min.
   Nota: Tripsina dalle altre fonti può essere utilizzata, ma l'effetto sull'infettività rotavirus deve essere testato in anticipo.
2. Diluire la sospensione di virus attivato con un medium senza siero per regolare la molteplicità di infezione (MOI) a 0,1 pfu/cella.
3. Aggiungere 1 mL di sospensione di virus diluito a linee cellulari MA104 (80% confluenti) in un matraccio da T75 3 giorni dopo la cella placcatura (2.1), incubare a 37 ° C per 1 h e agitare delicatamente il matraccio ogni 15 min.
4. Quindi, aggiungere 30 mL di un mezzo privo di siero contenente 0.13 µ g/mL di tripsina da un pancreas suino al pallone. Incubare la beuta a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo.
5. Raccogliere 1 mL del surnatante in un matraccio a 0, 6, 12, 18, 24 e 36 (e/o 48) h post-infettiva (hpi) e sostituire il surnatante nelle provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta.
6. Condurre il congelamento (-80 ° C) e si fondono in un bagno di acqua a 37 ° C ciclo tre volte. Poi Centrifugare le provette a 12.600 x g per 10 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante.
7. Filtrare il surnatante con un filtro da 0,2 µm distillata per rimuovere la frazione di cella. Conservare il surnatante-80 ° C in frigorifero fino a quando l'applicazione per l'analisi della placca per la misurazione il titolo del virus.
8. Disporre le provette contenenti il surnatante raccolto (passo 3.5) in un bagno di acqua a 37 ° C. Aggiungere 4 tripsina µ g/mL a un 1 mL del campione diluito 10 volte e incubare a 37 ° C per 30 min.
9. Durante l'incubazione di 30 min a 3.8, per iniziare l'analisi della placca per la misurazione il titolo del virus ottenuto da campioni di tempo corso (passo 3.5), lavare le cellule MA104 due volte in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di PBS 1x 1 dopo aver tolto il mezzo contenente siero.
10. In serie di diluire i campioni incubati con un medium senza siero e inoculare 1 mL del campione diluito in ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 90 min a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo e scuotere delicatamente la piastra ogni 15 min.
11. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo dal piatto 6 pozzetti. Aggiungere 4 tripsina µ g/mL per il mezzo preparato al (punto 1.3). Delicatamente ma immediatamente aggiungere 3 mL di terreno miscelato con gel di agarosio (il rapporto è 1:1) in ciascun pozzetto.
12. Tenere la piastra a temperatura ambiente per più di 10 min (fino a quando il gel dell'agarosi diventa solido) e incubare per 2 giorni a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo.
    Nota: Versare il medio miscelato con agar dal bordo del pozzo.
13. Aggiungere 1 mL della soluzione rosso neutro 0.015% diluita con 1x PBS in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo. Rimuovere il colorante dopo 3 h e incubare per 1 giorno a 37 ° C e 5% CO₂ sotto il vapore saturo.
14. Il giorno successivo, contare il numero delle placche in ciascun pozzetto e calcolare la pfu/mL. Controllare attentamente la confluenza di cella prima del dosaggio di placca per assicurare i numeri di targa.

4. cell-associazione Assay

Nota: Questo protocollo è basato su relazione^{13 di Gilling}.

1. Aggiungere 1 µ g / µ l tripsina da un pancreas suino a 1 mL della sospensione di virus (concentrazione finale di tripsina è 4 µ g/mL) e poi vortice (nello stesso modo come in 2.1). Diluire la sospensione di virus con un medium senza siero per regolare il MOI di 1 pfu/cella.
2. Quindi, lavare le cellule MA104 due volte su piastra a 24 pozzetti con 1 ml di soluzione fisiologica tamponata (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, KCl, 0,3 g/L 0,046 g/l, Na₂HPO₄ raggiungere 1 L con acqua distillata).
3. Inoculare 100 µ l di sospensione di virus diluito in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con cellule e incubare a 4 ° C per 90 min, con agitazione delicata ogni 15 min.
4. Rimuovere l'inoculo di virus e lavare le cellule due volte con 1 mL di TBS. Per estrarre la doppia elica (ds) RNA il rotavirus, aggiungere 140 µ l di PBS: 1x e 560 µ l di tampone di estrazione RNA (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto. Mescolare adeguatamente con una pipetta (circa 10 volte o fino a quando la foschia o contaminante di cellule nel buffer non è visibile).
5. Dopo aver recuperato il doppio incagliato RNA (dsRNA) secondo il protocollo del produttore, posizionare le provette da 1,5 mL contenente l'Estratto di dsRNA su un blocco di calore a 95 ° C per 5 min denaturare il dsRNA, quindi immediatamente mettere i tubi sul ghiaccio e incubare per più di 2 min.
6. Sintetizzare il cDNA utilizzando una trascrizione inversa kit (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 4 µ l di soluzione di RNA virale denaturato in una provetta PCR contenente 16 µ l di miscela (tabella 1) e mescolare accuratamente con una pipetta per non generare bolle. Rotazione verso il basso i tubi.
7. Eseguire la trascrizione d'inversione con un termociclatore a condizione riportato nella tabella 2. Se il cDNA non viene utilizzato immediatamente, conservare la provetta PCR contenente il cDNA a-20 ° C fino a 1 anno.
8. Utilizzare il primer per PCR quantitativa (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ e una sonda inserendo un quencher (qPCR sonde; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA-3'), destinazione il 963 – regione di 1049 del NSP3 segmento di genoma di rotavirus (ST3 ceppo, GenBank: X81436).
   Nota: Quencher viene inserita la sonda progettata da Zeng et al.¹⁴
9. Diluire il plasmide standard in serie (10¹ 10⁶ copie/ml) con PCR grado acqua alla miscela qPCR (tabella 3) e rendere il mix master (20 µ l/campione) per qPCR seguendo la tabella 4.
10. Aggiungere 20 µ l di master mix nel pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e poi mescolare 5 µ l di campioni di cDNA o 5 µ l di standard plasmide pipettando 10 volte. Avviare la reazione del sistema qPCR secondo le condizioni indicate nella tabella 4.
11. Per calcolare il genoma di rotavirus associato alla superficie delle cellule MA104, regressione lineare tra i valori Ct e il numero di genoma noto di un plasmide standard di condotta e stimare numero di genoma del campione. Quindi calcolare il rapporto di associazione numeri virione alle cellule (G_t) a quelli di inoculo iniziale (G₀).

Una panoramica dei due protocolli per il tasso di crescita specifico e il dosaggio di cella-associazione della placca-purificato ceppi RRV è mostrata in Figura 1A e 2A, rispettivamente.

Nel test per il tasso di crescita specifico, il titolo del virus finale raggiunge più di 107 pfu/mL durante la propagazione su pallone T75. Se la concentrazione massima è inferiore a 107 pfu/mL, la cella MA104 non può diventare confluente o RRV non è stato attivato anche da tripsina. Alcuni modelli di crescita sono disponibili per stimare il tasso di crescita specifico utilizzando i dati di unità infettive. In questo protocollo, il modificato Gompertz modello12 è impiegato come un esempio;

dove N0 (104 pfu/mL in questo studio) e Nt (104 -108 pfu/mL) sono il titolo infettive del virus (pfu/mL) a 0 e t (esempio: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, rispettivamente, A è il valore asintotico [log (N∞/N0 )] (esempio: 3-4), µ è il tasso di crescita specifico [1/h], e è la costante di Napier e λ è il periodo di ritardo [h]. Parametri del modello sono ottenuti tramite la funzione solver del software di analisi, che minimizza la somma dei quadrati della differenza tra i valori osservati e modellati. Nell'esempio in Figura 1B, il tasso di crescita specifico (µ) è stimato a 0.197 [1/h] e il periodo di ritardo (λ) è 6,61 [h] applicando il metodo di minimi quadrato per un modello di Gompertz modificato e il titolo del relativo virus presso la fase stazionaria al titolo iniziale ( scala logaritmica) (A) è 3.15 [log (N∞/n0)]. Abbiamo testato 6 cloni di rotavirus in totale, e i valori stimati del tasso di crescita specifico ha variato da 0,19 a 0,27 [1/h]. Questi stimati valori sono affidabili perché il coefficiente di valori di determinazione nel raccordo modello è più di 0.98.

Virioni RRV associazione a superfici delle cellule erano circa 103 copie/mL (associazione efficienza era di circa 1%) quando si utilizza una piastra a 24 pozzetti per l'analisi delle cellule-obbligatoria (Figura 2B). Il test è condotto solitamente tre volte per ogni campione, e se una grande varianza del numero di copia è osservata in un campione, potrebbero verificarsi alcuni problemi quali l'attivazione sovra-lavaggio e insufficiente di RRV di tripsina. Il valore Ct di qPCR superiore a circa 36.0 non è preferibile ed è considerato per essere inferiore a un limite di rilevazione nella nostra condizione di qPCR.

Tabella 1: Master mix di composizione per la sintesi del cDNA del genoma di rotavirus.

Tabella 2: Condizione di reazione per la sintesi del cDNA del genoma di rotavirus.

Tabella 3: Master mix composizione per PCR quantitativa del rotavirus un genoma.

Tabella 4: Condizioni di reazione per PCR quantitativa del rotavirus un genoma.

Figura 1: Panoramica schematica della stima di crescita di rotavirus e la curva di crescita di rotavirus. (A) l'unità infettiva del rotavirus è misurata con il saggio della placca. (B) la curva (linea blu) è stata approssimata dal modello di Gompertz modificato sulla base dei dati osservati nel nostro laboratorio (cerchio bianco). Il tasso di crescita specifico [µ]; 0.197 [h-1], periodo di ritardo (λ); 6,61 [h], il titolo del relativo virus presso la fase stazionaria al titolo iniziale (scala logaritmica) (A); 3.15 [log (N∞/n0)]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: schema generale e risultato rappresentativo del dosaggio cellula-associazione di cinque ceppi RRV purificato dalle placche nel nostro laboratorio. (A) A piastra di coltura delle cellule inoculato con rotavirus viene incubato a 4 ° C per inibire l'invasione di virus nelle cellule. Dopo l'incubazione e la rimozione di particelle virali non associate alle cellule, quantificare il numero di genomi provenienti da particelle virali associate alla superficie delle cellule con RT-qPCR. (B) il risultato del cellula-binding assay è stato visualizzato come efficienza (%), che era il rapporto di particelle virali associati a quelli presenti nell'inoculo di associazione. Bar grassetto: mediano, fine delle caselle: deviazione quartile, fine linea: massimo e minimo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.