Articolo metodologico

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

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DOI:

10.3791/58824

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16 gennaio 2019

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo la procedura dettagliata di una piattaforma di analisi sviluppata di recente proteasi che utilizza N-terminale hexahistidine/maltosio-proteina e substrati ricombinante fusi con proteine fluorescenti attaccati alla superficie di nichel-nitrilotriacetico acido dell'agarosi magnetico perline. Una successiva analisi in gel dei campioni test separati da elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide di sodio inoltre è presentata.

Abstract

Proteasi sono enzimi intensivamente studiati a causa loro ruoli essenziali in diverse vie biologiche degli organismi viventi e nella patogenesi; Pertanto, essi sono importanti bersagli. Abbiamo sviluppato una piattaforma di analisi magnetica-agarosio-perlina-basata per l'indagine di attività proteolitica, che si basa sull'uso di substrati della proteina di fusione ricombinante. Al fine di dimostrare l'uso di questo sistema di dosaggio, un protocollo è presentato sull'esempio del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) della proteasi. La piattaforma di analisi introdotto può essere utilizzata in modo efficiente nella caratterizzazione biochimica delle proteasi, tra cui misure di attività degli enzimi in mutagenesi, cinetica, inibizione o studi di specificità, e può essere adatto ad alta velocità screening di substrato o può essere adattato ad altri enzimi proteolitici.

In questo sistema di dosaggio, i substrati applicati contengono maltosio-binding protein (MBP) Tag e hexahistidine N-terminale (sua6), siti di taglio per il tabacco etch virus (TEV) e proteasi HIV-1 e una proteina fluorescente C-terminale. I substrati possono essere prodotti in modo efficiente in cellule di Escherichia coli e purificata facilmente usando i branelli rivestiti - chelato - nichel (Ni). Durante il dosaggio, il clivaggio proteolitico del branello-attached substrati conduce al rilascio di frammenti di clivaggio fluorescente, che può essere misurato da fluorimetria. Inoltre, le reazioni di scissione possono essere analizzate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Un protocollo per la rinaturazione in gel di componenti di analisi inoltre è descritta, come parziale rinaturazione delle proteine fluorescenti permette loro rilevazione basata sul peso molecolare e fluorescenza.

Introduzione

Enzimi proteolitici appartengono ai gruppi più intensivamente studiato enzima dovuto la loro importanza nelle vie metaboliche e nelle applicazioni industriali, come pure. Loro ruolo chiave nelle malattie virali, nella regolazione della coagulazione del sangue, cancro e cardiovascolari e malattie neurodegenerative fa proteasi importanti obiettivi nel campo del drug discovery. Di conseguenza, la caratterizzazione dettagliata di specificità di substrato e profilatura di inibitore della proteasi (PR) di interesse è fondamentale e viene preferibilmente eseguite da saggi biochimici rapida, efficiente e robusto1,2, 3.

Al giorno d'oggi, la stragrande maggioranza delle analisi in vitro della proteasi applicata nel campo della scoperta di nuovi farmaci per la profilatura composto sono omogenei, fluorescente peptidici e high throughput screening (HTS)-piattaforme compatibili4. Inoltre, con etichettate peptidi sono adatte per lo screening di libreria non solo, ma offrono anche ottimi strumenti per la determinazione dell'enzima parametri cinetici sui substrati selezionati. In altri casi, qualora non sia possibile etichettatura del substrato, saggi basati su separazione possono fornire una possibile soluzione per valutare le proprietà cinetiche di reazioni proteolitici3.

In generale, le analisi in vitro della proteasi sono basate sull'uso di due tipi di substrato: brevi peptidi o proteine intere. In questi casi, dove il clivaggio di sequenze peptidiche breve riflettono le proprietà di clivaggio sufficientemente, sono applicabili i seguenti approcci standard: (i) esame di substrati proteina standard come l'insulina ossidato B-catena, (ii) test commercialmente disponibili substrati di altre proteasi, (iii) lo screening di librerie di peptidi sintetici e fluorescente contrassegnati create da chimica combinatoria, o (iv) utilizzando metodi genetici, per esempio, biologico visualizzare tecnologie5, 6. Oltre alla classificazione convenzionale, altre piattaforme romanzo sono disponibili anche per la generazione di substrato (ad es., la formazione del peptide derivato proteoma librerie7 o speciali sottotipi dei metodi genetici, come la fusione ricombinante substrati a base di proteine8,9,10,11,12).

Tutti i tipi di substrato di cui sopra e le analisi hanno i loro vantaggi e limitazioni, e lo sviluppo di formati di dosaggio che unisce e/o migliorare i vantaggi delle piattaforme note è ancora in domanda. Qui descriviamo un protocollo per un dosaggio basato sulla separazione fluorescente proteasi, che utilizza substrati ricombinante. Queste proteine di fusione sono costituiti da suo6 e tag MBP fusa a un sito di clivaggio del controllo di TEV PR, che è seguita dalla sequenza di substrato di interesse che è collegato direttamente ad una proteina fluorescente del C-terminale (FP) (Figura 1A). La clonazione di una sequenza di DNA codifica per un sito di clivaggio di interesse nel cassetto' clonazione' può essere eseguita da una reazione di legatura singola nel plasmide di espressione, che ha stato linearizzato tradotto da endonucleasi di restrizione.

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Figura 1: Principio del metodo fluorescente proteasi. Proteasi (A) rappresentazione schematica di un substrato fluorescente e suo sfaldamento da virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) sono indicato. La freccia indica la posizione di scissione all'interno della sequenza di sito di clivaggio matrice/capside di proteasi HIV-1 (VSQNY * PIVQ). (B), il fluorescente substrati possono essere utilizzati per analizzare reazioni enzimatiche mediante l'analisi di magnetico-perlina-basato di Ni-NTA e tramite l'elettroforesi del gel di poliacrilammide, pure, come è illustrato nel diagramma di flusso di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anche se dosaggi proteolitici utilizzando proteina ricombinante simile substrati contenenti un tag di affinità, un sito di clivaggio proteolitico e una proteina fluorescente-hanno già stati descritti8,9,10, il sistema presentato qui intende integrare e migliorare i vantaggi di questi metodi. Una differenza importante è che i substrati della proteina di fusione in questa piattaforma di analisi sono dotati di MBP per migliorare la solubilità di proteine13 e contenere un sito di clivaggio del controllo per TEV PRs. Inoltre, i substrati contengono proteine fluorescenti di nuova generazione, che sono altamente stabili e hanno una forma monomerica per impedire l'aggregazione di substrato. Oltre l'applicazione precedentemente pubblicato di mApple-fusa e di mTurquoise2 - forme14, qui mostriamo anche risultati dati dall'uso di un substrato ricombinante contenente un monomerico migliorato tag fluorescente proteina fluorescente gialla (mEYFP). Con la presente siamo dimostrare la compatibilità del sistema con altre proteine fluorescenti e rappresentano alcuni tipi generali di risultati che possono essere acquisiti dall'analisi della proteasi.

Le proteine di fusione ricombinante sono espresse nelle cellule di e. coli BL21 (DE3) e vengono utilizzate come substrati per il dosaggio in un acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA)-rivestito forma magnetica-agarosio-perlina-attached. I prodotti di clivaggio del C-terminale sono liberati dalla superficie della perla nel surnatante su scissione dalla proteasi di interesse. Dopo la separazione del surnatante (contenente l'enzima e i prodotti di clivaggio) dai branelli magnetici, la fluorescenza può essere misurata per determinare le proprietà di clivaggio dell'enzima. In contrasto con i metodi descritti in precedenza, nel sistema presentato qui, la quantità di substrato e prodotti di scissione del C-terminale sono univocamente quantificati basato su una procedura di calibrazione del substrato dettagliate. Il sistema di dosaggio possa essere supportato da un'analisi di SDS-PAGE dei campioni test; una successiva visualizzazione in gel fluorescente può essere applicata immediatamente dopo l'elettroforesi o in gel rinaturazione delle componenti fluorescente nondenatured e denaturati, rispettivamente14.

La flessibilità e la struttura della cassetta' clonazione' consentire un inserimento tempo e costo-efficiente di un'ampia varietà di sequenze nel costrutto e, pertanto, promuove la generazione di librerie di substrato. Poiché tutti i passaggi di dosaggio sono e HTS-compatibili con l'automazione, il sistema può essere particolarmente attraente per, ad esempio, misure di specificità di proteasi e gli studi di mutagenesi, oppure può anche essere efficacemente utilizzato per lo screening dell'inibitore di proteasi industriale e/o lo sviluppo di farmaci antivirali, pure.

Parametri cinetici degli enzimi (kgatto, Km) possono essere determinati mediante l'analisi di base di separazione sviluppato; di conseguenza, può essere adatto eseguire misure cinetiche degli enzimi individuali, come gli studi di inibizione, substrato-dipendente e tempo-corso. Questo dimostra che i substrati della proteina di fusione ricombinante forniscono buone alternative per i substrati utilizzati frequentemente oligopeptide sintetico, e a causa della loro alta somiglianza ai substrati poliproteina, essi rappresentano i naturali interazioni enzima-substrato più accuratamente.

Protocollo

1. generazione dei plasmidi di espressione substrato-codifica

  1. Linearizzare il plasmide di espressione del pDest-His6- MBP-FP di PacI e NheI endonucleasi di restrizione. Per la generazione di pDest-His6- MBP-FP, vedere Bozóki et al.14.
    1. Aggiungere 1.500-2.000 µ g di plasmide di espressione del pDest-His6- MBP-FP, 2 µ l di PacI e NheI endonucleasi, 10 µ l di tampone 10x 10 (Vedi Tabella materiali) e acqua priva di nucleasi (NFW) a 100 µ l in un tubo del microcentrifuge.
    2. Incubare a 37 ° C per 1 h, la miscela di reazione.
  2. Aggiungere 20 µ l di 6 x viola di DNA caricamento colorante per la miscela di reazione e separare i prodotti di clivaggio l'elettroforesi, il gel di agarosio 1%. Applicare una scala di 1 kB DNA come standard.
  3. Risciacquare il gel per 15 min in 20 mL di TAE buffer (40 mM Tris, acido acetico di 20 mM, 1 mM EDTA, pH 8.5) contenenti 20 µ l di soluzione SYBR green e asportare la band del plasmide linearizzato fuori il gel di agarosio, utilizzando uno strumento affilato.
    Nota: Mentre illuminando il gel da un transilluminatore blu scuro-lettura (DRBT), il plasmide - MBP-FP linearizzata del pDest-His6appare come una band discreta e luminosa a circa 7-8 kB.
  4. Purificare il plasmide linearizzato espressione dalla sezione gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
  5. Inserire la sequenza di substrato il plasmide di espressione linearizzata del pDest-His6- MBP-FP.
    1. Temprare l'attaccante (ATT) e gli iniettori d'inversione di codone-ottimizzato del oligonucleotide (REV) e. coli che codifica per la sequenza di substrato di interesse.
      Nota: Gli iniettori Ricotti saranno affiancati dalle estremità coesiva corrispondente a PacI e NheI siti di fenditura di endonucleasi di restrizione (Figura 2).
      1. Mix 150 ng di plasmide linearizzato espressione con 200 ng di FWD e 200 ng di REV oligonucleotide primers in una reazione a catena della polimerasi (PCR) 0,2 mL tubo e regolare il volume a 17 µ l con l'aggiunta di NFW.
      2. Incubare la miscela a 65 ° C per 2 min e, quindi, a 4 ° C per almeno 2 min.
    2. Eseguire l'inserimento dei primer ricotto nel plasmide linearizzato tramite la legatura.
      1. Aggiungere 2 µ l di tampone di T4 ligasi (10x) e 1 µ l di ligasi T4 alla miscela contenente il plasmide linearizzato e i primer Ricotti.
      2. Incubare la miscela di legatura a 16 ° C per 16 h.

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Figura 2 : Sequenza del sito iniettori del oligonucleotide che codifica per un taglio proteolitico. Forward e reverse primer codificare il VSQNY * sequenza di sito di clivaggio PIVQ di HIV-1 PR. Dopo la ricottura degli iniettori del oligonucleotide complementare, il DNA double-stranded breve contiene estremità appiccicosa, corrispondente a quello del PacI e NheI endonucleasi di restrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Trasformare 100 µ l di cellule competenti BL21 (DE3) 5 µ l di miscela di legatura e diffondere le cellule su piastre di agar di brodo (LB) di Lisogenesi contenente ampicillina.
    Nota: Le proteine fluorescenti sarà nello stesso frame di lettura aperta con i tag di fusione del N-terminale solo dopo una legatura di successo. Pochi giorni dopo la trasformazione, le colonie (contenenti il plasmide di espressione che codifica per il sito di clivaggio inserito di interesse) mostrerà fluorescenza visibile con o anche senza l'utilizzo di un DRBT.
  2. Preparare il brodo di glicerolo dalle colonie raffigurate.
    1. Lavare una colonia discreta in una provetta da centrifuga 50 mL contenente 5 µ l di terreno LB contenente ampicillina (ad una concentrazione finale di 100 µ g/mL).
    2. Incubare a 37 ° C per 8 h agitando continuamente a 220 giri/min; quindi, è possibile raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Delicatamente sospendere le cellule in 1 mL di soluzione di glicerolo di 80% (diluito con acqua distillata) e aggiungere 500 µ l di 10 mM MgCl2 soluzione alla sospensione.
    4. Trasferire la sospensione in una provetta di congelamento e memorizzare le scorte a-70 ° C.
  3. Verificare la sequenza del plasmide generato dal sequenziamento del DNA.
    1. Aggiungere 10 µ l dello stock di glicerolo (preparato al punto 1.7) a 5 mL di LB medium contenente 100 ampicillina µ g/mL in una provetta da centrifuga 50 mL.
    2. Incubare la sospensione a 37 ° C per 16 h agitando continuamente a 220 giri/min; quindi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 x g per 10 min a 4 ° C.
    3. Isolare il plasmide di espressione dal pellet di miniprep un plasmide kit (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore e utilizzare il plasmide purificato per la sequenza del DNA.
      Nota: per il sequenziamento, 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (avanti) e 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' iniettori del oligonucleotide (inversa) possono essere utilizzati.

2. espressione dei substrati fluorescenti

  1. Preparare la coltura starter.
    1. Aggiungere 10 µ l dello stock di glicerolo (preparato al punto 1.7) a 5 mL di LB medium contenente 100 ampicillina µ g/mL in una provetta da centrifuga 50 mL.
    2. Incubare la sospensione a 37 ° C per 15 h agitando continuamente a 220 giri/min.
  2. Trasferire la coltura batterica (5 mL) in 50 mL di terreno LB nuovo contenente 100 ampicillina µ g/mL in un matraccio di Erlenmeyer sterile 500 mL.
  3. Crescere le cellule a 37 ° C per un'assorbanza di 0.6-0.8 a un 600 nm, agitando continuamente a 220 giri/min.
    Nota: Se un trattamento di tetraciclina deve essere applicato al punto 2.5, non è consigliabile a crescere le cellule ad un'assorbanza di più di 0,6 a 600 nm.
  4. Aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) alla concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione della proteina.
  5. Se non viene applicato un trattamento di tetraciclina, incubare la cultura per 3 h a 37 ° C agitando continuamente a 220 giri/min e continuare il protocollo con passo 2.6. Se viene applicato un trattamento di tetraciclina, continuare il protocollo con passaggi 2.5.1-2.5.3.
    Nota: Alcuni FPs prodotta dalle cellule di e. coli può avere un tempo di maturazione più lungo (vedere il lavoro precedente)16,17; in questi casi, la traduzione della proteina può essere facoltativamente arrestata dal trattamento tetraciclina, per aumentare il rendimento fluorescente del TMB.
    1. Incubare la sospensione cellulare per 2 h a 37 ° C agitando continuamente a 220 giri/min; quindi, aggiungere una soluzione di tetraciclina (a una concentrazione finale di 200 µ g/mL).
    2. Incubare la coltura delle cellule in base al tempo di maturazione della proteina fluorescente di scelta a 37 ° C, agitando continuamente a 220 giri/min.
  6. Trasferire 2 x 25 mL della coltura per pulire provette centrifuga da 50 mL e raccolto le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  7. Scartare il surnatante e memorizzare il pellet di cellule batteriche a-70 ° C per almeno 1 h.
    Nota: Le celle contenenti i substrati fluorescenti espressi mostrano fluorescenza visibile con o anche senza l'utilizzo di un DRBT.

3. distruzione cellulare

  1. Mettere il pellet cellulare congelato sul ghiaccio e lasciarla scongelare per 15 min.
  2. Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazolo 10mm, 0,05% di Tween 20, pH 8) per il pellet e sospendere le cellule.
  3. Aggiungere 10 µ l di soluzione di inibitore della proteasi preparata fenilmetanosolfonil-fluoruro (PMSF) (8,7 mg/mL, disciolto in etanolo) alla sospensione.
  4. Aggiungere 2 mg di lisozima e 20 unità di dnasi alla sospensione e sospenderlo.
  5. Incubare la sospensione in ghiaccio per 15 min e vortice che occasionalmente.
  6. Trasferire 2 x 1 mL di sospensione per provette per microcentrifuga da 1,5 mL e Sonicare le sospensioni per 3 min, in turni di 10 s di sonicazione e 5 s di riposo.
  7. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 20 min a temperatura ambiente; quindi, rimuovere il surnatante fluorescente (lisato di cella batterica cancellata) attentamente da ciascuna provetta e trasferirlo al nuovo microcentrifuga.
    Nota: Sgomberati lisati contenente il substrato fluorescente mostrano fluorescenza visibile con o anche senza l'utilizzo di un DRBT e possono essere conservati a 4 ° C fino a 2 settimane. NON congelare. Sgomberati lisati possono essere utilizzati direttamente per la preparazione del campione nell'analisi della proteasi (vedere paragrafo 4.1) o anche può essere usato per la purificazione di substrato (Vedi punto 4.5.1).

4. analisi di proteasi magnetico-perlina-base Ni-NTA

Nota: A causa della flessibilità della piattaforma dosaggio, può essere ottimizzato per diversi tipi di studi. Per questo motivo e a causa della differenza del tasso di attività degli enzimi della scelta, alcuni dei parametri di analisi (dove viene indicata) non può essere descritto in modo esplicito, ma devono essere ottimizzate per gli obiettivi individuali e disegno sperimentale. Come una guida, parametri di alcuni tipi di studi sono indicati in particolare di Spagna.

  1. Preparazione del campione
    1. Generazione di substrato-attached biglie magnetiche
      1. Posizionare un chiuso 2 mL basso-proteina-legante (Vedi Tabella materiali) microcentrifuga tubo contenente nuovo o riciclato perline di agarosio magnetico Ni-NTA (vedere paragrafo 4.7) in un concentratore di particelle magnetiche (MPC).
        Nota: L'importo della sospensione perlina applicata è quello impostato in base al disegno sperimentale. Abbiamo usato 1 mL di soluzione di biglie magnetiche (5%, v/v) in ogni esperimento.
      2. Perline possono attaccare alla parete e/o nel coperchio del tubo del microcentrifuge; di conseguenza, capovolgere il MPC in ogni direzione per assicurarsi che tutte le perle sono raccolte.
      3. Rimuovere il supernatante e scartarlo.
      4. Lavare le perle di tampone di lisi.
        1. Aggiungere 1,8 mL di tampone di lisi per le perline e rimuovere il tubo chiuso dal MPC.
        2. Sospendere le perline nel tubo agitazione e/o girando i tubi a testa in giù fino a quando il campione è completamente omogeneo.
        3. Inserire nuovamente il tubo il MPC e girarlo sottosopra per raccogliere le perle.
        4. Aprire il tubetto e scartare il surnatante.
      5. Aggiungere 1.0-1.8 mL della sgomberati lisato (preparata al punto 3.7) ai talloni e rimuovere il tubo dal MPC.
      6. Capovolgere la provetta chiusa fino a quando le perline sono completamente omogenee e ruotare lentamente il tubo da un rotatore a temperatura ambiente per 30 min.
      7. Inserire il MPC e rimuovere la cella cancellata lisata dalle perle e il coperchio.
        Nota: Cella cancellata lisata può essere eliminata o salvata per un ulteriore uso (vedere la nota dopo il passaggio 3,7).
      8. Aggiungere 1% Tween 20 (pH 7) per i branelli magnetici substrato-collegato (SAMBs).
        Nota: SAMBs mostrano fluorescenza visibile con o anche senza l'utilizzo di un DRBT.
    2. Lavaggio della SAMBs
      1. Inserire il tubo con la sospensione SAMB il MPC e scartare il surnatante.
      2. Lavare il SAMBs 3 x con ogni buffer: i) 1,8 mL di 1% Tween 20 (pH 7); II) 1,8 mL di tampone di lavaggio (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazolo di 5mm, 0,05% Tween 20, pH 7); III) 1,8 mL di buffer di clivaggio (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% di Tween 20, pH 7).
        Nota: Per la procedura di lavaggio, vedere passaggio 4.1.1.4. Il buffer di clivaggio può essere modificato secondo le esigenze sperimentali, ma si raccomanda di consultare il manuale dei branelli magnetici Ni-NTA per determinare la compatibilità.
    3. Preparazione della soluzione stock SAMB
      1. Aggiunge un buffer di clivaggio alla SAMBs lavato per creare una soluzione di riserva SAMB.
        Nota: Dopo l'aggiunta del buffer, non scuotere o capovolgere la provetta. Il volume del buffer fenditura dipende dal disegno sperimentale individuale e deve essere calcolato in basato al numero di biglie magnetiche (Vedi punto 4.1.1.1) e sui volumi da impiegare nel passaggio 4.1.4.2. Per provette da 2 mL, il volume applicato è fino a 1.900 µ l (Vedi tabella 1). La densità consigliata Beads magnetiche della soluzione stock SAMB è 2-10% (v/v).
        Tipo di studioVolume di tampone di clivaggio (µ l)
        Misure S-dipendente (Fig. 4)1600
        Misure di tempo-corso (Fig. 5A)1600
        Studio di inibizione (Fig. 5B)1900
        Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)1400

        Tabella 1: Volume del clivaggio buffer utilizzato per preparare la soluzione di riserva SAMB in diversi tipi di misure.
      2. Rimuovere il tubo chiuso dal MPC. Utilizzare la soluzione di riserva SAMB immediatamente o conservare a 4 ° C per 24 h.
    4. Generazione dei campioni test utilizzando la soluzione di riserva SAMB
      Nota: I dettagli di questa parte del test dipendono fortemente dal disegno sperimentale specifico (esempio tipi sono riportati nella tabella 2).
      Tipo di campioneNote
      Campione di reazione (R)-utilizzato per la valutazione delle proprietà di scissione
      -contiene sia l'enzima ed il substrato nel buffer di scissione
      Campione di substrato in bianco (B)-utilizzato per la valutazione della dissociazione spontanea substrato (Vedi punto 4.6.2)
      -contiene solo il substrato nel buffer di scissione
      Esempio di controllo di substrato (C)-per la concentrazione di substrato determina (Vedi punto 4.6.3)
      -contiene solo il substrato in tampone di eluizione

      Tabella 2: Tipi di campione del dosaggio proteasi magnetico basato su tallone Ni-NTA.
      1. Preparare 2 mL di microcentrifuga di basso-proteina-legante per i campioni di analisi.
        Nota: Altre articoli in plastica di legame alle proteine bassa possono anche essere utilizzata. Utilizzare tubi tondo o piatto fondo per garantire la libera circolazione di SAMBs. Vedere il numero consigliato di tubi nella tabella 3.
        Tipo di studioRBC
        Misure S-dipendente (Fig. 4)552
        Misure di tempo-corso (Fig. 5A)662
        Studio di inibizione (Fig. 5B)771
        Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)551

        Tabella 3: Numero di microcentrifuga richiesto 2 mL per ciascun tipo di campione negli studi ha dimostrati.
      2. Sospendere la soluzione di riserva SAMB fino ad omogeneità e trasferire la quantità di substrato per essere analizzati nelle reazioni immediatamente in fiale del campione. Il volume consigliato è di 25-300 µ l, ma deve essere impostato secondo il disegno sperimentale specifico (tabella 4).
        Nota: Controllare se tutti i SAMBs sono stati misurati nella parte inferiore dei tubi. SAMBs può aderire alla parete del tubo, che può falsare i risultati del saggio. Se diversi volumi devono essere calcolati in modo sequenziale, avviare aliquotare con il più alto volume e provare a ridurre al minimo il cambiamento di pipette e/o puntali.
        Tipo di studioRBC
        Misure S-dipendente (Fig. 4)25 – 50 – 100 – 150 – 25025 – 50 – 100 – 150 – 25025
        Misure di tempo-corso (Fig. 5A)252525
        Studio di inibizione (Fig. 5B)120120120
        Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)100100100

        Tabella 4: Volume della soluzione SAMB misurato nelle fiale del campione di ogni tipo di campione negli studi ha dimostrati.
      3. Disporre le provette campione contenente la sospensione SAMB aliquotata nel MPC e spostare leggermente il MPC avanti e indietro.
      4. Con attenzione rimuovere il surnatante dalla SAMBs e scartarla.
      5. Togliere le provette dal MPC e aggiungere il volume calcolato di tampone di reazione (buffer di clivaggio o eluizione [100 mM EDTA, 0,05% di Tween 20, pH 7]) attentamente il SAMBs.
        Nota: Calcolare il volume di accumulo secondo il disegno sperimentale individuale (tabella 5). Per provette da 2 mL, volume finale della miscela di reazione (il volume di tampone di reazione per essere aggiunto in questo passaggio + il volume della soluzione da aggiungere al punto 4.2.3) consigliato è 50-150 µ l. Assicurarsi che tutte le SAMBs vengono lavate nel buffer aggiunto. Tampone di eluizione è usato anziché buffer di clivaggio nei casi di campioni di controllo (C) di substrato. Per uno studio di inibizione, l'inibitore di scelta è raccomandato da aggiungere a questo punto.
        Tipo di studioVolume di tampone di reazione (µ l)
        Misure S-dipendente (Fig. 4)68 µ l di tampone di scissione
        Misure di tempo-corso (Fig. 5A)68 µ l di tampone di scissione
        Studio di inibizione (Fig. 5B)67,3 µ l di tampone di clivaggio + inibitore di 0,7 µ l stock soluzione *
        Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)µ L 69,5 clivaggio buffer * *

        Tabella 5: Volume di tampone di reazione negli studi dimostrate. * Amprenavir è stato risolto in dimetilsulfossido; soluzioni di riserva di amprenavir (che vanno da 1 nM a concentrazioni di 1 µM) sono state applicate per studio inibitorio (Vedi figura 5B). * * Il pH del tampone clivaggio applicata variato da pH 6.0-8.5.
      6. Chiudere i coperchi dei tubi. Ora i campioni sono pronti per il dosaggio.
        Nota: I campioni possono essere conservati a 4 ° C per 24 h, ma il deposito è applicabile solo se la soluzione di riserva SAMB è stata utilizzata immediatamente dopo la preparazione (Vedi punto 4.1.3.2).
  2. Inizio delle reazioni proteolitiche
    1. Preparare la soluzione di enzima proteolitico secondo le esigenze sperimentali.
      Nota: È consigliabile utilizzare un buffer di fenditura per sciogliere e/o diluire l'enzima. Protocolli per la purificazione di HIV-114 e TEV PRs18 sono stati pubblicati precedentemente.
    2. Impostare l'agitatore velocità di agitazione (600 giri/min) e temperatura di incubazione (tabella 6).
      Tipo di studioTemperatura di incubazione (° C)
      Misure S-dipendente (Fig. 4)37
      Misure di tempo-corso (Fig. 5A)37
      Studio di inibizione (Fig. 5B)37
      Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)30

      Tabella 6: temperature di incubazione applicate a tipi differenti di studio. Per PR di HIV-1, 37 ° C è raccomandato, mentre 30 ° C è consigliato per TEV PR.
    3. Aggiungere la soluzione di enzima per i campioni di reazione per l'inizializzazione di reazioni proteolitiche.
      Nota: Nel caso di substrato in bianco (B) e C campioni, aggiungere scissione buffer (tampone enzimatico) e tampone di eluizione, rispettivamente. Il volume deve essere calcolato secondo le singole esigenze sperimentali (tabella 7). Per provette da 2 mL, volume finale della miscela di reazione (il volume di tampone di reazione aggiunto nel passaggio 4.1.4.5 + il volume della soluzione da aggiungere in questo passaggio) consigliato è 50-150 µ l.
      Tipo di studioVolume l'enzima enzima/soluzione tampone/di tampone di eluizione (µ l)
      Misure S-dipendente (Fig. 4)2
      Misure di tempo-corso (Fig. 5A)2
      Studio di inibizione (Fig. 5B)2
      Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)0,5

      Tabella 7: Volume del buffer buffer/eluizione soluzione/enzima enzima aggiunto durante l'inizializzazione dei campioni dosaggio nel caso gli studi hanno dimostrati.
    4. Mescolare accuratamente le perline muovendo delicatamente i tubi e inserire immediatamente i tubi l'agitatore già tremante.
      Nota: Chiusura manuale del campione (Vedi sezione 4.3) richiede più tempo rispetto l'iniziazione; quindi, un ritardo registrato di almeno 2 min è raccomandato tra iniziazioni delle reazioni.
    5. Incubare i campioni secondo il disegno sperimentale (tabella 8).
      Tipo di studioTempi di incubazione (min)
      Misure S-dipendente (Fig. 4A)7
      Misure S-dipendente (Fig. 4B)120
      Misure di tempo-corso (Fig. 5A)0 – 2,5 – 5 – 10 – 15 – 20
      Studio di inibizione (Fig. 5B)10
      Studio di dipendenza di pH (Fig. 6)60

      Tabella 8: Tempi di incubazione applicati ai campioni test in diverse misurazioni.
  3. Termination delle reazioni proteolitiche
    1. Prelevare il campione fuori lo shaker, 30 s prima alla fine dell'incubazione e prontamente lo spin.
    2. Posizionare il tubo sul MPC, lasciate riposare per 15 s, e spostare leggermente il MPC avanti e indietro.
    3. Aprire il coperchio e trasferire il surnatante con attenzione a una piastra o un nuovo tubo.
      Nota: Non toccare le perline concentrate con la punta della pipetta. Il surnatante raccolto di esempi di C e R con un alto grado di scissione può mostrare fluorescenza visibile con o anche senza l'utilizzo di un DRBT.
  4. Rilevazione fluorescente
    1. Trasferire 2 x 30 µ l di surnatanti campione separato di una micropiastra di metà-zona nera.
    2. Misurare la fluorescenza utilizzando i filtri di eccitazione e di emissione appropriati.
      Nota: Misurare la fluorescenza di base del buffer di clivaggio e del tampone di eluizione, pure. Necessità di combinazioni filtro a scelta basati sulla proteina fluorescente misurata (tabella 9).
      Proteina fluorescenteFiltri di eccitazione (nm)Filtri di emissione (nm)
      mTurqiouse2355/40460/25
      mEYFP544/15590/10
      mApple544/15590/10

      Tabella 9: Filtri di eccitazione e di emissione utilizzati per rilevare diverse proteine fluorescenti.
  5. Calibrazione
    Nota: Per generare le curve di calibrazione nel passaggio 4.6.1, i valori di intensità di fluorescenza di clivaggio - o eluizione-buffer-risolto purificate substrati a differenti concentrazioni devono essere misurate.
    1. Purificare i substrati fluorescenti.
      Nota: Per la purificazione, SAMBs di substrato in bianco (B) campioni dopo il dosaggio di proteasi può essere raccolti o un nuovo SAMB sospensione può anche essere preparato (vedere paragrafi 4.1.1 e 4.1.2).
      1. Posizionare un tubo con SAMBs sospesa in 1 mL di tampone di clivaggio (2% - 10%; v/v) per il MPC e raccogliere le biglie magnetiche ruotando il MPC capovolto, in ogni direzione.
      2. Aprire il tubetto e rimuovere il buffer di fenditura, sia dal tubo e il coperchio.
      3. Rimuovere la provetta dal MPC e aggiungere 400-600 µ l di tampone di eluizione per la SAMBs.
      4. Ruotare lentamente il tubo chiuso con un rotatore a temperatura ambiente per 5 min.
      5. Posizionare il tubo sul MPC e raccogliere le perle ruotando il MPC a testa in giù.
      6. Rimuovere il supernatante contenente il substrato fluorescente intatto purificato (eluato) e trasferirlo in un nuovo basso legame microcentrifuga.
        Nota: Eluato mostra chiaramente visibile fluorescenza con o anche senza l'utilizzo di un DRBT.
    2. Eseguire buffer parallela scambio mediante due dispositivi di ultrafiltrazione di 0,5 mL 10K.
      1. Misurare la metà del volume dell'eluato preparato (200-300 µ l) in ogni dispositivo di ultrafiltrazione.
      2. Dopo ogni fase di centrifugazione, diluire l'eluato concentrato nel primo e i secondo dispositivi di ultrafiltrazione di tampone di eluizione e buffer di clivaggio, rispettivamente.
      3. Dopo il recupero, regolare i campioni concentrati risolti nei buffer diversi allo stesso volume, tra 120-200 µ l.
        Nota: Ora il contenuto proteico del substrato buffer-risolto fenditura è identico al substrato risolto tampone di eluizione; di conseguenza, non è necessario determinare il contenuto di quest ' ultimo al punto 4.5.3, di proteine se il metodo utilizzato per misurare la concentrazione di proteine interferisce con EDTA.
    3. Determinare il contenuto proteico dei substrati sia nel buffer di eluizione o fenditura dissolto misurando l'assorbanza a 280 nm.
      Nota: Altri metodi (ad es., Bradford o bicinconinico acido (BCA) saggi di) possono essere utilizzati anche per misurare la concentrazione di proteine, ma deve essere possibile interferenza con EDTA (presente nel buffer di eluizione) o con la capacità di assorbimento del substrato fluorescente considerato. Il contenuto proteico iniziale della soluzione substrato da applicare al punto 4.5.4 è raccomandato per essere tra 0,4-2,0 mg/mL al fine di generare una calibrazione curva in una gamma appropriata. Vedi tabella 10 per coefficienti di estinzione.
      SubstratoPeso molecolare
      (Da)      		Coefficiente di estinzione
      (Cm-1 M-1, a 280 nm misurati in acqua)
      Suoi6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise272101.796845
      Suoi6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise272042.795355
      Suoi6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP72367.194325
      Suoi6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple72145.9105200

      Tabella 10: pesi molecolari e i coefficienti di estinzione dei substrati di proteine differenti fusione ricombinante fluorescente.
    4. Preparare una diluizione seriale di doppia in almeno otto passaggi sia da eluizione - le soluzioni di clivaggio-buffer-risolto substrato, mediante eluizione o fenditura buffer per la diluizione, rispettivamente.
    5. Trasferire 30 µ l di ciascun punto di diluizione di una micropiastra di metà-zona nera.
    6. Misurare la fluorescenza con un fluorimetro, utilizzando l'impostazione applicata al punto 4.4.2.
      Nota: Misurare la fluorescenza di base di sia la scissione e il buffer di eluizione.
  6. Valutazione del test
    1. Tracciare le curve di taratura.
      1. Calcolare la concentrazione (in mM) delle soluzioni substrato purificato (utilizzato nel passaggio 4.5.4), basata sulla proteina contenuta determinata al punto 4.5.3.
      2. Correggere i valori di intensità di fluorescenza relativa (RFU) dei punti diluizione seriale i valori fondamentali di RFU del tampone di diluizione applicata (il buffer di clivaggio o il tampone di eluizione).
      3. Tracciare i corretti valori RFU contro la concentrazione molare dei substrati purificati clivaggio o eluizione-buffer-risolto ed eseguire una regressione lineare (forza l'intercetta a zero).
        Nota: Un valore elevato di2 R (˃0.97) indica una buona correlazione lineare tra la fluorescenza e la concentrazione della proteina fluorescente. In questo caso, la pendenza della retta di regressione può essere utilizzata per valutare la concentrazione dei componenti del dosaggio nel campo esaminato nei passaggi 4.6.2 e 4.6.3. Distribuzione del punto di errori e dati sperimentale può influenzare l'affidabilità della taratura; così, una valutazione grafica può essere eseguita con l'aiuto di zoom-in grafici (come illustrato nella Figura 3), al fine di verificare se R2 e i valori di pendenza sono influenzati dai dati.
    2. Calcolare la quantità di prodotto di clivaggio fluorescente C-terminale negli esempi di reazione.
      1. Correggere i valori RFU di ogni campione di R con i valori RFU del campione B corrispondente.
      2. Calcolare la concentrazione di prodotto di clivaggio (in mM) nei campioni di reazione dividendo i corretti valori RFU dalla pendenza della calibrazione basati su fenditura-buffer curva (vedi passo 4.6.1.3).
    3. Calcolare la concentrazione di substrato applicato negli esempi di reazione.
      1. Correggere i valori RFU del campione C con il valore RFU la base di tampone di eluizione.
      2. Calcolare la concentrazione del substrato eluito (in mM) nei surnatanti del campione C dividendo loro corretti valori RFU dalla pendenza della curva di calibrazione basati su tampone di eluizione curva (vedi passo 4.6.1.3).
      3. Determinare la concentrazione di substrato (in mM) della soluzione di riserva SAMB utilizzata per la creazione dei campioni di test nel passaggio 4.1.4.2, basato sulla seguente equazione:
        figure-protocol-2
        Qui, cSAMB è la concentrazione molare della soluzione stock SAMB preparata alla sezione 4.1.3; cC è la concentrazione molare del substrato eluito nel campione C calcolato al passaggio 4.6.3.3; Vr è il volume della miscela di reazione creato con l'aggiunta di tampone di reazione nel passaggio 4.1.4.5 e il buffer di enzima al punto 4.2.3.; e VSAMB è il volume della soluzione di riserva SAMB nell'esempio C (passo 4.1.4.2).
      4. Calcolare la concentrazione molare dei substrati in ciascun campione di R sulla base della concentrazione molare della SAMB soluzione madre (in mM) secondo il volume (in µ l) misurata in ogni provetta di reazione in fase 4.1.4.2.
    4. Eseguire l'elaborazione di dati.
      Nota: L'analisi dei dati dipende l'obiettivo dell'esperimento. Il video mostra un esempio per l'elaborazione dei dati di uno studio cinetico di substrato-dipendente su HIV-1 PR utilizzando il suo6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato. I valori di velocità iniziale sono calcolati dal numero di frammenti di clivaggio del C-terminale e vengono confrontati con la concentrazione di substrato applicato. I parametri cinetici sono determinati da un'analisi di regressione non lineare di Michaelis-Menten.
  7. Riciclaggio dei branelli magnetici
    Nota: Dopo aver eseguito un test, i branelli magnetici dell'agarosi possono essere raccolti e riciclati.
    1. Raccogliere i branelli magnetici usati con il MPC e scartare il surnatante.
      1. Lavare le perle con 1,8 mL di buffer seguenti, nell'ordine indicato: tampone di rigenerazione A (0.05% Tween 20, 0,5 M NaOH), buffer di rigenerazione B (0.05% Tween 20), buffer di rigenerazione C (0,05% Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), buffer di rigenerazione B, rigenerazione tampone D ( 0,05% Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), buffer di rigenerazione B e buffer di rigenerazione E (0,5% Tween 20, 30% etanolo, pH 7).
        Nota: Per la procedura di lavaggio, vedere passaggio 4.1.1.4.
    2. Memorizzare le perline riciclate nel buffer di rigenerazione E a 4 ° C.

5. analisi di pagina

  1. Preparazione del campione
    Nota: Dopo aver eseguito l'analisi di magnetico-perlina-basata di Ni-NTA, i surnatanti di dosaggio possono essere analizzati dalla pagina. In questo caso, ignorare i passaggi 5.1.1 e 5.1.2. Tuttavia, è anche possibile analizzare la soluzione purificata fluorescente substrati e/o loro frammenti di clivaggio dopo digestione nella soluzione con la proteasi di interesse. In questo caso, continuare il protocollo con punto 5.1.1.
    1. Preparare la soluzione di substrato fluorescente purificata secondo punto 4.5.1.
    2. Eseguire la digestione in soluzione.
      1. Scambio di tampone di eluizione con buffer di fenditura nel dispositivo di ultrafiltrazione 0,5 mL 10K e aliquota i campioni per essere digerito in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
        Nota: per l'analisi della pagina, abbiamo aliquotati 68 µ l di ogni substrato, ma il numero di provette dei campioni e il volume di soluzione di substrato per essere aliquotati può essere ottimizzato secondo il disegno sperimentale individuale.
      2. Aggiungere la soluzione di enzima ai campioni.
        Nota: Per l'analisi della pagina, abbiamo applicato 2 µ l di HIV-1 PR, preparato come descritto da Bozóki et al.14, ma il volume potrebbe essere ottimizzato secondo il disegno sperimentale individuale. È consigliabile utilizzare buffer di fenditura per sciogliere e/o diluire l'enzima.
      3. Incubare i campioni secondo il disegno sperimentale.
        Nota: Per l'analisi della pagina, abbiamo incubato la miscela di reazione per 45 min a 37 ° C, ma il tempo di incubazione e la temperatura devono essere impostati secondo il disegno sperimentale.
      4. Terminare la reazione eseguendo punto 5.1.3.
    3. Preparare il campione per pagina.
      Nota: I campioni contenenti fluorescenti-substrato possono essere preparati per la pagina da un nondenaturing o da un metodo di denaturazione. Per l'uso delle condizioni nondenaturing o denaturazione, seguire passo 5.1.3.1 o 5.1.3.2, rispettivamente.
      1. Preparare un campione nondenatured: mescolare 30 µ l del campione con 6 µ l di buffer di caricamento del campione nondenaturing (300 mM Tris, glicerolo 20%, 0,05% di bromofenolo, pH 6.8) 6x.
      2. Preparare un campione denaturato: mescolare 30 µ l del campione con 6 µ l di buffer di caricamento del campione denaturante (300 mM Tris, glicerolo 20%, 0,05% bromofenolo, 12% SDS, 100mm β-mercaptoetanolo, pH 6.8) 6x e riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 min.
  2. Analisi di SDS-PAGE
    Nota: Facoltativamente, se solo i campioni nondenatured (preparato in passaggio 5.1.3.1) devono essere analizzati, una pagina nativa può anche essere eseguita. In questo caso, ignorare la sezione 5.3.
    1. Preparare un gel di SDS-poliacrilammide (uso 14% che separa e 4% gel d'impilamento) e riempire il serbatoio con il tampone di elettroforesi (2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS).
    2. Aggiungere i campioni (preparati al punto 5.1.3.1 o 5.1.3.2) ai pozzetti di un gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi a tensione di 120 V.
    3. Rimuovere il vassoio del gel dal modulo in esecuzione e inserire il gel in una vasca di lavaggio.
      Nota: Esempi di Nondenatured sono già visibili nel gel, anche ad occhio nudo o con un DRBT.
  3. Rinaturalizzazione in gel e la rilevazione di proteine fluorescenti
    Nota: Per rilevare le proteine fluorescenti in campioni denaturati (preparati al punto 5.1.3.2) sul DRBT, SDS deve essere lavato fuori dal gel, a parzialmente rinaturazione delle proteine.
    1. Aggiungi ~ 100 mL di acqua distillata per il gel e risciacquare il gel almeno per 30 min.
      Nota: Per migliorare la rimozione di SDS, sostituire l'acqua ogni 10 min, o risciacquare fino a 60 min.
    2. Visualizzare le proteine fluorescenti utilizzando un DRBT, o da formazione immagine UV.
  4. Convenzionale Coomassie macchiatura del gel
    1. Macchia il gel con colorante Coomassie Brilliant Blue di visualizzare proteine.

Risultati

Figura 1A Mostra la struttura schematica di un substrato di proteina ricombinante fluorescente rappresentativo che può essere elaborato da HIV-1 PR alle sua sequenza di sito di clivaggio specifici. Figura 1B rappresenta la produzione di substrato e loro possibili applicazioni nelle analisi di proteasi, tra cui analisi magnetica-perlina-basata di Ni-NTA e/o di pagina.

Per ottenere dati affidabili di fluorimetria, una procedura di calibrazione è necessaria, al fine di determinare i quantitativi di prodotti di clivaggio e substrati fluorescenti. Per questo, i valori di intensità di fluorescenza dei diversi substrati nelle condizioni di buffer diversi devono essere misurate e devono essere correlati alle loro concentrazioni nella gamma di concentrazione analizzati (Figura 3). I valori di pendenza delle curve di taratura possono essere applicati per determinare la quantità di substrati e prodotti di clivaggio nei campioni del test. Le piste delle curve di taratura sono indipendenti le sequenze del sito di clivaggio inserite i substrati (tabella 11) e potenzialmente possono essere utilizzate per una serie di substrati fusa per lo stesso tipo di proteina fluorescente. Zoom-in grafici vengono visualizzati tutte le regressioni lineari per ingrandire le gamme di concentrazione inferiore pure (Figura 3). È importante notare che la taratura deve essere eseguita con attenzione perché una corretta distribuzione dei punti dati è necessaria per una calibrazione affidabile. Per questo motivo, diluizione seriale doppia viene applicato per preparare i campioni per la taratura, poiché il valore di R2 indica una buona correlazione tra la concentrazione di proteina fluorescente e fluorescenza solo se un numero sufficiente di punti dati sono stati utilizzati per coprire la gamma intera concentrazione. Inoltre, errori sperimentali altamente possono influenzare la precisione della calibrazione; quindi, una valutazione grafica delle linee di regressione può essere anche necessaria.

Una varietà di misure enzimatiche può essere eseguita dall'analisi della proteasi, tra cui un esame dell'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione (Figura 4A). I dati di regressione non lineare, consente di determinare parametri cinetici degli enzimi (ad esempio, vmax e Km). Una sospensione di perlina insufficiente e dispersione e una terminazione di reazione impropria può causare risultati non ottimali (Figura 4B), che non sono adatti per il calcolo di valori cinetica degli enzimi affidabile.

Una dipendenza della formazione di prodotto il tempo può essere determinata dall'analisi (Figura 5A) (ad es., durante l'ottimizzazione dei parametri di reazione di scissione). L'attività dell'enzima in presenza di un inibitore può anche essere studiato (figura 5B) per la determinazione della concentrazione di enzima attivo e costante inibitorio. Utilizzando la stessa metodologia, gli effetti di altri inibitori possono anche proiettati dall'analisi.

Il dosaggio di proteasi è utile quando gli effetti del pH sull'attività enzimatica, pure. Figura 6A rappresenta la dipendenza di attività dell'enzima sul pH dall'esempio del TEV PR, che ha una gamma ampia ottimale di pH (pH 6-9). Se la dipendenza di pH dell'attività dell'enzima è studiata (o enzimi avendo un optimum di pH acido devono essere misurate), è necessario considerare che il legame di affinità di substrati ricombinante ai talloni può essere limitato a pH leggermente acido. Una dissociazione elevati dei substrati dalle perle (Figura 6B) può causare una distorsione dei risultati del test. Al fine di considerare la dissociazione spontanea substrato dalle perle, i valori misurati per campioni di reazione devono essere corretti da quelli di campioni di B.

La figura 7 Mostra che le proteine fluorescenti nondenatured possono essere differenziate in base ai loro colori, gel utilizzando la transilluminazione luce blu (figura 7A). Se la determinazione dei pesi di frammenti di substrati/scissione molecolare è necessaria, denaturazione condizioni utilizzabile anche per la preparazione del campione, poiché le proteine fluorescenti possono essere parzialmente rinaturalizzato nel gel e possono essere rilevate da illuminazione UV (Figura 7B) o di Coomassie macchiatura (Figura 7). Se i campioni di R sono analizzati, solo i prodotti di clivaggio del C-terminale sono visibili (Figura 7), mentre i frammenti di clivaggio del N-terminale e i substrati ApoAlert rimangono attaccati ai talloni. Occasionalmente, proteine possono essere parzialmente denaturate nonostante l'uso di condizioni nondenaturing (Figura 7), e mentre le proteine nondenatured sono più abbondanti, denaturate forme inoltre sono rilevabili nel campione. Questo fenomeno non influenza la rilevazione di clivaggio proteolitico ma deve essere considerata nel caso di densitometria quantitativa di campioni nondenatured.

Sebbene la descrizione dettagliata è indicata solo per un 2 mL tubo-test, il dosaggio può essere adattato per un sistema basato su piastra (Figura 8), 96-well che è già stato testato con successo nel nostro laboratorio (non mostrato). Il formato adattato piastra 96 pozzetti è pienamente compatibile con il fluorimetrica e analisi elettroforetiche, pure, e i dati ottenuti possono essere valutati anche sulla base dei metodi descritti in questa carta.

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Figura 3 : Curve di calibrazione. Curve di calibrazione di substrato rappresentativi sono dimostrate con l'esempio di due substrati ricombinante fusa a diversi tag fluorescente C-terminale: (A e B) sua6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 (eC D ) Suo6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-in figure sono indicate anche per rappresentare la regressione lineare dei punti dati in 0-0,005 gamma di concentrazione di substrato mM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 4 : Determinazione dei parametri cinetici degli enzimi. Misure cinetiche substrato-dipendente sono state eseguite da HIV-1 PR (a una concentrazione finale attiva di 41,2 nM). I valori di velocità iniziale sono stati tracciati contro la concentrazione di substrato e stata effettuata un'analisi di regressione non lineare di Michaelis-Menten. Le barre di errore rappresentano SD (n = 2). (A), A rappresentanza risultato ottima viene illustrato con l'esempio della sua6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusione proteina substrato. (B), un risultato non ottimale rappresentativo è inoltre indicato per il suo6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrato, dove l'ambiente delle concentrazioni di substrato adeguato era problematico a causa di un'insufficiente omogeneizzazione della soluzione stock SAMB , mentre relativamente elevati errori sono stati causati dal termine improprio reazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 : Corso di tempo e inibitorio Studio. (A) Suo 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP substrato di proteina di fusione ricombinante (a una concentrazione finale di 0,00326 mM) è stato fenduto di HIV-1 PR (a una concentrazione finale attiva di 41,2 nM), ed è stato misurato con il rilascio di frammenti proteolitici di fluorescente PIVQ-mEYFP eseguire un'analisi di tempo-corso. Le misurazioni sono state effettuate in cinque diversi momenti. Le barre di errore rappresentano SD (n = 2). (B) il suo6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP è stato utilizzato come substrato (a 0,0015 mM) per determinare l'effetto inibitorio di amprenavir sull'attività di PR di HIV-1 (ad una concentrazione totale di 163,8 nM). Tracciando i dati, la mezza concentrazione inibitoria massima (IC50) potrebbero essere valutati e la concentrazione di enzima attivo (concentrazione finale attiva di 41,2 nM) del fotoricettore di HIV-1 applicata anche potrebbe essere calcolato basato sulla curva di inibizione. Le barre di errore rappresentano SD (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6 : Studiare la dipendenza di attività enzimatica e dissociazione spontanea substrato su pH. (A) il suo6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato (in 0,033 mM) fu utilizzato per misurare l'attività enzimatica di TEV PR (ad una concentrazione finale totale di 91.42 nM) nel buffer di clivaggio impostare ad un pH differente, tra la gamma di 6.5-8.5. Le barre di errore rappresentano SD (n = 2). I dati tracciati sono stato precedentemente pubblicato14. (B) basato sui valori dei campioni vuoto di substrato, la dissociazione spontanea della sua relativa intensità fluorescente6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrato (0,033 mM) dai branelli magnetici è stata studiata tramite buffer di scissione con un pH diverso, tra 6.0-8.5. I dati tracciati sono stato precedentemente pubblicato14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7 : Rilevamento proteine nel gel di diversi metodi. (A) ApoAlert e substrati di proteine di fusione HIV-1 PR-digerito dopo la preparazione del campione nondenaturing sono stati visualizzati dal transillumination luce blu dopo SDS-PAGE. La reazione di scissione è stata effettuata tramite digestione nella soluzione. (B) immediatamente dopo la pagina, solo nondenatured proteine potrebbe essere rilevato nel gel di illuminazione UV, mentre dopo la rimozione di SDS, le proteine fluorescenti precedentemente denaturate è diventato parzialmente rinaturalizzato e rilevabile. I campioni sono stati preparati da surnatanti del dosaggio magnetico basato su tallone Ni-NTA. (C) Coomassie macchiatura può essere utilizzata anche per la rilevazione di proteine, dopo rinaturazione in gel. SDS-presente nel gel-maggio causare la parziale denaturazione della proteina nativa, ma negli esempi nativi, le forme nondenatured sono più abbondanti. I campioni sono stati preparati da surnatanti del dosaggio magnetico basato su tallone Ni-NTA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

figure-results-6
Figura 8 : 96 pozzetti basati su piastra di adattamento della piattaforma test. (A), il dosaggio può essere eseguita non solo in provette da 2 mL, ma nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, pure. Qui vi mostriamo la rappresentazione schematica per l'applicazione del test studiare la specificità di una proteasi fittizia utilizzando una serie di substrati fluorescenti, che possono contenere wild-type (wt) o mutata (mut-1 a mut-4) sequenze del sito di clivaggio. Per gestire i branelli magnetici, un concentratore a 96 pozzetti compatibile particelle magnetiche (MPC) deve essere utilizzato negli esperimenti. Tutti i volumi indicati sono correlati a un singolo pozzo. Per confrontare l'efficienza di clivaggio dei diversi substrati, conversione del substrato può essere valutata dalla percentuale dei valori RFU corretta substrato-dei campioni di reazione, considerando i valori RFU corretta substrato-del relativo campioni di controllo di substrato come 100. (B) dopo fluorimetria, i surnatanti separati del dosaggio campioni possono essere analizzati anche dalla pagina e i componenti di proteina fluorescente possono essere analizzati direttamente o dopo rinaturazione in gel in caso di campione nondenaturing e denaturazione preparazione, rispettivamente. I tre tipi di campione di analisi differenti sono anche illustrati in ogni figura: C = controllo di substrato, B = bianco-substrato e R = reazione. Campioni di controllo del substrato sono in tampone di eluizione, mentre il bianco-substrato e gli esempi di reazione sono nel buffer di clivaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

BufferProteina fluorescenteCV % di piste (%)
EluizionemTurquoise26,04
Fenditura9.11
EluizionemApple10,92
Fenditura12,68

Tabella 11: coefficiente di valori di variazione (% CV) delle piste delle curve di taratura substrato. Per verificare se la fluorescenza dei substrati proteina ricombinante è dipenda del sito di clivaggio inserito, tarature sono state effettuate da serie di substrati mApple - e mTurquoise2-fuse (sei varianti per ciascuna, contenente il sito di clivaggio diversi sequenze di proteasi HIV-1), entrambi nei buffer di eluizione e scissione. Abbiamo trovato che i valori di CV % delle piste sono sotto i 15% in tutti i casi, il che implica che una calibrazione singolo substrato possa essere utilizzata per la valutazione delle diverse misurazioni eseguite da varianti di substrato contenente lo stesso tag fluorescente.

Discussione

Dovuto le indagini intense di accademiche ed industriali di enzimi proteolitici e la costante richiesta di piattaforme compatibili con HTS proteasi dosaggio rapide e conveniente di conseguenza, abbiamo sviluppato una proteasi fluorescente magnetico-perlina-based test. Il test si basa sull'uso di proteine di fusione ricombinante che possono essere romanzo alternative per i substrati del peptide sintetico ampiamente utilizzato.

Nel formato di analisi sviluppato, i substrati di proteine di fusione sono immobilizzati sulle superfici di Ni-chelato-rivestito dell'agarosi magnetico perline. L'attaccamento di substrato è fornito dal N-terminale suo tag di affinità6 della proteina di fusione, che è direttamente fusa ad un tag MBP per facilitare la piegatura e che permettono di migliorare la solubilità in acqua del substrato13. Il MBP è seguito da siti di fenditura di TEV PR e una proteasi di interesse. Il primo può servire come un sito di clivaggio del controllo nell'analisi, mentre quest'ultimo può essere elaborato dalla proteasi per essere studiato. Il sito di clivaggio è intercambiabile; un dsDNA breve sequenza che codifica per il sito di clivaggio di interesse può essere inserito nella cassetta clonazione flessibile del plasmide di espressione tramite la legatura. Le proteine di fusione ricombinante contengono un tag altamente stabile, monomerica proteina fluorescente al C-terminale, che consente il rilevamento di endpoint dei prodotti di clivaggio C-terminale dell'enzima-liberato, fluorescenti rilasciato al momento del taglio proteolitico ( Figura 1A). I substrati intatti fluorescenti purificati risolti nei diversi buffer vengono utilizzati anche per la calibrazione per valutare le concentrazioni molari di substrati e prodotti di clivaggio. Inoltre, dopo fluorimetria, i componenti di analisi possono essere analizzati da SDS-PAGE, pure. Entrambi nativi (nondenatured) e denaturate proteine fluorescenti possono essere visualizzate in gel, immediatamente dopo l'elettroforesi o dopo successive in gel rinaturazione, rispettivamente. Questa ulteriore procedura-in combinazione con un convenzionale Coomassie Brilliant Blue macchiatura-maggio essere utilizzato in modo efficiente per verificare i risultati del saggio (Figura 1B).

La procedura di dosaggio è costituito da passaggi semplici, facile-a-execute in un formato di basso volume che può essere completamente adattato a un ambiente automatico ad alta velocità. Tuttavia, indipendentemente dall'esecuzione del dosaggio sia manualmente che con un sistema di automazione, le seguenti parti del test sono considerate essere cruciale e necessitano di particolare attenzione durante l'esecuzione della procedura. i) omogeneità della soluzione biglie magnetiche. Una soluzione omogenea Beads magnetiche deve essere utilizzata durante tutto il test, sia nella purificazione e fasi di lavaggio. In particolare, l'affidabilità delle proteasi analisi dipende fortemente correttamente aliquotare le soluzioni stock di biglie magnetiche attaccato al substrato (SAMB). Al fine di aumentare l'efficacia della sospensione e dispersione, è consigliabile impostare la concentrazione di perlina tra 2% e 10% (v/v). Durante la preparazione del campione, l'uso di buffer completati con detergente non ionico (come Triton X-100 o Tween 20) fino al 2% può anche diminuire l'aderenza dei branelli magnetici per superfici in plastica. L'aderenza delle perle alle pareti delle fiale del campione può essere evitato se le sospensioni della perla vengono applicate con cura il fondo delle fiale anziché sulle pareti di provette per campioni. L'omogeneità dei branelli magnetici durante la reazione enzimatica è anche critico e può essere assicurata agitando continuamente i campioni a 600 giri/min durante l'incubazione. Perline correttamente vengono dispersi in mercanzie in plastica arrotondate o fondo piatto, mentre l'uso di fiale di fondo V non è raccomandato. Un risultato non ottimale causato da omogeneizzazione tallone improprio è rappresentato in Figura 4B. II) terminazione dei campioni di reazione.  Un altro vantaggio del metodo è che la reazione enzimatica può essere risolto senza l'uso di trattamento termico denaturazione o eventuali agenti chimici potenzialmente interferenti15. La terminazione può avvenire semplicemente separando i branelli magnetici dalla miscela di reazione, utilizzando un concentratore a particelle magnetiche convenzionali. Mentre il tampone di reazione rimosso contiene l'enzima attivo e i prodotti di clivaggio fluorescente C-terminale generati, i substrati ApoAlert rimangono attaccati ai talloni. A causa della presenza dell'enzima attivo nel buffer di reazione, la procedura di separazione deve essere eseguita con attenzione per rilevamento di endpoint affidabile. Prima di mettere le fiale per campioni nel concentratore, è consigliabile applicare una centrifugazione breve giro. Dopo aver posizionato i tubi nel concentratore, fornire almeno 15 s per le perline per essere raccolti. Leggero movimento di avanti e indietro il separatore può facilitare la raccolta delle perle. Si prega di considerare che, durante una separazione eseguita manualmente, la cessazione di solito richiede più tempo rispetto l'inizio delle reazioni. Di conseguenza, un ritardo di circa 2 min registrato è consigliato tra le iniziazioni se stesso tempo di incubazione deve essere applicato a tutti i campioni.

Il principio del dosaggio proteolitico descritto è relativamente semplice; Tuttavia, la versatilità del sistema è garantita dalla struttura substrato flessibile e stabile. L'ottimizzazione individuale del dosaggio può essere limitata solo dalla compatibilità dei branelli di affinità con le condizioni applicate, reagenti e additivi. In accordo con il protocollo del produttore, abbiamo anche trovato che il legame di affinità di substrati per le superfici di perlina di Ni-NTA indebolisce sostanzialmente a pH ≤ 6,515. Pertanto, si raccomanda di applicare campioni bianchi substrato paralleli per i campioni di reazione, e il tasso di dissociazione spontanea substrato deve essere considerata durante la valutazione dei risultati.

In questi casi, dove non è possibile eseguire analisi magnetica-perlina-based dovute all'uso di componenti della perla-incompatibile o un pH basso, si può applicare anche in soluzione digestione dei substrati ricombinante purificati. In questi casi, le miscele di reazione possono essere analizzate mediante elettroforesi e le proteine possono essere visualizzate in gel basato sul protocollo descritto. Per studiare l'attività proteolitica, digestione in soluzione e in gel rilevamento delle proteine possono anche essere strumenti alternativi di fluorimetria. Una novità del sistema progettato substrato è l'applicazione di un passo di rinaturazione in gel dopo denaturazione SDS-PAGE. Mentre native proteine fluorescenti (nondenatured) mantengono la loro fluorescenza durante l'elettroforesi, la proprietà fluorescenti è abolita dopo denaturazione (figura 7B). Tuttavia, la fluorescenza delle proteine denaturate possa essere recuperata parzialmente dalla rimozione di SDS dal gel. Così, una separazione dei componenti di reazione utilizzando condizioni denaturanti permette non solo la base di fluorescenza ma l'identificazione molecolare-Peso-basato. Un altro vantaggio del rilevamento in gel fluorescente rispetto all'analisi di un gel di Coomassie-macchiato è che le proteine fluorescenti (nativo o rinaturalizzato) possono essere facilmente identificate nel gel basato su loro fluorescenza (Vedi Figura 7). Questo può essere importante se reazioni di scissione sono eseguite in campioni contenenti contaminanti o proteine altamente simile ai pesi molecolari di a vicenda.

Dosaggi di proteasi allo stesso modo utilizzando substrati progettati sono già stati pubblicati precedentemente8,9,10, e anche se il sito di clivaggio di interesse in quei casi si trovava anche tra un tag di affinità e un proteina fluorescente, il sistema di analisi presentato qui non solo si ripete le idee descritte ma unisce i diversi vantaggi delle piattaforme precedenti e li completa anche con ulteriori miglioramenti: i) l'utilizzo di un partner di fusione di MBP, ii) la presenza di un sito di clivaggio del controllo PR TEV, iii) l'uso di nuova progettazione monomerica FPs e iv) l'applicazione di una procedura di calibrazione del substrato unico. Il dosaggio stesso è stato specialmente progettato per essere utile per la specificità degli enzimi e studi cinetici in una cassaforte, modo tempo e costo-efficiente, senza la necessità di costosi strumentazione. Il metodo è destinato ad essere uno strumento adatto e conveniente per entrambi gli scopi di ricerca accademici e industriali. Grazie alla flessibilità della cassetta' clonazione' del plasmide di espressione, il sistema potrebbe essere adatto per la generazione veloce e poco costoso di librerie di substrato ricombinante. Il test descritto nel presente documento è uno strumento fattibile per l'attuazione della specificità di substrato, mutagenesi di enzima, e inibizione studi e, inoltre, fornire uno strumento alternativo per eseguire la cinetica enzimatica. La piattaforma di analisi (da rottura di cellule batteriche per la determinazione dei parametri cinetici) può essere adattata a un ambiente basato su HTS e automazione e, potenzialmente, può essere applicata in screening dell'inibitore della proteasi industriale e/o farmaco antivirale sviluppo. Inoltre, l'adattamento del dosaggio per proteolisi competitivo è anche in futuro ambito del nostro laboratorio. In un'analisi di competitiva, due differenti substrati-each contenente un sito di clivaggio diverso fuso a un differente C-terminale fluorescente tag-sono destinato a essere usati simultaneamente nella stessa reazione di scissione per indagare la preferenza dei studiati enzima per le sequenze di destinazione specificata. Inoltre, l'uso di una forma di dosaggio adattato piastra 96 pozzetti (Figura 8) è anche essendo ottimizzato per lo screening di mutazione utilizzando una serie di substrati con sequenze di sito di clivaggio modificate in caso di proteasi a cisteina.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dal progetto GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming" e, anche, finanziato dal programma di eccellenza istituzionale dell'istruzione superiore del Ministero di capacità umane in Ungheria, nell'ambito della Programma tematico di biotecnologia dell'Università di Debrecen. Gli autori sono grati per i membri del laboratorio di biochimica retrovirali per il loro contributo scientifico durante lo sviluppo di test e anche per la loro pazienza durante le riprese del saggio (soprattutto a Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz e Vanda Toldi, che appaiono sullo sfondo del video). Gli autori inoltre vorrei dire speciale grazie a Gedeon Richter Plc., specialmente al Dr. Zoltán Urbányi per consentire il lavoro di Beáta Bozóki nel dipartimento di biochimica e biologia molecolare come ricercatore ospite. Gli autori piacerebbe anche estendere la loro gratitudine a György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi e Zoltán Király dal centro tecnico di E-learning dell'Università di Debrecen e Multimedia per l'assistenza professionale in audio e video produzione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette Amicon 10KMerck-MilliporeUFC501096
2-Mercaptoetanolo (β-ME)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) M6250
40% Acrilammide/Bis soluzione 37,5:1Bio-Rad1610148
Acido acetico Merck100063
AgarosioSERVA11404.04
Alpha Imager HP sistema di documentazione su gelProteinSimple
Ammonio persolfato (APS)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A3678
Sale sodico di ampicillinaSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifugaBeckman Coulter392185
Piastre nere a mezza areaGreiner bio-One675086
blu di bromofenoloSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) B0126
Tampone CutSmart (10x)New England BiolabsB7204SPer la linearizzazione dei plasmidi (passaggio 1.1.1)
Lettore scuro transilluminatoreClare Chemical ResearchDR-45M
DNase I New England BiolabsM0303L
Dynamag-2  particella magnetica  concentratoreThermo Fischer Scientific12321D
Escherichia coli BL21(DE3) cellule competenti Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)C600003
EtanoloMerc-Millipore100983
Acido etilendiamminotetraacetico  (EDTA)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 
Colorante di caricamento in gel, viola (6X)New England BiolabsB7024S
GliceroloMerck356350
GlicinaSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) G7126
Mini kit di plasmidi ad alta velocitàGeneAidPD300
ImidazoleSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 56750
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)AM9464
Centrifuga Jouan CR 412JouanCR412
Labinco LD-76 Rotator Labinco7600
Luria-Bertani (LB) brodoSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) L3022
LisozimaSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) L6876
Cloruro di magnesioScharlauMA0036
MERCK eurolab bagno ad ultrasuoniMERCKUSR54H
Millifuge Eppendorf centrifuga di spinMilliporeCT10
Mini-PROTEAN 3 Cella di elettroforesiBio-Rad
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina (TEMED)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) T9281
NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific
Endonucleasi di restrizione NheI-HFNew England BiolabsR3131L
Solfato di nichel (II) (NiSO4)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 
Perle di agarosio magnetico Ni-NTAQiagen36113
Agitatore orbitaleBiosanOS-20
PacI restrizione endonucleasiNew England BiolabsR0547L
PageBlue Soluzione di colorazione delle proteine Thermo Fischer Scientific24620
Fenilmetansulfonil-fluoruro (PMSF)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) P7626
Provette per microcentrifuga Protein LobindEppendorf22431102
Kit di estrazione del gel QIAquickQIAGEN28704
Snijders Agitatore press-to-mix Gemini34524
Acetato di sodio triidratoSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S7670
Cloruro di sodioSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S9888
Idrossido di sodio Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S5881
SYBR Green I Colorazione in gel per acido nucleicoThermo Fischer ScientificS7563
T4 DNA ligasiPromegaM180A
Thermo shakerBiosanTS-100con blocco accessori SC-24
TrisSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) T1503
Tween 20Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) P2287
WALLAC VICTOR2 1420 contatore multilabelWallac Oy, Turku, Finlandia
798681656895

Riferimenti

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