Articolo metodologico

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

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DOI:

10.3791/58825

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7 gennaio 2019

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1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

In questo articolo

Sommario

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Abstract

Il cancro come un processo multistep e malattia complicata è non solo regolato da crescita e proliferazione delle cellule individuali ma anche controllato da interazioni cellula-cellula e ambiente del tumore. Identificazione del cancro e cellule staminali interazioni, compresi i cambiamenti nell'ambiente extracellulare, interazioni fisiche e fattori secreti, potrebbe consentire la scoperta di nuove opzioni di terapia. Uniamo le tecniche di co-cultura conosciuta per creare un sistema modello per cancro e cellule staminali mesenchimali (MSCs) interazioni cellula. Nello studio corrente, le cellule staminali della polpa dentale (DPSCs) e interazioni cellula di PC-3 del carcinoma della prostata sono stati esaminati mediante tecniche dirette e indirette di co-coltura. Medio di condizione (CM) ottenuti da DPSCs e 0,4 µm poro dimensioni trans-pozzo membrane sono state usate per studiare l'attività paracrina. Co-coltura di diversi tipi di cellule insieme è stata effettuata per studiare l'interazione diretto cellula-cellula. I risultati hanno rivelato che CM aumentata proliferazione delle cellule ed in diminuzione di apoptosi nelle colture cellulari del carcinoma della prostata. Sia CM e trans-pozzo sistema aumentata capacità di migrazione delle cellule delle cellule PC-3. Le cellule colorate con membrana diversi coloranti erano teste di serie le stesse navi di cultura, e DPSCs ha partecipato a una struttura auto-organizzata con cellule PC-3 in questa condizione di co-coltura diretta. Nel complesso, i risultati hanno indicato che le tecniche di co-coltura potrebbero essere utile per cancro e interazioni di MSC come sistema modello.

Introduzione

Cellule staminali mesenchimali (MSCs), con la capacità di differenziazione e contributo alla rigenerazione dei tessuti mesenchimali quali l'osso, cartilagine, muscolo, legamento, tendine e adiposo, sono state isolate da quasi tutti i tessuti nel corpo adulto1 , 2. diversi dalla fornitura dell'omeostasi tissutale producendo cellule residenti in caso di infiammazione cronica o una ferita, che producono vitale citochine e fattori di crescita per orchestrare l'angiogenesi, sistema immunitario ed il tessuto che ritocca3. L'interazione di MSCs con tessuto del cancro non è ben compreso, ma raccogliendo la prova suggerisce che MSCs potrebbe promuovere di iniziazione, la progressione e la metastasi del tumore4.

La capacità di homing delle MSC nell'area lesa o cronicamente inflamed li rende un valido candidato per terapie basate sulle cellule staminali. Tuttavia, nei tessuti tumorali, "mai guarigione delle ferite", anche rilascio di citochine infiammatorie, molecole pro-angiogenici e fattori di crescita vitale, che attraggono MSCs al cancerogene zona5. Mentre ci sono limitati rapporti che mostrano gli effetti inibitori di MSCs su cancro crescita6,7, loro progressione tumorale e metastasi promuovere effetti sono stati ampiamente riportati8. MSCs direttamente o indirettamente influenzare la carcinogenesi in modi diversi, inclusa l'eliminazione di cellule immunitarie, che secernono le citochine/fattori di crescita che supportano la proliferazione della cellula tumorale e migrazione, migliorando l'attività angiogenica e regolazione transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)9,10. Ambiente tumorale è costituito da diversi tipi cellulari fibroblasti cancro-collegati (CAFs) e/o miofibroblasti, cellule endoteliali, adipociti e cellule immuni11. Di quelli, CAFs sono il tipo più abbondante di cellule nella zona del tumore che secernono diverse chemochine, promuovere la crescita e la metastasi di cancro8. È stato dimostrato che MSCs derivate da midollo osseo possono differenziare in CAFs nel tumore dello stroma12.

Cellule staminali della polpa dentale (DPSCs), caratterizzate come il primo MSCs dentale di tessuto-derivato da Gronthos et al. 13 nel 2000 e quindi ampiamente studiato da altri14,15, esprimono marcatori di pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanoge16 e possono differenziarsi in varie cellule linages17. Analisi di espressione genica e proteica ha dimostrato che DPSCs produrre livelli comparabili di fattori di crescita/citochine con altri MSCs come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), angiogenina, fattore di crescita del fibroblasto 2 (FGF2), interleuchina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fattore di cellula formativa (SCF), così come ligando di chinasi-3 fms-come tirosina (Flt - 3L) che potrebbe promuovere l'angiogenesi, modulano le cellule immuni e sostenere il cancro delle cellule di proliferazione e migrazione18,19,20 . Mentre le interazioni di MSCs con ambiente di cancro sono state ben documentate nella letteratura, il rapporto tra DPSCs e le cellule tumorali non è stato valutato ancora. Nello studio presente, abbiamo stabilito le strategie di trattamento medio di co-cultura e condizione per una linea cellulare altamente metastatica del carcinoma della prostata, PC-3 e DPSCs a proporre azione potenziale del meccanismo di MSCs dentale nella progressione del cancro e metastasi.

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Protocollo

Consenso informato dei pazienti è stata ottenuta dopo l'approvazione del Comitato di etica istituzionale.

1. DPSC isolamento e coltura

  1. Trasferire i denti del giudizio ottenuti da giovani adulti di età compresa tra 17 e 20 a 15 mL tubi contenenti per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco completa) [bassa media DMEM glucosio, completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina / amfotericina (PSA) soluzione], entro 8 h dopo resezione. Mantenere il tessuto materiale freddo (4 ° C) durante il trasferimento per evitare la potenziale delle cellule morte.
  2. Rimuovere attentamente il tessuto della polpa di pinze dentate sterile dal centro del dente, posizionare il tessuto della polpa a freddo medio DMEM completo in piastre di coltura del tessuto di 10cm e tritateli in piccoli pezzi (2-3 mm) di bisturi.
    Nota: Tutte le procedure sperimentali devono essere effettuate in condizioni di sterilità in cappa a flusso laminare. Questa tecnica non-enzimatica è stato utilizzato in precedenza21,22,23.
  3. Tessuti di polpa piccolo posto all'interno della cultura del tessuto trattato piastre da 6 pozzetti e aggiungere 200 µ l di multimediale DMEM completo per coprire ogni pezzi di tessuto di piccola polpa.
  4. Incubare i pozzetti di coltura del tessuto a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata (80% di umidità) con 5% CO2 per 2 h fornire il collegamento del tessuto.
    Nota: Questo passaggio potrebbe essere prolungato a 3-4 h controllando l'evaporazione dei media.
  5. Aggiungere volume appropriato (2-2,5 mL) di terreno DMEM completo ai pozzetti e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata con 5% CO2 per celle a diffondersi dal tessuto.
    Nota: Le cellule diventano visibili dopo circa 4 giorni e raggiungono la confluenza dopo 8-9 giorni.
  6. Quando le cellule raggiungono 80% confluency, rimuovere supporti da piastre da 6 pozzetti, lavare con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO2. Quindi aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
  7. Cellule di passaggio per le beute in completa DMEM media e archivio per ulteriori esperimenti. Aggiungere 15 mL di multimediale completo di DMEM al boccette di T-75 e cellule di trasferimento da due pozzetti della piastra 6 pozzetti per boccette di T-75 uno e incubare a 37 ° C con aria umidificata atmosfera e 5% CO2.

2. caratterizzazione di DPSCs

  1. Eseguire analisi morfologiche.
    1. Cellule di seme (passo 1.6) nella coltura del tessuto rivestito boccette (o piastre da 6 pozzetti) in terreno DMEM completo per almeno 8 passaggi osservare la morfologia delle cellule.
    2. Visualizzare le cellule dal microscopio ottico e definire la morfologia delle cellule del fibroblasto-come. Le cellule dovrebbero allegare per i piatti di cultura e morfologia delle cellule dell'alberino-come.
      Nota: In alternativa, le cellule possono essere coltivate come singole cellule fino a 14 giorni in piastre a pozzetti per osservare la capacità di formazione di Colonia che è una caratteristica specifica dei fibroblasti e MSCs.
  2. Eseguire analisi di superficie dell'indicatore.
    1. Tripsinizzano le cellule dal punto 1.7. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura del tessuto T-75, lavare con 2 mL di PBS e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO2. Quindi aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
    2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 min a temperatura ambiente in provette da 1,5 mL e poi lavarli con 500 µ l di PBS 3 volte per rimuovere paraformaldeide.
    3. Incubare le cellule fisse con gli anticorpi contro CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 e CD73 per 1 h a 4 ° C in 100 µ l di PBS.
      Nota: La concentrazione di anticorpo utilizzato è 0,5 µ g/mL. CD45, CD14 e CD34 sono usati come indicatori negativi, mentre CD29, CD90, CD105, CD166 e CD73 sono usati come indicatori della superficie delle cellule positive per MSCs.
    4. Lavare le cellule 3 volte con PBS e utilizzare i rispettivi anticorpi secondari quali isotiocianato di fluorescina (FITC), ficoeritrina (PE), ecc per l'etichettatura. Incubare le cellule con anticorpi secondari 1: 500 diluito in 100 µ l di PBS per 30 min a 4 ° C e lavare 3 volte con PBS.
    5. Mantenere i campioni al buio per l'analisi di citometria a flusso e rilevare positivi e negativi di colorazione tramite flusso cytometry.
      Nota: Utilizzare le cellule di controllo non macchiate per disporre dispersione avanti e laterali. Organizzare il gating di positivamente macchiato popolazioni escludendo le cellule morte, detriti e popolazione non-macchiata. Utilizzare 100 µm ugello con 45 psi di pressione di guaina e raccogliere 10.000 eventi per determinare DPSCs positivo organizzando canali.
  3. Eseguire la differenziazione di DPSCs.
    1. Cellule di4 seme 1 × 10 sulle piastre a 24 pozzetti in completano media DMEM e incubare per 24 h a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata con 5% CO2.
    2. Formulare la differenziazione media utilizzando competere medium DMEM come supporto di base. Preparare i supporti osteogenici mescolando 100 nM desametasone, β-glicerofosfato di 10 mM e acido ascorbico 0.2 mM. Preparare i supporti condrogenica mescolando 1 × insulina-transferrina-selenio (ITS-G), 100 nM desametasone, 100 ng/mL crescita fattore trasformante beta (TGF-β), 14 μg/mL di acido ascorbico e 1 mg/mL albumina di siero bovino (BSA). Preparare i supporti adipogenico mescolando 100 nM desametasone, insulina di 5 μg/mL, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e indometacina di 60 μM.
      Nota: Media di differenziazione può essere mantenuto a 4 ° C per almeno una settimana.
    3. Cambiare la crescita media a osteo-, condro- o differenziazione adipo-genica supporto e aggiornamento media due volte a settimana per due settimane.
    4. Confermare la differenziazione di von Kossa e Alcian blu colorazione, attività enzimatica (attività della fosfatasi alcalina), immunocitochimica e analisi (qPCR) reazione a catena della polimerasi quantitativa secondo i protocolli precedentemente descritto21.
      1. Eseguire colorazioni di Alcian blu e von Kossa sulle cellule che sono fissate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 10 min. lavare le cellule fisse con PBS e li macchia con il kit di vonKossa secondo le raccomandazioni del produttore per osservare i giacimenti del calcio .
      2. Preparare la soluzione di colorazione sciogliendo 1,00 g di colorante blu di Alcian in 100 mL di acido acetico al 3% (v/v) per ulteriore colorazione blu di Alcian. Lavare le cellule fisse con PBS e macchia le cellule per 30 min con soluzione di Alcian blu. Visualizzare i campioni macchiati da un microscopio ottico.

3. preparazione della condizione medio (CM)

  1. Sostituire il supporto delle cellule dal passaggio 1.7 con fresca completa DMEM 24 h prima collezione CM.
    Nota: Passaggio 2-4 è consigliato.
  2. Raccogliere media condizione (CM) da DPSCs colta quando le cellule di raggiungere confluency di 80%. Centrifugare media raccolti a 300 x g per 5 min rimuovere rifiuti tessuto materiale e detriti cellulari.
    Nota: In alternativa, utilizzare filtri per siringa 0,2 µm per rimuovere i detriti dal mezzo di condizione.
  3. Raccogliere il surnatante e conservare a-20 ° C per ulteriori esperimenti.
    Nota: Conservare il supernatante a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. trattamento delle cellule tumorali con CM

  1. Eseguire analisi di attuabilità delle cellule.
    1. Cellule PC-3 semi (cellule di carcinoma della prostata umane) in piastre da 96 pozzetti ad una densità di cella di 5 × 103 cellule/pozzetto in DMEM di completare e incubare in una camera umidificata a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h.
    2. Curare le cellule con 10, 20, 30, 40 e 50% cm (v/v) mescolate con DMEM completo per 24 h.
    3. Misurare la vitalità cellulare tramite 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-dosaggio come descritto in precedenza24.
  2. Eseguire terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick fine etichettatura analisi (TUNEL).
    1. Cellule PC-3 seme su coltura cellulare 6 pozzetti piastre ad una densità di cella di 2 × 105 cellule/pozzetto e incubare per una notte in una camera umidificata a 37 ° C e 5% CO2 .
    2. Mescolare 20% (v/v) di CM con completare mezzo DMEM e applicare alle celle per 24 h.
    3. Tripsinizzano cellule e sospendere in 50 μL di miscela di reazione di TUNEL (etichettatura soluzione + soluzione enzimatica, fornito nel kit) e incubare a 37 ° C per 60 min in un'atmosfera di2 umidificata e 5% di CO.
      Nota: Per trypsinization, rimuovere i supporti da piastre per colture cellulari a 6 pozzetti, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO2. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
    4. Risciacquare con PBS e analizzare le cellule in PBS tramite flusso cytometry.
  3. Eseguire analisi qPCR.
    1. Cellule PC-3 seme su coltura cellulare 6 pozzetti piastre ad una densità di cella di 2 × 105 cellule/pozzetto e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 .
    2. Mescolare 20% (v/v) di CM con completare mezzo DMEM e applicare alle celle per 24 h.
    3. Tripsinizzano cellule e raccogliere il pellet cellulare per la sintesi di RNA isolamento e cDNA.
      Nota: Rimuovere i supporti da piastre per colture cellulari a 6 pozzetti, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina. Incubare 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO2. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
    4. Esperimenti di qPCR secondo il protocollo descritto in precedenza25.
  4. Eseguire la migrazione delle cellule delle cellule tumorali.
    1. Seme 1 × 105 PC-3 cellule sul 12-pozzetti e incubare in un incubatore umidificato durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Graffiare le cellule con una punta sterile 200 μL e sostituire il terreno immediatamente con medium fresco contenenti varie concentrazioni di CM [ad es., 10, 20, 30, 40 e 50% cm (v/v) mescolato con DMEM completo].
    3. Osservare graffi sotto un microscopio invertito e scattare foto a intervalli di tempo diversi (0 e 24 h).
    4. Misurare la chiusura gratta e Vinci utilizzando il software Image J utilizzando la formula:
      figure-protocol-1
      Nota: Aprire l'immagine gratta e Vinci con software Image J. Disegnare una linea che ha la stessa grandezza come la barra della scala che esiste già nell'immagine. Fare clic su analizza, impostare scala e osservare la distanza in pixel come l'ingrandimento della linea disegnata. Scrivere la dimensione della barra della scala alla parte di distanza nota, organizzare unità (pixel, centimetri, ecc.) e fare clic su ok. Vai alla sezione analizza nuovamente e clicca su misure. In primo luogo, questo vi darà la dimensione della barra della scala come unità di misura selezionata. Fare clic su un bordo di gratta e Vinci e trascinare fino a raggiungere l'altra estremità del graffio. Prendere nota del valore di ciascun punto di tempo (0 h e 24 h). Inserire questi valori nella formula sopra riportata e calcolare la chiusura gratta e Vinci.

5. cell migrazione per contatto indiretto delle cellule tumorali e DPSCs

  1. Seme 3 × 104 DPSCs sulla piastra a 24 pozzetti inserti con 0,4 μm del poro e incubare in un incubatore durante la notte a 37 ° C.
  2. Le cellule PC-3 di semi sui 24 pozzetti piastre a una densità di cella di 5 × 104 e incubare in un incubatore umidificato durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.
  3. Graffiare le cellule PC-3 con una punta sterile 200 μL, sostituire il terreno con mezzo fresco e posizionare inserti portato DPSCs sulla cellule PC-3.
  4. Osservare le cellule al microscopio invertito e scattare foto a intervalli di tempo diversi (0 e 24 h) per analizzare la migrazione cellulare.

6. analisi di co-cultura e analisi di citometria a flusso

  1. Etichetta le cellule PC-3 e DPSCs utilizzando PKH67 (verde) e PKH26 (rosso) delle cellule fluorescenti del linker coloranti, rispettivamente26.
  2. Tripsinizzano cellule PC-3 e DPSCs, rispettivamente. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura del tessuto T-75, lavare con 2 mL di PBS e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO2. Aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina.
  3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nella soluzione colorante preparata in tampone diluente-C fornito dal kit (Vedi Tabella materiali).
  4. Incubare le cellule nella soluzione colorante per 10 min e terminare la reazione di macchiatura aggiungendo 100 µ l di FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e lavare le cellule con il mezzo di crescita completa prima di co-coltura.
  5. Piastra con l'etichetta cellule (5 × 104/bene) su piastre da 6 pozzetti con rapporto 1:1 (DPSCs: PC3). Mantenere le cellule co-coltivate in DMEM completo.
  6. Raccogliere le cellule dopo periodi di incubazione di 24 o 48 ore mediante centrifugazione delle cellule a 300 x g per 5 min ed il lavaggio con PBS.
  7. Risospendere le cellule in 300 µ l di fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento buffer (FACS) in 5 mL basso flusso cytometry tubi rotondi. Vortex per disperdere aggregati cellulari in prima analisi del campione.
  8. Utilizzare un ugello di 100 µm con 45 psi di pressione di guaina.
    Nota: Estremamente alta portata potrebbe diminuire la sensibilità di rilevazione di fluorescenza.
  9. Utilizzare le cellule di controllo non macchiate e singole celle colorate per regolare appropriato avanti e tensione di laser a dispersione laterale per tipi cellulari e compensazione come accennato in precedenza il27.
    Nota: Utilizzare gating per cellule vive per escludere detriti cellulari, cellule morte o aggregati.
  10. Raccogliere 10.000 eventi (100.000 è preferibile) per determinare la percentuale positiva DPSCs verde e rosse cellule PC-3 organizzando FL-1 (verde) e canali di FL-2 (rosso).

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Risultati

Figura 1 illustra le caratteristiche generali di MSC di DPSCs in condizioni di coltura. DPSCs esercitare morfologia fibroblasto-come delle cellule dopo il placcaggio (Figura 1B). Antigeni di superficie MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 e CD166) sono altamente espressi mentre marcatori ematopoietici (CD34, CD45 e CD14) sono negativi (Figura 1). Modifiche a livello morfologico e molecolare relativo a osteo-...

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Discussione

Contributo di MSCs per ambiente tumorale è regolata da numerose interazioni tra cui ibrido cellulare generazione tramite cella fusioni, Citoplasto o citochine e chemochine attività tra cellule staminali e cancro cellule28. Organizzazione strutturale, interazioni cellula-cellula e fattori secreti determinano il comportamento delle cellule di cancro in termini di promozione del tumore, la progressione e la metastasi al tessuto circostante. Corretto ex vivo sistemi modello per studi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da Yeditepe University. Tutti i dati e i dati utilizzati in questo articolo sono stati precedentemente pubblicati34.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMInvitrogen11885084Per colture cellulari
FBSInvitrogen16000044Per colture cellulari
PSALonza17-745EPer colture cellulari
TripsinaInvitrogen25200056Per dissociazione cellulare
PBSInvitrogen10010023Per lavaggi
DesametasoneSigmaD4902Componente del mezzo di differenziazione
β-GlicerofosfatoSigmaG9422Componente del mezzo di differenziazione osteogenica
Acido ascorbicoSigmaA4544Componente del mezzo di differenziazione osteo- e condro-genico
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS − G)Invitrogen41400045Componente del mezzo di differenziazione condrogenica
TGF-βSigmaSRP3171Componente del mezzo di differenziazione condrogenica
InsulinaSigmaI6634Componente del mezzo di differenziazione adipogenica
Isobutil-1-metilxantina (IBMX)SigmaI7018Componente del mezzo di differenziazione adipogenica
IndometacinaSigmaI7378Componente del mezzo di differenziazione adipogenica
Reagente MTSPromegaG3582Analisi di vitalità cellulare
TUNEL AssaySigma 11684795910Analisi apoptotiche
Inserti per piastre a 24 pozzettiCorning3396Per il saggio di migrazione trans-pozzetto
PKH67SigmaPKH67GLPer la colorazione cellulare in co-coltura
PKH26SigmaPKH26GLPer la colorazione cellulare in
co-colturaParaformaldeideSigmaP6148Per la fissazione cellulare
von Kossa KitBioOptica04-170801.APer la colorazione cellulare (differenziazione)
Alcian blueSigmaA2899Per la colorazione cellulare (differenziazione)

Riferimenti

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