In questa carta, ci proponiamo di descrivere le prestazioni della tecnica di centrifugazione su gradiente di densità e la sua applicazione nella ricerca di fisiologia di sperma.
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Articolo metodologico
Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella riproduzione sessuale, un gamete maschile o spermatozoo si fonde con un gamete femminile per portare sulla fertilizzazione. Tuttavia, un gran numero di spermatozoi con capacità fecondante è necessario interagire con un gamete femminile per garantire la fecondazione. Come tale, la capacità fecondante degli spermatozoi individuale è fondamentale per riproduzione riuscita. Centrifugazione in gradiente di densità è stata utilizzata per diversi decenni come un metodo riproducibile, veloce, efficiente, efficace ed estremamente adattabile per raccogliere solo alta qualità sperma per essere utilizzato in riproduzione assistita. I protocolli che abbiamo descritto nel presente documento si concentrano sull'utilizzazione della tecnica di centrifugazione su gradiente (PDGC) di densità Percoll discontinua per isolare tre distinte popolazioni di sperma Gallo per la loro qualità. Siamo stati in grado di raccogliere basso, medio e alta qualità sperma. Descriviamo anche protocolli riproducibile che comportano determinante potenziale di fertilità dello sperma di valutazione della loro vitalità, la mobilità e la penetrabilità. Raccolta dello sperma per la loro qualità tecnica PDGC sarebbe utile per accuratamente e caratterizzare accuratamente sperma con differenziale fertilità potenziale.
Introduzione
Nei vertebrati, gameti maschili sottoposti a forte pressione selettiva; pertanto la fitness riproduttiva di un maschio è fondamentale per il raggiungimento di fecondazione. I maschi di qualsiasi specie di vertebrati determinato devono essere in grado di produrre spermatozoi in grandi quantità e di qualità sufficiente per soddisfare le esigenze di fecondazione. Spermatozoi, avendo sia una testa di sperma e un flagello, sono le cellule più polarizzate nel corpo. Essi sono anche molto eterogenei nella qualità dello sperma (bassa dal vivo e morto, morfologicamente normale e anormale e immobile, mobile e alta mobile), che si rivela attraverso la variazione larga nella effi....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgia.
1. lavaggio utilizzando una centrifuga tradizionale
- Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 8,0 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 a 800 mL di acqua distillata (dH2O). Regolare il pH a 7.4 utilizzo 0,1 N HCl e portare la soluzione a 1 L utilizzo dH2O.
- Preparare il tampone di motilità. Aggiungere 6,5 g di NaCl, 4,5 g di glucosio, 0,444 g di CaCl2 e 11,5 g di N - tris-[idros....
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Risultati
La tecnica PDGC ha provocato la separazione dei tre strati di sperma distinti da grado di qualità attraverso tutti i parametri. Lo sperma si separa in un livello di alta qualità sotto la soluzione di densità superiore, uno strato di qualità media tra il superiore e inferiore densità soluzione e un livello di bassa qualità sopra la soluzione di densità inferiore. Queste differenze di qualità sono evidenziate mediante chiare differenze di redditività (Figura 4).......
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Discussione
Fertilità non solo determina la redditività della produzione animale, ma anche agisce come un mezzo della selezione naturale delle specie per l'esistenza. La funzione di una cellula di sperma è quella di fecondare un ovulo. Nell'ovidotto di una femmina seleziona solo quegli spermatozoi più adatti al fine di garantire la fecondazione dell'ovulo23,24. Studi in vitro hanno rivelato inoltre una stretta correlazione tra tratti qualitativi degli spermatozoi e .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, Stati Uniti | P7828 | |
| Schiff' s reagente | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Spettrofotometro UV/Vis per le scienze della vita | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Nessun catalogo trovato | |
| Olympus IX 71 Microscopio a fluorescenza invertita e contrasto di fase | Olympus America Inc., PA, USA | Nessun catalogo trovato |
Riferimenti
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gall....
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Ristampe e permessi
