In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

Summary

Questo studio si concentra su un modello in vitro di ferita guarigione (scratch test) come un meccanismo per la determinazione di contaminanti ambientali come migrazione cellulare di influenza di arsenico. I risultati dimostrano che questo test in vitro fornisce indicazioni rapide e precoce dei cambiamenti in materia di migrazione cellulare prima della sperimentazione in vivo .

Abstract

La comprensione dei meccanismi fisiologici di guarigione della ferita è stato al centro di ricerca in corso per molti anni. Questa ricerca si traduce direttamente in cambiamenti nella clinico standard utilizzati per il trattamento di ferite e diminuire la morbosità e la mortalità per i pazienti. Guarigione delle ferite è un processo complesso che richiede la funzione e l'interazione strategica di cellule e tessuti. Una delle molte funzioni criticamente importante di guarigione della ferita è individuale e collettiva di migrazione cellulare. Dopo un danno, varie cellule del sangue, tessuto connettivi ed epiteliali tessuti circostanti rapidamente la migrazione al sito della ferita mediante stimoli chimici e/o fisici. Questa risposta di migrazione può dettare in gran parte i risultati e il successo di una guarigione della ferita. Comprendere questa specifica funzione cellulare è importante per la medicina traslazionale che può portare a una migliore cicatrizzazione in esiti. Qui, descriviamo un protocollo utilizzato per capire meglio la migrazione cellulare per quanto riguarda la guarigione della ferita, e come le modifiche per l'ambiente cellulare possono alterare significativamente questo processo. In questo studio di esempio, fibroblasti cutanei sono stati coltivati in media completati con siero bovino fetale (FBS) come colture monostrato in recipienti di coltura del tessuto. Le cellule erano asetticamente trasferite in piastre di coltura di tessuti trattato 12-pozzetti e cresciute alla confluenza del 100%. Una volta raggiunta la confluenza, le cellule nello strato monomolecolare del verticalmente sono graffiate utilizzando una punta di pipetta p200. Arsenico diluito in terreno di coltura completato con FBS è stato aggiunto al singoli pozzetti a ecologicamente rilevanti dosi di 0,1-10 M. immagini sono state catturate ogni 4 ore (h) per un periodo di 24 ore utilizzando un microscopio ottico invertito per osservare la migrazione cellulare (ferita chiusura). Immagini singolarmente sono stati analizzati utilizzando software di analisi di immagine, e la chiusura della ferita per cento è stato calcolato. I risultati dimostrano che l'arsenico rallenta la guarigione della ferita. Questa tecnica fornisce una rapida e poco costoso prima schermata per la valutazione degli effetti di contaminanti sulla guarigione della ferita.

Introduction

La guarigione della ferita è costituito da una complessa serie di passaggi che implicano diversi tipi di cellule, molecole di segnalazione e di componenti della matrice extracellulare¹di sovrapposizione. Insieme, questi componenti funzionano di concerto per ottenere la risoluzione della ferita o riparazione, che infine conduce alla formazione di una cicatrice fibrotica protettiva secondo il grado di trauma¹. Per acquisire i singoli processi e funzioni di ferita in un esperimento di guarigione è difficile; singoli passi all'interno del processo di cicatrizzazione devono essere identificati ed analizzati separatamente. Tra i molti passaggi della guarigione delle ferite, il processo di migrazione cellulare è stato considerato critico durante la valutazione di guarigione tariffe². Migrazione cellulare può essere osservato in tutte le fasi di guarigione della ferita e così richiede ulteriore comprensione di come le alterazioni di migrazione cellulare possono influire la chiusura della ferita. Ad esempio, la migrazione cellulare è visto in sia infiammazione fase precoce e tardiva, con l'aggregazione della piastrina e di coagulazione di sangue la ferita sito³. Questi eventi per evitare eccessiva perdita di sangue che formano un blocco temporaneo per riempire aree feriti privo di tessuto³. Piastrine in circolazione si sintetizzano e secernono mediatori vasoattivi insieme a fattori chemiotattici, quale segnale insieme per migrazione di infiammatoria dei leucociti (globuli bianchi) al tessuto ferito per riparazione⁴. Riepitelizzazione avviene nelle ore della lesione del tessuto e coinvolge che copre il sito della ferita attraverso attività e migrazione dei cheratinociti epiteliali per prevenire ulteriori contaminazioni o invasione di particelle estranee alla ferita sito². Questi esempi catturano solo alcuni della migrazione cellulare molte funzioni associate con la guarigione delle ferite.

Il dosaggio di gratta e Vinci è stato descritto e utilizzato per capire meglio la migrazione cellulare ed i suoi molti ruoli nella cicatrizzazione^5,6. Questo test è considerato semplicistico, fornisce ad alta velocità e consente al ricercatore di raccogliere dati sulla migrazione cellulare rappresentativo. Saggi di migrazione hanno dimostrato con successo che alcuni composti possono accelerare o rallentare la velocità di migrazione cellulare⁶. Inoltre, questi risultati di test forniscono informazioni fisiologiche traslazionale che possono essere utilizzati per formulare trattamenti di destinazione, le concentrazioni ed i geni di interesse prima sperimentazione in vivo di dosaggio. Il test richiede tecniche di coltura cellulare di base e forniture, una linea cellulare di scelta e tecnologia di imaging per catturare il movimento nel tempo o in movimento in risposta ai trattamenti.

Il dosaggio può essere facilmente manipolato o su misura per soddisfare le esigenze del ricercatore. Tuttavia, ci sono quattro domande di base da considerare prima della sperimentazione. Quali domande generali o specifici è/sono lo sperimentatore cercando di rispondere? Questo vale per la maggior parte delle ipotesi guidato ricerca; Tuttavia, è fondamentale per questo test perché determinerà molti dei parametri necessari per accuratamente e completamente rispondere a delle domande. Cosa linea cellulare o linee cellulari (se più) deve essere utilizzati per rappresentare il sistema fisiologico in fase di studio? Ad esempio, in un cutaneo ferita guarigione studio, dei fibroblasti dermici^5,6,7, cellule staminali⁸, o dei cheratinociti epidermici⁹ potrebbe essere considerato per rappresentare le popolazioni di cellule che si trovano normalmente in abbondanza in pelle tessuto¹⁰. In alternativa, i neutrofili, macrofagi e altre cellule infiammatorie potrebbero essere valutati in questo sistema per rappresentare la migrazione delle cellule di altri componenti di guarigione della ferita all'interno della pelle tessuto¹⁰. Inoltre, identificare la linea di cella specifica in corso di valutazione contribuirà a identificare quali reagenti sono ottimali da utilizzare per promuovere l'attività metabolica cellulare. Come la migrazione cellulare sarà rintracciato/imaged? Ci sono una serie di tecniche usati per osservare la migrazione delle cellule all'interno di un piatto o un pallone. Ad esempio, tintura o fluorescente tagging cellule e utilizzo di fluorescenza o imaging confocale per rilevare cellule fornisce un contrasto forte, che permette al ricercatore di definire chiaramente cellulare vs non cellulare posizioni e movimento cellulare¹¹ . Un'altra tecnica comune, descritta in questo studio, è l'uso di microscopia chiara invertita con contrasto di fase^6,7. Questa alternativa a cella coloranti e fluorescenza permette all'utente di vivere traccia celle senza dover fissare terminalmente cellule prima di formazione immagine e permette anche di catturare le immagini degli stessi singoli pozzetti contenenti feriti monostrati di cellule attraverso punti di tempo. Misure di risultato che verrà utilizzato per l'analisi? Utilizzando le immagini raccolte in tutto lo studio, i dati possono essere generati in cui le modifiche ai tassi di migrazione cellulare possono essere compreso. Nel nostro laboratorio, microscopiche immagini acquisite con il microscopio ottico invertito vengono caricate di software di analisi di immagine e la chiusura della ferita per cento e sommato area sotto la curva (AUC) sono calcolati.

Ci metterà in evidenza l'uso specifico di questo test per delucidare le modifiche alla migrazione dei fibroblasti dermici in presenza di un contaminante ambientale noto, arsenico. L'arsenico è un metalloide naturale trovato all'interno della crosta terrestre. Varie località sono stati trovati con i livelli elevati di arsenico, che rappresenta un rischio per gli individui che vivono vicino a queste posizioni. Di conseguenza, le fonti di cibo e acqua sono stati indicati per hanno aumentato i livelli di contaminazione da arsenico, che aumenta la probabilità per gli individui a diventare esposti ad arsenico. Esposizione arsenica ambientale ha dimostrato di avere conseguenze a lungo termine di salute nelle popolazioni umane sopra o anche sotto l'attuale Agenzia di protezione ambientale Stati Uniti (USEPA) Max contaminante livello (MCL) di 10 ppb (10 µ g/L)^{12, 13}. Sebbene USEPA ha impostato questo MCL e ritenuto sicuro per bere i limiti, le concentrazioni di arsenico che superano questo limite non sono rare nelle sorgenti d'acqua in tutto il mondo. Negli Stati Uniti del sud-ovest, numerosi terra-acqua, acqua di pozzo e molle sono stati documentati per contenere per quanto riguarda i livelli di arsenico¹⁴. Ad esempio, nella Valle Verde, AZ, Montezuma Well contiene 210 µ g/L di arsenico¹⁵. Acque sotterranee intorno al fiume Verde, AZ contiene 16 µ g/L di arsenico in media, con valori di picco raggiunto 1,3 mg/L^15,16. In particolare, le concentrazioni di arsenico in molti pozzi nel capannone fiume Verde acqua superano 50 µ g/L^15,16. Con questa conoscenza, ambientali rilevanti concentrazioni di arsenico sono stati selezionati che vanno dal basso il MCL a 0.1 µM (7,5 ppb), sopra il MCL a 10 µM (750 ppb) nell'attuale studiare^{14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20} _.

Le informazioni raccolte da questi esperimenti verranno essere utilizzate come un indicatore precoce di potenziali modifiche ai tassi di migrazione cellulare in un in vivo della ferita contaminato da arsenico. In seguito, segnalazione molecole possono essere selezionati in base al loro ruolo nel facilitare la guarigione della ferita e la migrazione cellulare, ed esperimenti di espressione del gene di reazione a catena (qPCR) basato futuro della polimerasi quantitativa possono essere impostati al completamento della corrente studi. Se i tassi di migrazione in questo saggio cambiano in presenza di arsenico, specifici geni bersaglio coinvolti nella migrazione cellulare può essere la destinazione per gli effetti deleteri di arsenico e così può essere il meccanismo di rottura.

Protocol

1. preparazione di un armadio di sicurezza biologica II (BSC)

Nota: I metodi descritti in questo protocollo dovrebbero essere condotta con dispositivi di protezione individuale, durante l'utilizzo di buone pratiche di laboratorio per ottenere una tecnica asettica.

1. Sollevare il vetro di protezione BSC per altezza di funzionamento e girare su ventilatori a flusso laminare.
   1. Per eseguire un wipe di risanamento dell'area di lavoro, utilizzare 70% soluzione acquosa di isopropanolo. Pulire BSC dalla parete posteriore e pareti laterali e lavorare verso il basso per la piastra di base.
   2. Pulire tutti i materiali che verranno utilizzati nell'analisi con alcool al 70% (isopropanolo o EtOH) e inserirli all'interno di BSC.

2. umani fibroblasti cutanei semina in una boccetta di T75

1. Ottenere fiale con la linea di cella desiderata crioconservati (neonatale fibroblasti cutanei umani [hDFn], a concentrazione di cellule di 500.000 cellule/flaconcino e passaggio p3 – p5).
   1. Posizionare un flaconcino con cellule a profondità di 1,0 cm bagnomaria a 37 ° C per consentire lo scongelamento. Scongelare il flaconcino fino a circa il 70% di soluzione di cella è liquido. Strofinare il flaconcino con alcool al 70% e posizionare la cuvetta nel rack flacone all'interno di BSC.
      Nota: Assicurarsi acqua non venga a contatto con il thread o il tappo del flaconcino per evitare la potenziale contaminazione durante la semina cellulare. Evitare lo scongelamento completo delle cellule in acqua del bagno come non farlo potrebbe causare morte cellulare non intenzionale.
2. Tirare fuori 10 mL di media supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS). Utilizzare un pipettatore automatico e la punta della pipetta 10ml per aspirare in T75 matraccio di cultura del tessuto. Lasciare che supporti completamente per saturare la base del pallone da delicatamente a dondolo avanti e indietro il pallone.
   1. Fiala aperta con soluzione di cella stock e aspirare dalla fiala, memori del pipettaggio velocità, come le membrane cellulari saranno vulnerabile da crioconservazione.
   2. Trasferire le cellule in un pallone di tessuto T75 con i media. Espellere la cella scongelato nel pallone di tessuto, ancora memori del pipettaggio velocità.
      Nota: Semina la densità delle cellule nella beuta di tessuto è approssimata da 6.600 cellule/cm². Densità di semina può essere modificato per accogliere l'utente e l'intervallo di tempo desiderato di sperimentazione.
   3. Misurare 1 mL di media da boccetta tessuto T75 e trasferire il volume nuovamente dentro il flaconcino. Trasferire il volume dal flaconcino indietro nel pallone T75.
      Nota: Eseguire questo passaggio consente di massimizzare il rendimento delle celle dal flaconcino.
   4. Stringere il tappo del flacone di coltura del tessuto e scuotere delicatamente per disperdere uniformemente le cellule in sospensione su tutta la superficie. Controllo per la distribuzione uniforme delle celle utilizzando un microscopio invertito.
3. Boccetta di etichetta con il tipo di cella, data, iniziali, lignaggio e scopo (ad es., hDFn, 11/07/2018, NDC, Passage 4, arsenico Scratch test). Posto matraccio di cultura del tessuto in un incubatore a 37 ° C e 5,0% CO₂ per 72 h.
   Nota: Crescita medio dovrebbe essere cambiato 12-24 h dopo la semina iniziale per rimuovere tracce di solfossido dimetilico (DMSO) cryopreservative e poi cambiato ogni 48 h dopo che affinché le cellule siano adeguatamente nutrite. Il periodo di incubazione e crescita dipenderà il numero calcolato di cellule necessarie per il dosaggio di gratta e Vinci. Il tempo di raddoppiamento per hDFn cellule è in genere 16-24 h in condizioni normali. Tuttavia, raddoppiando tariffa può cambiare a causa di elevazione, pH, temperatura, umidità, tipo medio, ecc.e devono essere contabilizzato durante la pianificazione di esperimenti.

3. cellula contando e sottocultura nel tessuto 12-pozzetti cultura piastra

1. Recuperare il matraccio di cultura del tessuto T75 dall'incubatore. Osservare le cellule aderite utilizzando un microscopio invertito a ingrandimento obiettivo 10x (100 X totale ingrandimento) e determinare la confluenza di approssimativa delle cellule.
   1. Scansione, la maggior parte del matraccio di cultura del tessuto quando osservando la confluenza per garantire la percentuale più rappresentativa è approssimata. Valutare la morfologia delle cellule individuali per eventuali anomalie o per contaminazione batterica e/o fungine.
2. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 10ml. Utilizzare pipettatore per aspirare il volume completo di supporto dalla soluzione T75 e trasferimento da un contenitore per rifiuti. Impedire il puntale di contatto con la superficie aderente delle cellule. Gettare il puntale della pipetta in un bidone di biohazard.
   1. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 5ml. Aspirare 5 mL della soluzione salina bilanciata, dispensare nel pallone e scuotere delicatamente il pallone per sciacquare il terreno in eccesso, le cellule morte e prodotto di scarto.
   2. Disegnare il volume dalla T75 e versare nel contenitore per rifiuti. Scartare il puntale della pipetta nel contenitore di biohazard.
   3. Assemblare il pipettatore automatico con un adattatore di pipetta 5ml. Aspirare 2 mL di tripsina da stock, dispensare nel pallone e scuotere delicatamente il pallone per disperdere l'enzima sopra le cellule aderite. Garantire la completa saturazione della superficie aderente. Posizionare il pallone del tessuto nell'incubatore per 2-3 minuti (min).
      Nota: La reazione enzima-substrato massima non deve superare 10 min.
   4. Osservare il matraccio di tessuto sotto un microscopio invertito a un ingrandimento 10x lente dell'obiettivo (100 X totale ingrandimento). Applicare le vibrazioni dolce per facilitare il distacco delle cellule.
   5. Pulire il matraccio T75 con alcool al 70% e posto all'interno di BSC.
   6. Assemblare il pipettatore automatico con una punta di pipetta 5ml. Aspirare 5 mL di media dal tallone e aggiungere nel matraccio di tessuto T75 per arrestare la reazione enzima-substrato. Il rapporto di media: tripsina dovrebbe essere 3:1. Dispensare su e giù per la base del pallone di 2 - 3 volte per sciacquare e garantire che la reazione è stata interrotta. Aspirare l'intero volume di fluido dalla boccetta e trasferimento in una provetta conica sterile 15 mL.
   7. Riempire una seconda provetta conica da 15 mL con un volume identico di media.
   8. Collocare entrambi provette coniche da 15 mL in posizione antipodale ad uno altro. Applicare 200 g di forza centrifuga per 5 minuti a 25° C mediante l'impostazione parametri di funzionamento dell'apparecchiatura.
   9. Pulire il tubo conico da 15 mL con cellule pellettate con alcool al 70% e posto all'interno di BSC.
   10. Usare il pipettatore automatico con un accessorio di 5ml per dispensare i mezzi di comunicazione, lasciando dietro di sé circa 250 µ l di liquido e cellule di pellet. Prestare attenzione alla posizione della punta della pipetta, in quanto il pellet cellulare dovrebbe rimanere indisturbato. Erogazione del volume raccolto in un contenitore per rifiuti ed eliminare la punta in un bidone di biohazard.
   11. Utilizzare una cremagliera del tubo del microcentrifuge per eseguire il fondo della provetta conica attraverso le fessure del flaconcino, creando una vibrazione rapida, per disturbare e risospendere il pellet cellulare (a volte chiamato "rack rastrellando").
       Nota: Evitare di utilizzare un miscelatore vortex per eseguire questo passaggio. Le forze di gravità create da agitatori vortex superano le soglie di g-force di cella e possono causare lisi. Una volta completato correttamente, la nuova soluzione di cella apparirà come una miscela nuvolosa con nessuna pallina restante. Diligenza, eseguire questo passaggio creerà spesso una sospensione unicellulare, che conduce a una maggiore precisione quando si contano le cellule.
   12. Aggiungere 2 mL di media alla cellula stock o risospensione. Dispensare le cellule delicatamente lungo il lato del tubo 20 volte per rompere eventuali grumi. Registrare il volume di sospensione totale delle cellule e accantonato brevemente.
3. Pipettare 20 µ l di brodo di Trypan Blue (0,4%) in un pozzetto vuoto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta sterile.
   1. Miscelare la soluzione di riserva delle cellule per generare una sospensione cellulare uniforme prima del trasferimento. Utilizzare una punta di pipetta sterilizzata per rimuovere 20 µ l di cellula stock (evitando di toccare le pareti del tubo). Aggiungere i 20 µ l di soluzione di blu di Trypan della piastra a 96 pozzetti.
   2. Pipettare delicatamente per mescolare il contenuto. Pipettare 10 µ l della miscela tra il vetrino coprioggetto ed il conteggio della camera sull'emocitometro.
   3. Osservare le cellule e la griglia sotto un obiettivo 10x. Osservare nove grandi piazze all'interno del campo visivo. Contare le celle solo nel centro e 4 caselle d'angolo (totale di 5 quadrati).
      Nota: Guardare per una distribuzione uniforme delle cellule attraverso l'intera griglia per garantire un conteggio accurato.
   4. Tally tutte le cellule (trasparente e blue) in 5 piazze identificate della griglia. Separatamente, tally solo le cellule non vitali (blue) in 5 quadrati dello stesso.
   5. Calcolare cellule vitali conteggio utilizzando:
      dove x = numero di cellule vitali, un = cellule totali, b = cellule non vitali
   6. Calcolare la densità di cellule vitali utilizzando:
      dove x = densità di cellule vitali e y = somma totale delle cellule vitali.
   7. Calcolare totale cellule vitali:
      dove x = totale cellule vitali, y = densità di cellule vitali, f = volume (mL) di sospensione di cellule.
   8. Calcolare la vitalità cellulare %:
      dove x = percentuale di attuabilità, y = cellule vitali ha conteggiate sulla griglia, f = totale cellule contate sulla griglia.
4. Tracciare una linea orizzontale attraverso il fondo del piatto 12-pozzetti per servire come punti di riferimento durante la formazione immagine.
   1. Utilizzare la densità di cellule vitali (calcolata in 3.3.7) per calcolare il volume dei media per diluire cella stock in una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti di semina.
      Nota: La cella ottima densità per hDFn cellule di semina è 5.000 cellule/cm².
   2. Diluire la cellula stock a 19.000 cellule/mL utilizzando mezzi di comunicazione e ogni bene con 1 mL di cellula stock di semi. Mescolare il brodo di cella periodicamente per garantire anche cellula semina attraverso tutti i 12 pozzetti.
   3. Etichettare ogni piatto con il tipo di cella, il lignaggio, le iniziali dell'utente e lo scopo. Piastre di posto in incubatrice impostato a 37 ° C e 5,0% CO₂. Consentire alle cellule di crescere fino a 100% confluenza è raggiunto per l'analisi di gratta e Vinci.

4. arsenico (As) soluzioni di riserva e calcoli

1. Diluire arsenito del sodio (NaAsO₂) direttamente nel terreno di coltura delle cellule con 10% FBS alle concentrazioni di lavoro di 10, 1.0, 0,1 e 0,01 µM come.
2. Per questo, è necessario fare uno stock iniziale 1 mM come soluzione diluendo 3,9 mg di arsenito del sodio in 30 mL di media. In serie diluire lo stock di 1 mM per il restante come soluzioni.

1000 µM come Stock Calcoli	Lavoro d'archivio concentrazioni di arsenico	M1V1= M2V2	Volume della soluzione precedente di arsenico	Volume di Media	Volume totale di arsenico lavorando Stock
Peso molecolare di NaAsO2 : 129,9 g/mol	10 µM come	(x mL) (1.000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0,3 mL	0,3 mL = 300 µ l di 1mM come soluzione	Diluitore mL 29,7	30
.03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg di arsenico	1,0 µM come	(x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL	3 mL di 10 µM come soluzione	27 mL di media	30
Diluire 3,9 mg di arsenito del sodio in media 30 mL	0.1 µM come	(x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL	3 mL di 1 µM come	27 mL di media	30
	0.01 µM come	(x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL	3 mL di 0.1 µM come	27 mL di media	30

Tabella 1. Stock di arsenico e diluizioni seriali. Questa tabella spiega i calcoli utilizzati per creare le soluzioni stock As e soluzioni di riserva per i gruppi di trattamento di lavoro.

5. grattare la tecnica e la contaminazione da arsenico

1. Ottenere un piatto di 12 pozzetti con cellule dall'incubatrice. Mostra le cellule a un 10x di ingrandimento dell'obiettivo (100 X totale ingrandimento). Determinare la confluenza delle cellule all'interno di ciascun pozzetto.
   Nota: Ogni singolo bene deve raggiungere 100% confluenza prima di graffiare. Questo passaggio critico assicura la coerenza all'interno del dosaggio e aiuta a standardizzare i protocolli di analisi attraverso esperimenti. Se qualsiasi pozzi non hanno raggiunto la confluenza di 100%, permettono alle cellule di incubare per ulteriore tempo finché tutti i pozzetti hanno raggiunto la confluenza di 100%. Tempo di crescita supplementare in pozzi che hanno già raggiunto la confluenza di 100% non ne risentiranno. Cellule confluenti in genere diventerà crescita arrestato e rimangono come una coltura dello strato monomolecolare, consentendo nel contempo Sub-confluenti Pozzi raggiungere 100% confluenza.
2. Assemblare un pipettatore automatico con una punta di pipetta 10ml. Aspirare i media di crescita fuori tutti i pozzetti. Eliminare il volume di rifiuti liquidi e la punta della pipetta nella collocazione di rischi biologici.
   1. Assemblare un pipettatore p200 con punta sterile 1-200 µ l. In ciascun pozzetto, produrre un graffio "finto ferita" facendo scivolare la punta sulla superficie delle cellule da un-ore 12 a ore 6 posizione.
      Nota: Tre fattori che influenzeranno notevolmente la consistenza sono velocità, pressione e l'angolo di punta. Il graffio deve essere eseguito rapidamente, con una pressione costante, pur essendo consapevoli dell'angolo punta stare perpendicolare alla base del piatto. Graffiare troppo lentamente causerà righe storte, eccesso di pressione permanentemente può segnare superfici aderente delle cellule e un angolo di punta meno di 90° restringerà la larghezza gratta e Vinci. Uno di questi errori comuni può causare alterata migrazione tariffe e modelli.
   2. Sgombrare il campo da ciuffi di detriti e delle cellule in eccesso risciacquando con 1 mL di soluzione salina bilanciata per pozzetto. Il piastra lato a lato per facilitare il lavaggio della roccia. Rimuovere la soluzione salina bilanciata da pozzi e gettare in un contenitore per rifiuti. Smaltire la punta della pipetta 5ml nel bidone rischi biologici.

Figura 1: rappresentazione schematica del dosaggio zero. Tutto il lavoro è fatto all'interno di un campo asettico per diminuire la probabilità di contaminazione. Le cellule sono seminate ad una densità desiderata in recipienti di coltura del tessuto e coltivate in un incubatore impostato su condizioni fisiologiche umane (5% CO₂, 37 ° C). Dopo aver raggiunto una confluenza desiderata, le cellule sono asetticamente Sub-coltivate in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti ad una densità di semina desiderata. Le cellule sono coltivate alla confluenza del 100% in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti e graffiato utilizzando una punta di pipetta sterilizzata. Questo "zero" crea una in vitro finto ferita (contrassegnata da una freccia a due punte), in cui le cellule migrano naturalmente per chiudere lo spazio all'aperto. Ogni bene può essere univocamente condizionato e tassi di migrazione cellulare possono essere osservati e quantificati in risposta a diverse condizioni di trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Utilizzare una pipetta p1000 con una punta di 1.000 µ l per dispensare 1.000 µ l dalle scorte di arsenico in pozzetti, che sono stati assegnati in modo casuale con un gruppo di trattamento. Utilizzare un nuovo puntale per ciascun pozzetto per evitare la contaminazione incrociata. Registrare il tempo quando i trattamenti vengono aggiunti. Posto 12-pozzetti in un incubatore a 37 ° C e 5,0% CO₂.

6. imaging

1. Catturare immagini di ciascun pozzetto a 10x di ingrandimento obiettivo ogni 4 h per un periodo di 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h). La linea precedentemente disegnata sul fondo del piatto per la stessa ubicazione lungo il graffio all'interno di ciascun pozzetto a intervalli di tempo successivi immagine di riferimento.
   Nota: È fondamentale che le stesse posizioni sono fotografati in ogni momento per consentire analisi accurata delle immagini e di ottenere dati rappresentativi.

7. image Analysis

1. Caricare immagini acquisite con il microscopio ottico invertito a un computer e salvare come immagine JPEG con un nome di file dettagliato.
2. Aprire ImageJ.
3. Caricare un'immagine di un micrometro con distanze conosciute al software per convertire i pixel in millimetri (mm) quando si eseguono misure immagine trascinando e rilasciando il file nella finestra del software.
   Nota: Il micrometro dovrebbe avere linee che delimitano un noto 1 mm lunghezza e l'immagine deve essere presa allo stesso ingrandimento utilizzato per catturare le immagini delle cellule. Ad esempio, in questo studio di immagini sono state scattate a 100x ingrandimento totale, così l'immagine del micrometro è stata presa a 100 X ingrandimento totale.
   1. Fare clic sulle opzioni dritto, segmentatio Linee a mano libera .
   2. Disegnare una linea di distanza nota sull'immagine micrometro usando i segni di graduazione con una lunghezza associata a ogni tick marks. Per disegnare una linea retta: clic del mouse, tenere premuto, trascinare il cursore alla posizione desiderata, poi lasciar andare del mouse.
   3. Selezionare analizza quindi Imposta scala.
   4. Impostare La distanza di noto alla nota lunghezza della linea disegnata nel passaggio precedente.
   5. Impostare unità di lunghezza di mm.
   6. La casella globale.
   7. Selezionare OK per uscire dal menu.
   8. Chiudere fuori l'immagine di micrometro di fase.
4. Caricare uno scratch test immagine in ImageJ trascinando e eliminazione file di immagine nella finestra.
   1. Disegnare una linea retta su tutta la larghezza dello scratch (dal bordo di attacco sinistro a destra leading edge).
   2. Premere la lettera M sulla tastiera per registrare la misura della linea retta disegnata. Una piccola finestra di risultati appariranno immediatamente dopo aver digitato la lettera M. Questo è dove sarà la misura della larghezza.
5. Ripetere il passaggio 7.4 un totale di 10 volte per ottenere 10 misurazioni lungo la lunghezza dello scratch.
   Nota: È importante generare i valori di larghezza più representational giù l'intera lunghezza del graffio. Assicurati di distanziare le misure di 10 larghezza altrettanto lungo la lunghezza del graffio dall'alto verso il basso.
6. Creare un file di foglio di calcolo di analisi gratta e Vinci per copiare e incollare le misurazioni.
   1. Copiare e incollare le misure di 10 larghezza dalla finestra risultati nella colonna appropriata in un file di foglio di calcolo (tabella 2).
      Nota: Quando le misure sono copiate dalla finestra dei risultati e incollate nel foglio di calcolo, ci sarà estranee colonne di valori; questi valori devono essere eliminati, conservando solo le misure di 10 larghezza.

10 misure di larghezza casuale	h 0	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Media di 10 misure

Tabella 2. Misure di larghezza crudo tabella formato. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per il crude misure ottenute.

7. Ripetere il passaggio precedente per il resto delle immagini scratch test.
8. Calcolare la media di 10 misure in ogni punto del tempo (0-24 h) per ogni pozzetto.
9. Determinare per cento chiusura calcoli utilizzando i valori dal passaggio 7,8.
   1. Creare una tabella a parte inferiore del foglio di lavoro dal titolo "Larghezza misura medie" (tabella 3).
   2. Copia e incolla in che la riga di Media di 10 misure calcolata passo 7,8 nella tabella "misura larghezza medie".
   3. Creare un'altra tabella accanto alla tabella di Larghezza misura medie . Titolo questo tavolo Chiusura della ferita per cento (tabella 4).
      Nota: Il valore nella colonna h 0 per ciascun pozzetto deve essere 0 perché il graffio è 0% chiuso la foto iniziale h 0 per tutti i pozzetti.
   4. Passare alla colonna successiva sopra (4 h).
   5. Calcolare la percentuale chiusura per 4, 8, 12, 16, 20 e intervalli di tempo di 24 ore:
      
      dove x = percentuale di chiusura, io = larghezza zero iniziale (0 h larghezza), f = finale zero width (larghezza 4, 8, 12, 16, 20 o 24 h).

Beh larghezza medie	h 0	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1a
2a
3A
4a
1b
2B
3B
4B
1c
2c
3c
4c

Tabella 3. Misurazione della larghezza media di formato di tabella. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per le medie di misura larghezza calcolate utilizzando le misure di larghezza non definita nella tabella 2.

Bene	h 0	4 h	8 h	12 h	16 h	20 h	24 h
1a	0
2a	0
3A	0
4a	0
1b	0
2B	0
3B	0
4B	0
1c	0
2c	0
3c	0
4c	0

Tabella 4. Per cento della ferita formato di tabella di chiusura. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per i valori di chiusura della ferita delle percentuali calcolate utilizzando la misura della larghezza medie in tabella 3.

10. Creare un'altra tabella accanto alla tabella di Chiusura della ferita per cento . Titolo questo tavolo AUC (tabella 5).
    1. Calcolare il 0-4 h area sotto il valore di curva (AUC) in 0-4 h colonna per ciascun pozzetto:
       
       dove x = 0-4 h valore AUC, a = valore di chiusura % per h 0, b = valore di chiusura % per 4 h, h = il tempo tra le due misure (4 h in questo studio).
    2. Calcolare l'area di 4-8 h sotto il valore di curva (AUC) nella colonna 4-8 h per ciascun pozzetto:
       
       Dove x = 4-8 h AUC valore, un = valore di chiusura % per 4 h, b = valore di chiusura % per 8 h, h = il tempo tra le due misure (4 h in questo studio).
       Nota: Una AUC valore deve essere calcolato per ogni intervallo di tempo di 4 ore durante il periodo di 24 ore per ciascun pozzetto.
    3. Sommare tutti i valori AUC da 0-24 h (calcolato in passaggi 7.10.1-7.10.2) per ottenere un valore AUC sommato per ciascun pozzetto. Garantire che questi valori vengono salvati correttamente per l'analisi statistica.

Bene	0-4 h	4-8 h	8-12 h	12-16 h	16-20 h	20-24 h	Sommati AUC
1a
2a
3A
4a
1b
2B
3B
4B
1c
2c
3c
4c

Tabella 5. Formato di tabella AUC. Questa tabella mostra la struttura organizzativa per i valori AUC calcolate utilizzando la percentuale di ferita valori di chiusura nella tabella 4.

8. elaborazione statistica

1. Determinare il metodo di analisi statistica che meglio si adatta il disegno sperimentale e il valori AUC sommati ottenuti durante il dosaggio.

Results

Dimensioni del campione (n) per tutti i gruppi di trattamento era n = 28. Cellule sono state coltivate con successo seguenti tecniche asettiche e protocolli del laboratorio (Figura 1). Uniforme graffi sono stati osservati in tutti i gruppi di trattamento con la larghezza media di gratta e Vinci misura 0,8 mm 0,4 mm (Figura 2). Gruppi di controllo avevano un'area sommata media sotto il valore di curva di 1,355.83; 0.01 µM come gruppi di trattamento ha avuto una media ha riassunto la zona sotto il valore di curva di 1,366.21; 0.1 µM come gruppi di trattamento ha avuto una media sommati area sotto il valore di curva di 1,326.24, 1,0 µM come gruppo di trattamento ha avuto una media ha riassunto la zona sotto il valore di curva di 1,295.10; e infine il 10 µM come gruppo di trattamento ha avuto una superficie media di sommati sotto il valore di curva di 535.12, che era statisticamente più basso rispetto a tutti gli altri gruppi (p < 0,05) (Figura 3). R-programma per l'analisi statistica è stato utilizzato per eseguire un one-way ANOVA con una regolazione di post hoc di Tukey per determinare le differenze statistiche tra i gruppi di trattamento (p < 0,05).

Figura 2: rappresentanza zero immagini di analisi su un periodo di 20 h. Immagini A-D rappresenta migrazione cellulare delle cellule di controllo; Immagini E-H rappresenta migrazione cellulare delle cellule contaminate con 1,0 µM come; immagini L rappresenta migrazione cellulare delle cellule contaminate con 10 µM come. Da queste immagini, è chiaro che la migrazione cellulare è rallentato in presenza di arsenico. Le immagini di controllo mostrano un graffio "guarito" completamente dopo 20 h, mentre gli altri due gruppi come trattamento non sono state "guariti". I 10 µM come trattamento inibita la chiusura completa complessivamente dopo 24 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: arsenico rallenta la migrazione cellulare nel dosaggio zero. Immagini sono state catturate su un periodo di 24 h per osservare i cambiamenti a tassi di migrazione cellulare in presenza di diverse concentrazioni di arsenico. Immagini RAW sono state analizzate utilizzando un software automatizzato (ad esempio, in MATLAB), quali larghezza della ferita inizialmente misurato, quindi calcolata percentuale chiusura e, infine, area sotto la curva (AUC). Barre di errore rappresentano errore standard della media. I 10 µM come gruppo di trattamento ha rallentato statisticamente migrazione cellulare dei fibroblasti cutanei umani neonatali (hDFn), indicato da un valore AUC statisticamente inferiore, rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento con un one-way ANOVA con una regolazione di post hoc di Tukey (p < 0.05). Le differenze statistiche sono rappresentate dalle lettere "A" e "B", che sono stati ottenuti attraverso l'utilizzo del metodo di visualizzazione compatta lettera disponibile nel programma di R. Trattamenti che non condividono una comune lettera sono statisticamente significativi, da altro (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Applicazione di questo test fornisce una valutazione di alto-rendimento e tempestiva della migrazione cellulare e può tradurre direttamente a complessi sistemi fisiologici^5,6,7. Per questo motivo, il modello proposto di banco ha sintonizzato e praticato per valutare gli effetti di vari agenti terapeutici e le tossine ambientali su⁶di cicatrizzazione. Le concentrazioni di arsenico utilizzato in questo studio sono stati ritenuti rilevanti per l'ambiente attraverso la vasta ricerca di letteratura dei livelli di esposizione conosciuta e da una revisione retrospettiva dei dati vari basi^{14,15, 16,17,18,19,20,21}. Uso di questo test di gratta e Vinci in vitro hanno dimostrato che l'esposizione a una concentrazione di arsenico all'interno l'alta, ma rilevanti per l'ambiente gamma, ritardo nella chiusura della ferita (migrazione cellulare).

Questo banco top model fu anche impiegato per isolare e studiare una linea singola cella (fibroblasti) per capire meglio come la migrazione dei fibroblasti contribuisce per ferire i risultati di guarigione. Inoltre, è difficile studiare le funzioni di una linea singola cella in sistemi complessi in vivo con molte altre cellule e tessuti presenti che possono interferire con l'analisi. Inoltre, il dosaggio fornisce il mezzo per raggiungere i dati di chiusura semi-quantitativa percentuale ferita che possono essere utilizzati per indirizzare specifici meccanismi cellulari attraverso i quali composti possono influenzare la guarigione della ferita. Ad esempio, celle utilizzate nell'analisi della memoria virtuale possono essere raccolti e memorizzate in un reagente desiderato e utilizzate nell'espressione genica (segnale mRNA) o l'espressione della proteina saggi²². Queste informazioni possono essere utili per lo sperimentatore, se cercano di capire ciò che segnali o proteine possono essere in gran parte contribuendo ai cambiamenti nella migrazione cellulare in presenza di diversi trattamenti (cioè, arsenico)²².

Fibroblasti cutanei neonatali umani sono stati selezionati per questo lavoro basato sul loro ruolo nella guarigione delle ferite. Tuttavia, questo protocollo di analisi gratta e Vinci è stato implementato utilizzando vari tipi di cellule e per una gamma di scopi di ricerca. Ad esempio, il dosaggio di gratta e Vinci è stato adottato nel campo dell'oncologia per studiare l'inibizione di migrazione di chemioterapia farmaci²³; per la migrazione delle cellule del muscolo scheletrico, la proliferazione e diffusione²⁴; per studiare l'effetto degli estratti della pianta sulla migrazione cellulare²⁵; e per comprendere come la proliferazione e la migrazione dei cheratinociti contribuiscono alla ferita guarigione⁹. Inoltre, una carta precedente da Pinto et al valutato gli effetti dell'uranio (U) e plasma ricco di piastrine (PRP) sulla migrazione di hDFn utilizzando il dosaggio zero⁶. Lo scopo di questo lavoro era di capire l'entità a cui questo test potrebbe testare l'effetto di un agente pensato per rallentare la migrazione cellulare (U), come pure un agente pensato per accelerare la migrazione cellulare (PRP). Come si può vedere nel suddetto lavoro e ricerca da altri ricercatori, applicazione del dosaggio zero ha alto potenziale per l'uso in vari modelli sperimentali²⁶. Nonostante il dettaglio fornito all'interno dei metodi, varianza dovrebbe essere previsto tra gli investigatori e gli esperimenti. Ad esempio, tassi di migrazione cellulare probabilmente varierà basato sulla linea cellulare in uso, oltre i micronutrienti necessari necessari per i tipi di cella univoci. Molte delle osservazioni importanti per aiutare nella vitalità e rendimento delle celle sono elencati come Note in tutto questo protocollo. Tuttavia, si raccomanda vivamente che gli investigatori seguano le raccomandazioni del produttore per condizioni di crescita ottimali e di utilizzare questo metodo come istruzioni supplementari per il lavoro di cultura generale delle cellule.

Anche se il dosaggio zero è estremamente versatile per lo studio dell'attività cellulare; polarizzazioni impreviste possono sorgere in tecniche di misurazione. Ad esempio, quando si utilizza ImageJ per tracciare manualmente fronti di migrazione cellulare, variazione potrebbe esistere tra gli utenti, che possono limitare l'accuratezza e la raccolta di dati rappresentativi. Si deve anche osservare che fronti di migrazione devono essere letta in cieco per il trattamento di minimizzare utente bias. Inoltre, identificare manualmente fronti di migrazione potrebbe causare errore di calcolo della media distanza ha viaggiato a causa della formazione di pseudopodio di cellule e la loro capacità di raggiungere adesioni focali di forma, che possono essere visivamente fuorviante. In modo simile, l'uso di fluorescente "Tracking cellulare" tinture sulla superficie delle cellule o proteine nucleari per rilevare migrazione involontariamente possono fissare le cellule con conseguente inesattezze quando si misura la migrazione cellulare nel corso del tempo. È consigliabile che opportuni controlli positivi o negativi essere iscritti entro l'esperimento per completamente valutare l'effetto del trattamento sulle linee cellulari. Pratica di questo test deve essere completato in riconoscimento dei suoi limiti. Questo test non garantisce che risultati di migrazione cellulare ottenuti dalla sperimentazione in vitro si tradurranno direttamente in vivo i risultati. Migrazione di cellulari e guarigione della ferita in un sistema vivente complesso coinvolge una moltitudine di tipi di cellule e segnali molecolari; ognuno dei quali ha il potenziale per influenzare le risposte di guarigione.

In sintesi, l'analisi di gratta e Vinci è stato trovato per fornire screening ad alta resa di migrazione cellulare in risposta alle mutevoli ambienti^6,25. In particolare abbiamo utilizzato questo protocollo per rilevare correttamente le modifiche nella migrazione cellulare a seguito di esposizione all'arsenico alle varie dosi rilevanti per l'ambiente. Questi dati hanno fornito la giustificazione per utilizzare l'analisi di gratta e Vinci per ulteriore studio e valutare le vie meccanicistiche della migrazione cellulare in questo test e come queste vie sono alterate da esposizione all'arsenico.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cabina di sicurezza biologica di classe II A/B3	Forma Scientific	15201-816
Guanti in nitrile	Kimberly-Clark	55082
Bagno d'acqua	Modello di precisione	182
Microscopio invertito	Leica	Q080318
CPR Centrifuga	Beckman	349702
Bilancia analitica	Ohaus	I093 1125062111P
Carta di ponderazione	VWR	H351125781212A
Sacchetti per rischi biologici	Fisherbran	01-830A
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	309739-31053
Soluzione salina bilanciata Hanks	Gibco	14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10566-016
Siero fetale bovino	Gibco	26140-079
Pipettatore automatico	Drummond	140685
p200 Pipetta	Gilson
p20 Pipetta	Gilson
Denominatore	Fisher Scientific	D59707
Trypan Blue Stain	Gibco	15250-061
Pallone per fazzoletti T75	Corning	430725U
Provetta conica da 15 mL	Fisherbrand	05-539-5
Provetta conica da 50 mL	VWR	21008-178
Pipetta da 5 mL	Fisherbrand	13-678-11D
Pipetta da 10 mL	Fisherbrand	13-678-11E
Marcatore tissutale	Securline	92167
Salviette	Kintech	34155
70% Etanolo	Fisher	63-67-0
Punte per pipette senza filtro	Fisherbrand	16160210
Candeggina	Ottimo rapporto qualità-prezzo	220-04
96 pozzetti	Falcon	353915
Cryovial Rack	Nalgene	5030-0505
Alimentazione per ematocitometro	Gizmo	B00SCOGY56
TrypLE Express	Gibco	12605-028
Rack per provette coniche	n/a	n/a
12 pozzetti	Corning	3598
Bicchiere per rifiuti	n/a	n/a
Pipetta da 1 mL	Fisherbrand	13-678-11B
Righello a bordo dritto	n/ a	n/a
Fibroblasti dermici neonatali umani (hDFn)	lotto: 1734, 2902	106-05n
Rstudio Statistical Software		ver: 3.5.1
Immagine J	NIH	ver: 1.8.0_112