Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Abstract

Lipidici forniscono un'unica piattaforma sperimentale per studi funzionali dei canali ionici, che consente l'esame delle interazioni di canale-membrana sotto membrana varie composizioni lipidiche. Tra loro, il bilayer interfaccia gocciolina ha guadagnato popolarità; Tuttavia, la dimensione grande membrana ostacola la registrazione del rumore di fondo elettrico basso. Abbiamo stabilito un metodo di contatto bolla doppio strato (CBB) che combina i vantaggi del doppio strato lipidico planare e metodi di patch-clamp, ad esempio la possibilità di variare la composizione lipidica e di manipolare la meccanica a doppio strato, rispettivamente. Utilizzando il programma di installazione per esperimenti di patch-clamp convenzionali, esperimenti basati su gancio di traino possono essere eseguiti facilmente. In breve, una soluzione elettrolitica in una pipetta di vetro è soffiata in una fase di solvente organica (esadecano), e la pressione di pipetta viene mantenuta per ottenere una dimensione di bolla stabile. La bolla spontaneamente è fiancheggiata da un monostrato lipidico (lipidi puri o misto di lipidi), che è fornito da liposomi nelle bolle. Successivamente, le due monostrato-foderato bolle (~ 50 µm di diametro) sulla punta delle pipette di vetro vengono ancorate per formazione di doppio strato. Introduzione di liposomi ricostituiti canale nella bolla conduce all'incorporazione di canali in doppio strato, consentendo per la registrazione corrente di singolo canale con un rapporto segnale-rumore paragonabile a quella delle registrazioni di patch-clamp. CBB con una composizione asimmetrica del lipido sono prontamente formate. Il gancio di traino è rinnovato ripetutamente che soffia le bolle precedenti e formando nuovi. Varie perturbazioni fisiche e chimiche (ad es., aspersione di membrana e doppio strato tensione) possono essere imposto il CBB. qui, vi presentiamo la procedura di base per la formazione di CBB.

Introduction

Per i canali ionici, la membrana cellulare non è semplicemente un materiale di supporto, ma un partner per generare il flusso di ioni. Funzionalmente, la membrana è un isolante elettrico in cui ioni canali vengono incorporati, e tutte le membrane cellulari sono impartite con un potenziale di membrana di riposo. Convenzionalmente, un potenziale di membrana arbitrario è stato imposto da un circuito esterno mediante il quale è stata misurata la corrente elettrica attraverso i canali. Questa valutazione quantitativa del flusso ionico a potenziali di membrana differenti hanno rivelato le proprietà molecolari di questi canali, come loro permeazione iono-selettivi e gating f....

Protocol

1. preparare liposomi

1. Disperdere i fosfolipidi (ad esempio, 10 mg in polvere) in cloroformio a una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mg/mL).
2. Evaporare il cloroformio.
   1. Posto la soluzione del fosfolipide in un pallone e impostare su un evaporatore rotante (Vedi Tabella materiali) collegato a una bombola del gas₂ N. Ruotare il pallone sotto flusso di₂ N a temperatura ambiente fino a quando appare una pellicola sottile del fosfolipide (dopo circa 30 min).
   2. Luogo apra la boccetta in un essiccatore che è collegato a una pompa a vuoto. Usando la pompa del vuoto, aspirare al....

Results

Un tipico CBB aveva un diametro di 50 µm (Figura 56) e la capacità di membrana specifici in esadecano era 0,65 µF/cm². La dimensione della bolla è stato arbitrariamente controllata dalla pressione intra-bolla. Quando piccole bolle sono necessari per le registrazioni di basso rumore, il diametro della punta deve essere corrispondentemente piccolo. Ad esempio, per una dimensione di bolla di 50 µm di diametro, il diametro della punta .......

Discussion

Il metodo CBB di formazione bilayer del lipido è basato sul principio di una gocciolina di acqua in olio allineata da un monostrato²⁰. Tecnicamente, le procedure per la formazione di CBB sono facili, soprattutto per i ricercatori di patch-clamp, che sono esperti nella manipolazione delle micropipette di vetro. L'installazione elettrofisiologica per il morsetto di toppa prontamente viene utilizzato il gancio di traino quando due manipolatori di pipetta con microinjectors sono disponibili. D'altra p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azolectina (L-&alfa;-Fosfatidilcolina, Tipo IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
Convertitore A/D	Dispositivi molecolari	Digidata1550A
Ag/AgCl Elettrodo	Warner Instruments	64-1317
Bagno Sonicatore	Branson	M1800H-J
Fotocamera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Apparecchio capillare in vetro	Harvard	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Foro Slideglass	Matsunami Microscopio	in vetro S339929
Tavolo di	Olympus	IX73
Herz		TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipolatore	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
			per Micropipette
n-Esadecano	Nacalai	07819-32
Amplificatore Patch-Clamp	HEKA	EPC800
Estrattore per pipette	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoil-2-oleyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Cloruro di potassio	Nacalai	28514-75
Evapolatore rotativo	Iwaki	REN-1000
Acido succinico	Nacalai	32402-05
Pompa a vuoto	Buchi	V-100