Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

Summary

Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.

Abstract

Le cellule T utilizzano programmi metabolici differenti per soddisfare le loro esigenze funzionale durante il differenziamento e la proliferazione. I mitocondri sono componenti cruciali cellulare responsabile della fornitura di energia delle cellule; Tuttavia, i mitocondri in eccesso producono anche le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che potrebbero causare la morte delle cellule. Di conseguenza, il numero dei mitocondri costantemente deve essere regolato per soddisfare le esigenze delle cellule. Questa regolazione dinamica avviene in parte attraverso la funzione dei lisosomi che rimuovere macromolecole e organelli avanzo/danneggiato. Quindi, il contenuto cellulare di lisosomiale e mitocondriale è indicatori chiave per valutare la regolazione metabolica delle cellule. Con lo sviluppo di sonde per organelli, lisosoma ben caratterizzato o mitocondri specifici coloranti sono diventati disponibili in vari formati per etichettare i mitocondri e lisosomi cellulari. Citometria a flusso multicolor è uno strumento comune per fenotipi cellulari di profilo e ha la capacità di essere integrato con altri dosaggi. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato di come combinare organello specifici coloranti con marcatori di superficie macchiatura per misurare la quantità dei lisosomi e dei mitocondri in popolazioni differenti delle cellule T su un citometro a flusso.

Introduction

L'attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell'attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l'induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l'enorme richiesta metabolica dur....

Protocol

La procedura di raccolta del tessuto del mouse qui descritta è stata approvata dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della National Yang-Ming University.

1. preparazione della sospensione del linfocita da organi linfoidi

1. Eutanasia il mouse da un metodo approvato come l'inalazione di CO₂ in un alloggiamento acrilico trasparente seguito da dislocazione cervicale per assicurare la morte.
   Nota: Mantenere il tasso di flusso di CO₂ per uno spostamento di 20% al minuto della camera e non superiore a 5 psi (libbra per pollice quadrato). Ci vogliono 2-3 minuti per un mouse a perdere coscienza. Mante....

Results

Identificazione dei sottoinsiemi principali delle cellule di T in milza e timo

In breve, sospensioni di cellule singole da milza e timo sono state lisate di cellule rosse del sangue, incubate con 2.4G2 surnatante, seguite da colorante specifico organello e marcatore di superficie macchiando con gli anticorpi coniugati a fluorescenza (tabella 1). La progressione dello sviluppo dei timociti può es.......

Discussion

Questo protocollo combina organello specifici coloranti e marcatore di superficie macchiatura per quantificare la quantità di mitocondri o lisosomi in popolazioni differenti delle cellule T. Questo metodo è stato sviluppato per superare le limitazioni dei requisiti di numero e omogeneità di cella per i metodi tradizionali, come la microscopia elettronica e l'analisi di immunoblot. È particolarmente utile nell'analisi di popolazioni di cellule rare ed esaminare contemporaneamente più tipi di cellule allo stesso tempo.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinza Graefe da 10 cm (dritta e seghettata)	Forbici per iride Dimeda
da 11 cm (diritta con teste affilate/affilate)	Dimeda
Provetta da centrifuga da 15 ml	Thermo Fisher Scientific	339650
Siringa da 5 ml	TERUMO
Piastra di Petri da 6 cm	α-plus
70 µ m filtro cellulare	in nylon SPL Lifesciences	93070
Cloruro di ammonio (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-topo CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-topo CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-topo CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
		6381-92-6
FALCON 5ml Polistirene Tubo a fondo tondo (tubo FACS)	BD Biosciences	352052
Siero fetale bovino (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Acido idrossietilpiperazineetansolfonico (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutammina (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Aminoacidi non essenziali (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
Bicarbonato di potassio (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Soluzione di ioduro di propidio	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (polvere)	Gibco	31800089
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma	S5761
Piruvato di sodio (100 mM)	Gibco	11360070